方法

方法
【专利摘要】在此披露了Akt3作为一种生物标志物用于检测一位受试者中上皮细胞向间质细胞转化(EMT)的发生的用途以及Akt3抑制剂用以治疗癌症的用途。还披露了用于通过测量Akt3表达和/或活性来检测一位受试者中上皮细胞向间质细胞转化(EMT)的发生的不同方法。
【专利说明】方法 发明领域
[0001] 本发明涉及药物研发和癌症治疗的领域。具体而言，本发明涉及蛋白质激酶的领 域，并且更具体而言涉及对癌症的预后和治疗的方法。
[0002] 发明背景
[0003] Akt
[0004] Akt (蛋白激酶B)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，已知其涉及于不同的细胞过程 中，包括增殖、运动、生长、葡萄糖稳态、生存和细胞死亡。Akt是PI3K/Akt通路的H个主要 组分（磯脂醜肌醇3-激酶，其枯抗剂PTEN和Akt)之一。在该通路中的组分的突变属于癌 症中最频繁观察到的突变，并且发现于高达70%的乳癌中。在人类中，有H个Akt家族成 员，Akt UAkt 2和Akt3,它们是从不同的基因转录。关于Akt的多数研究公开物提及Aktl 或Akt而没有特别说明哪个家族成员，导致在家族成员之间不加区分的泛-Akt抗体的广泛 使用。H种亚型中，关于Akt3已知最少。事实上，最近的综述文章"在乳腺发育和癌症中的 关键信号传导节点，在乳腺上皮细胞中PI3激酶的信号传导下游：在3个Akt中的作用化ey signalling nodes in mammary gland development and cancer. Signalling downstream of PI3 kinase in mammary epithelium:a play in 3 Akts)'，（威肯登（Wickenden) JA 和 沃森（Watson)CJ，《乳癌研究〉〉（Breast Cancer Research) 2010,12,202)中，Akt3 提及仅S 次：一次用W确立其存在，一次用W指出它显现具有在正常乳腺发育中的小作用，并且一次 用W指出它在怀孕和哺乳期间不影响StatSa磯酸化。
[000引对于AktU Akt2和Akt3在正常发育中的作用已经在基因敲除小鼠中进行了研 究，掲露了 Aktl对于整体生长是重要的（基因敲除小鼠大体上是健康的，但具有降低的生 长），Akt2主要涉及葡萄糖代谢（基因敲除小鼠正常生长但显示具有膜岛素耐受性），并 且Akt3在脑发育中是重要的（参见，例如达姆勒值ummler)B，亨明斯化emmings)BA，P邸/ Akt亚型在发育与疾病中的生理作用（Physiological roles of P邸/Akt isoforms in development and disease).《生物化学学会学报KBiochem Soc Trans) 2007 :35:231-巧。 Aktl和Akt2的更普遍作用由它们遍及全身的广泛表达表明，而Akt3在脑、肾和也脏中具有 更受限制的表达。
[0006] Akt被视为一种用于癌症治疗的受关注祀标，并且Akt抑制单独地或与标准的癌 症化疗剂组合已经被假定为可W降低细胞调亡阔值并优先杀死癌细胞（林黎（Lindley) CW，《医药化学当前论题》（化rr Top Med化em)，10,458, 2010)。最近的综述意图抑制作为 癌症中最常见的突变家族成员的Akt成员关键点Akt2,并且表明Aktl和Akt2的抑制将是 最优的（梅特曼（Mattmann)ME等人"用小分子和生物巧惊U抑制Akt;专利格局的历史性观 点和当前状态（Inhibition of Akt with small molecules and biologies !historical perspective and current status of the patent landscape)'，，《关于医疗专利的专家观 点》巧Xpert Opinion on Hierapeutic Patents) ,21，1309,2011)。与其他激酶相比，在此 综述中覆盖的许多化合物对Akt具有弱的选择性并且总体上聚焦于Akt 1。在此综述中评论 的在不同家族成员之间具有选择性的化合物占优势地抑制Aktl和/或Akt2而不是Akt3。
[0007] 尽管在该文献中占优势地聚焦于Aktl，Akt3过表达已经与若干癌症相关，包括黑 色素瘤（《癌症研究HCancer Res. )200410月1 ;64 (19) :7002-10)和卵巢癌（《癌症发现》 (Cancer Discov. )20121 月 1;2 (1):56-67)。
[000引若干专利公开物涉及Akts的用途。
[0009] WO 2010/091354化李莫法特癌症研究公司化Lee Moffat Cancer Institute, Inc.))涉及在一位受试者中诊断癌症的方法，该方法涉及对酪氨酸176-磯酸 化的AKTl而非AKT3的表达水平进行确定。
[0010] US 20120040842(贝克炬aker)，等人）在一个大量基因阵列中列出了 Akt3,该些 基因可W被评估来确定结直肠癌的预后。然而，Akt3未被选作一个优选标志物。
[0011] US 20120028264(沙吉（Shaq)等人）在一个大量基因阵列中列出了 Akt3(表3A)， 该些基因的表达水平可W在评估一位受试者中的前列腺癌的可能性中来确定。Akt3的显著 性未被确切提及。
[0012] US 20120021983(西西里斯（Tsichlis)等人）涉及通过评估受试者的Akt亚型谱 尤其是Aktl和Akt2的比例，通过将该谱与正常的Akt亚型谱进行比较而对潜在癌症和已 存在癌症的进展进行诊断或预后的方法。
[0013] US 20120003209(翻译基因组学研究院（The Translational Genomics Research Insti化te))涉及用于基于Aktl和Akt2的表达水平鉴别侵入性恶性胶质瘤的方法和 试剂盒。发现Akt3mRNA表达在非肿瘤性脑标本中是高的而在神经胶质肿瘤中是降低的 [[0130]]。并且发现Akt3表达在长期存活患者中是显著更高的。
[0014] US 8133684(埃伯索尔德（Aebersold)等人）披露了确定前列腺细胞中的雄激素 反应，在长串可能的前列腺癌生物标志物清单中提及Akt3。
[0015] 上皮细胞-间质细胞转化（EMT)
[0016] 上皮细胞组织构成身体的四个基底组织类型之一，其余的是结缔组织、肌肉和神 经组织。上皮细胞特征在于形成极化细胞层的趋向连同强的细胞间连接。因此，与其他细 胞类型相比，上皮细胞不能自由移动并且显示很少的迁移。相比之下，间质细胞样细胞（例 女口，成纤维细胞）缺乏强的细胞间连接，并且可W作为单独的细胞移动。它们可W是高度能 动的，并且能够迁移通过细胞外基质。
[0017] 上皮细胞-间质细胞转化（EMT)是一种天然细胞程序，其中个别上皮细胞失去上 皮细胞的基因表达模式和行为特征，而取而代之开始看起来为、行动为典型间质细胞并且 表达为间质细胞的典型基因。在此过程中它们失去粘附性和顶端-基底极性，并且获得迁 移并侵入细胞外基质的能力。EMT不是不可逆的。称为间质细胞-上皮细胞转化（MET)的 错误过程导致间质细胞特征的丢失W及细胞-细胞粘附和顶端-基底极性的重新建立。
[0018] EMT在胚胎发育过程中尤其重要。它在原肠胚形成中发挥着至关重要的作用，在原 肠胚形成中由单一上皮细胞层组成的胚胎发育成具有H层经典胚层即外胚层、中胚层和内 胚层。在脊椎动物发育中略微晚期中，EMT产生神经晴细胞。该些细胞迁移通过胚，并且产 生许多不同的结构，包括周围神经系统的神经节、骨W及脸和头的软骨、色素细胞W及神经 胶质细胞。另外多轮MET和EMT对于从中胚层和内胚层形成内部器官来说是必不可少的。 [001引 EMT与疾病
[0020] 相比于它在胚胎发育期间的重要性，EMT程序在健康成人中是很少激活的。然而， 在对损伤或疾病导致的炎症的反应中它被诱导：EMT在伤口愈合和组织修复中发挥作用， 并且在器官退行性疾病（例如肾纤维化）期间发生。
[002。 另外EMT日趋被理解为在癌症转移中发挥着关键作用。癌（Carcinomas)是上皮 细胞癌症，并且为了使转移发生，个别细胞必须逃离原发性肿瘤并且经历一系列迁移。该些 包括从原发性肿瘤迁移至局部循环或淋己系统中，W及从脉管系统外渗并且在转移部位处 建立。现在存在好的和越来越多的证据证实在肿瘤细胞与它们的微环境之间的相互作用可 W导致在一些肿瘤细胞中EMT的诱导。所得到的增加的细胞迁移和该些细胞的侵入潜力进 而增强了使转移得W建立的可能性。受体酪氨酸激酶Axl,是一种慢性骨髓性白血病关联的 癌基因，近来已显示是侵入-转移级联中的关键EMT诱导效应子（WO 2010/103388)。
[0022] 连同增加转移潜力的作用，EMT程序近来已经与癌症干细胞（CSC)相关。该些细 胞已经被假定为代表具有干细胞特征的肿瘤细胞的一个子集，该些特征即产生所有的发现 于具体癌症中的细胞类型的能力W及由此形成新肿瘤的能力。虽然CSC可W仅代表肿瘤中 的很小一部分细胞，它们被认为对存在的抗癌药具有特定耐受性。即使药物治疗可W杀死 肿瘤中的大多数细胞，但单个存活的CSC可W由此导致疾病的复发。近来证据表明在EMT 与CSC表型之间的重叠，表明了 EMT还可W在化疗之后的癌症复发和耐药性肿瘤的发展中 发挥作用。
[0023] EMT表型的稳固生物标志物可W用于鉴别处于发展转移性或耐药性癌症的特定风 险中的患者，而祀标于已经经历EMT的细胞的新颖药物将降低在常规治疗之后的转移和复 发。
[0024] EMT激活剂（例如，转录因子Slug)增加Aktl活性/表达。还已知的是Aktl激活 (例如，十四焼基化变体MyrAktl)诱导了 EMT激活剂（例如转录阻遏物，丝奈尔（Snail), 《癌基因》(Oncogene. )200711 月 22 ;26 (53) :7445-56.电子出版巧pub) 20076 月 1)，并且还 导致生物标志物从上皮细胞的转变为间质细胞的。
[00幼发明概述
[0026] 出乎意料地，现在已经发现Akt3在人类细胞中诱导EMT和癌症干细胞性状中发挥 着中也作用。具体而言，已经发现与对照细胞或表达组成型活性Aktl的细胞相比，组成型 活性的Akt3显著地增加细胞在体内形成肿瘤和乳腺球的能力。另外，Akt3的抑制能够逆 转EMT和CSC性状。
[0027] 鉴于在领域中聚焦于Aktl和Akt2,该是出乎意料的。
[0028] 已经发现Akt3是Axl受体酪氨酸激酶信号传导的生物标志物。更确切地，AktS已 经显示为是针对上皮细胞中Axl信号传导的生物标志物。还已经发现Akt3参与导致EMT 的维持的反馈回路中。AktS的另外的应用，例如癌症干细胞、转移的生物标志物，将从本披 露中变得清楚。
[0029] 根据本发明的一方面，提供了一种选择有用于预防、抑制或治疗Akt3相关病症的 药物化合物的方法，该方法包括提供一组候选药物化合物用于测试，在一个测试系统中测 试候选药物化合物对Akt3活性的作用，并且基于对Akt3活性的抑制选择一种候选药物化 合物。
[0030] 可替代地，本发明提供了一种选择有用于治疗转移性或耐药性癌症的候选药物化 合物的方法，该方法包括提供一组候选药物化合物用于测试，在一个测试系统中测试候选 药物化合物对Akt3活性的作用，并且基于其对Akt3活性的抑制选择一种候选药物化合物。
[0031] 根据另一方面，提供了一种选择有用于预防或抑制EMT的候选药物化合物的方 法，该方法包括提供一组候选药物化合物用于测试，在一个测试系统中测试候选药物化合 物对Akt3活性的作用，并且基于对Akt3活性的抑制选择一种候选药物化合物。
[0032] 高度有利的是能够在一个体外测试系统中确定候选药物化合物的有效水平，从而 预测体内反应。该有利于确定药物化合物的有效最低剂量水平，并且还有利于W剂量依 赖的方式验证药物祀标。用W预测对一种药物的体内反应的特别有用的途径是通过经由 RNA干扰对祀标基因的常规选择性敲除。用于此类方法中的核巧酸的有效产生描述于WO 2009/082488 中。
[0033] 根据本发明的另一方面，提供了一种选择有用于预防、抑制或治疗Akt3相关病症 的候选药物化合物的方法，该方法包括选择性地降低一种测试细胞中的Akt3的表达，使该 测试细胞接触该候选药物化合物，并且确定该候选药物化合物对Akt3活性抑制的作用。
[0034] 根据本发明的另一方面，提供了一种选择有用于预防、抑制或治疗Akt3相关病 症的化合物的方法，该方法包括选择性地将一种体外测试系统中Akt3的表达降低至一个 低水平，使该测试系统接触一种候选药物化合物，并且选择抑制Akt3活性的候选药物化合 物。
[00巧]根据本发明的另外一方面，提供了一种鉴别患有Akt3相关病症的受试者的方法， 该方法包括评估该受试者中或一个衍生自该受试者的样品中的Akt3的表达或活性水平。 总体上，可W相对于一个对照样品来确定在一位受试者中或一个衍生自受试者的样品中的 表达或活性的水平，如在此所述。
[0036] 根据本发明的另外一方面，提供了一种鉴别具有发展转移性或耐药性癌症的特定 风险的一位受试者的方法，该方法包括评估该受试者中或一个衍生自该受试者的样品中的 Akt3的表达或活性的水平，增加的Akt3表达或活性的水平指示该受试者发展转移性或耐 药性癌症的增加的风险。
[0037] 根据本发明的另外一方面，提供了一种鉴别一位受试者中癌症干细胞的存在的方 法，该方法包括确定该受试者中或一个衍生自该受试者的样品中的Akt3表达或活性的水 平，增加的Akt3的表达或活性指示癌症干细胞（CSC)的存在。
[0038] 根据本发明的另外一方面，提供了一种鉴别一位经历EMT的受试者的方法，该方 法包括确定该受试者中或一个衍生自该受试者的样品中的Akt3表达或活性的水平，AktS 的表达或活性的增加指示EMT的发生。
[0039] 根据本发明的另外一方面，提供了一种对受试者中的癌症相关结果进行预后的方 法，该方法包括评估该受试者中或一个衍生自该受试者的样品中的Akt3活性或表达。
[0040] 在一些实施例中，相对于一个对照样品，Akt3活性或表达的增加指示出对用一种 癌症治疗剂（例如，一种抑制或逆转EMT的胜任物）进行的治疗的敏感性。该药剂可W如 在此所述，例如Akt3抑制剂或Axl抑制剂。
[0041] 根据本发明的另外一方面，提供了一种鉴别Axl活性的方法，该方法包括确定该 受试者中或一个衍生自该受试者的样品中的Akt3表达或活性的水平，增加的Akt3活性或 表达与Axl活性相关。
[0042] 已经出乎意料地发现Akt3的表达或活性的水平与Akt2的表达或活性的水平呈反 相关。本发明的方法和用途包括对一位受试者中或一个衍生自该受试者的样品中的Akt2 的表达或活性的水平进行评估。降低的Akt2表达或活性的水平可W指示；（i)该受试者患 有一种Akt3相关病症；（ii)发展转移性或耐药性癌症的增加的风险；（iii) 一种癌症干细 胞的存在；和/或Qv化MT的发生。
[0043] 在一些实施例中，对Akt2和Akt3两者的表达或活性的水平进行评估。对两种反 相关的生物标志物进行评估可W增加测定的可靠性。
[0044] 在一些实施例中，Akt3的表达水平是通过相对于一个对照样品而言确定编码 Akt3的基因的拷贝数来进行评估，其中该拷贝数的增加指示增加的Akt3表达水平。拷贝 数（即基因重复事件）可W使用本领域中已知的标准技术来确定，例如使用DNA芯片，如在 江 Qiang)等人（江 Qiang) Q, Ho YY,郝化ao)L，尼克尔斯贝里奧斯（Nichols Berrios) C， 查克拉瓦蒂（化akravarti)A.在候选基因中拷贝数变体是希尔施普龙病的遗传修饰因子 (Copy number variants in candidate genes are genetic modi円ers of Hirschsprung disease). PLoS One. 2011 ;6 巧））中描述的。
[004引在一些实施例中，其中Akt3(或Ak。）的表达水平是通过确定Akt3(或Akt2)蛋 白质或mRNA的水平来评估的。用于确定蛋白质和mRNA表达水平的方法在本领域中是熟知 的，如在此所述。
[0046] 在一些实施例中，Akt3活性是通过确定Akt3的磯酸化来评估的，其中Akt3的磯 酸化指示活性Akt3。Akt3磯酸化可W被确定为在丝氨酸472处，如在此所述。可替代地或 另外地，磯酸化可W被确定为在苏氨酸305处和/或酪氨酸174处。该种编号是指Akt3序 列，相应的Aktl残基对应地是S473、T308和Y176。
[0047] 在不受理论限制的情况下，认为在苏氨酸305处的磯酸化在Akt3向细胞核的定位 中是重要的，会导致在酪氨酸174和丝氨酸472处的磯酸化W及Akt3的激活。在一些实施 例中，Akt3活性是通过确定Akt3蛋白质的细胞内定位来评估的，其中定位于细胞核中指示 活性Akl: 3。
[0048] 在一些实施例中，Akt3活性是通过确定下游祀标（例如，与EMT关联的基因）的 表达水平来评估的。在另外的实施例中，Akt3激酶活性可W通过确定底物蛋白质（例如， SNAIL)或肤的磯酸化来评估，例如如在图奧米（Tuomi)等人2009 (Sci Signal. 20096月 302(77))中所述。
[0049] 根据本发明的另一方面，提供了一种治疗一位患有Akt3相关病症的受试者的方 法，该方法包括使该受试者接触一种Akt3抑制剂或药物化合物，该Akt3抑制剂或药物化合 物被选择作为或衍生自一种通过根据本发明的第一方面所述的方法获得的候选化合物。
[0050] 本发明的另外方面包括一种抑制一位受试者中的EMT的方法，该方法包括使该受 试者接触一种能够抑制Akt3活性的化合物。
[0051] 本发明的另外方面提供了一种抑制一位受试者中的癌症干细胞的方法，该方法包 括使该受试者接触一种能够抑制Akt3活性的化合物。
[0052] 本发明还提供了一种预防或抑制一位患有癌症的受试者中的耐药性的方法，该方 法包括使该受试者接触一种能够抑制Akt3活性的化合物。
[0053] 本发明还提供了 Akt3抑制剂在治疗Akt3相关病症如癌症中的用途。
[0054] 本发明还提供了 Akt3抑制剂在EMT的抑制中的用途。
[0055] 本发明还提供了用于在如在此所述的治疗的方法中使用的Akt3抑制剂。
[0056] 根据本发明的另外一方面，提供了能够抑制Akt3活性的化合物在一位患有癌症 的受试者中预防、抑制或治疗耐药性中的用途，该方法包括使该受试者接触一种能够抑制 Akt3活性的化合物。
[0057] 根据本发明的方法鉴别的或者用于根据本发明的方法或用途中的Akt3抑制剂可 W用作一种单一疗法或与其他癌症治疗的组合疗法，如下所述。
[0058] 合适的化疗剂包括：
[0059] 焼化剂，包括焼基賴酸盐例如白消安；
[0060] 氮芥例如苯下酸氮芥、环磯醜胺、雌氮芥、异环磯醜胺、二氯甲基二己胺、美法仑、 W及乌拉莫司汀，己帰亚胺衍生物例如喔替派；
[0061] 亚硝基脈例如卡莫司汀、洛莫司汀、W及链佐星，H氮帰例如达卡己嗦、丙卡己脱、 W及替莫哇胺，W及
[0062] 笛化合物例如顺笛、卡笛、奧沙利笛、赛特笛、W及化笛奧纳笛（onnaplatin)、四笛 (tetraplatin)、螺笛（sprioplatin)、异丙笛、氯代（二亚己基二氨基）-笛（II)氯化物、 二氯（亚己基二氨基）-笛（II)、二氨基（2-己基丙二酸根）合笛（II)、（1，2-二氨基环己 焼）丙二酸根合笛（II)、（4-駿基駄）-(1,2-二氨基环己焼）合笛（II)、（1，2-二氨基环己 焼）-(异巧樣酸根）合笛（II)、W及（1，2-二氨基环己焼）-顺式-(丙丽酸根）合笛（II);
[0063] 抗代谢物，包括叶酸枯抗物例如甲氨噪岭、普美曲塞（permetrexed)、雷替曲塞、W 及H甲曲沙，
[0064] 嚼巧类似物例如阿扎胞巧、卡培他滨、阿糖胞巧、依达曲沙、氣尿巧、氣尿嚼巧、吉 西他滨、W及曲沙他滨，W及
[0065] 嘿岭类似物例如克拉屈滨、氯脱氧腺巧、克罗拉滨、氣达拉滨、琉基嘿岭、喷司他 下、W及硫鸟嘿岭；
[0066] 天然产物，包括抗肿瘤抗生素例如博来霉素、更生霉素、光辉霉素、丝裂霉素、米巧 意酿、泊非罗霉素、W及意环类，如道诺霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、W及戊柔比 星，
[0067] 有丝分裂抑制剂例如长春花生物碱长春花碱、文韦西尔（放线菌素）、长春新碱、 长春地辛、W及长春瑞滨，
[0068] 酶例如k天冬醜胺酶和阳GA-天冬醜胺酶，
[0069] 微管聚合物稳定剂例如紫杉焼紫杉醇和多西他赛，
[0070] 拓扑异构酶I抑制剂例如喜树碱伊立替康和拓扑替康，W及
[0071] 拓扑异构酶II抑制剂例如鬼白毒素、安吓巧、依巧泊巧、替尼泊巧、洛索意酿W及 放线菌素；
[0072] 激素和激素枯抗剂，包括雄激素例如氣甲睾丽和睾内醋，
[0073] 抗雄激素例如比卡鲁胺、环丙孕丽、氣他米特、W及尼鲁米特，
[0074] 皮质类固醇例如地塞米松和强的松，
[00巧]芳香酶抑制剂例如氨鲁米特、阿那曲哇、依西美坦、福美司坦、W及来曲哇，
[0076] 雌激素例如己帰雌酷，
[0077] 抗雌激素例如氣维司群、雷洛昔芬、它莫西芬、W及巧瑞米芬（toremifine)，
[0078] 促黄体激素释放激素（LHRH)激动剂和枯抗剂例如阿己瑞克、布舍瑞林、戈舍瑞 林、亮丙瑞林、组氨瑞林、德索瑞林（desorelin)、醋酸那法瑞林W及曲普瑞林，
[0079] 孕丽例如醋酸甲轻孕丽W及醋酸甲地孕丽，W及
[0080] 甲状腺激素例如左旋甲状腺素W及楓塞罗宁；
[0081] P邸通路抑制剂，包括脈立福辛、盐酸恩扎斯巧瑞（enzastaurin hy化ochloride)、 W及曲西立滨，
[0082] P13K抑制剂例如塞玛福尔（semaphore)和SF1126, W及
[0083] MTOR抑制剂例如雷帕霉素和类似物；
[0084] CDK抑制剂，包括瑟立西克立（seliciclib)、埃尔沃茨迪（alvocidib)、W及7-轻 基十字抱碱；
[0085] C0X-2抑制剂，包括塞来昔布；
[0086] HDAC抑制齐[|，包括曲古抑菌素A、辛二醜苯胺氧巧酸（subero^anilide hydroxamic acid)、W及衣多星（chlamydocin)；
[0087] DNA甲基化酶抑制剂，包括替莫哇胺；W及
[0088] 其他杂项药剂，包括六甲蜜胺、H氧化二神、萨力多胺、来那度胺、硝酸嫁、左旋咪 哇、米巧坦、轻基脈、奧曲肤、丙卡己脱、苏拉明、光动力化合物如甲氧沙林和扑吩姆轴，W及 蛋白酶体抑制剂例如测替佐米。
[0089] 分子祀向治疗剂，包括：
[0090] 功能性治疗剂，包括基因治疗剂，
[0091] 反义治疗剂，
[0092] 酪氨酸激酶抑制剂例如盐酸埃罗替尼、吉非替尼、甲賴酸伊马替尼、W及瑟马沙尼 (semaxanib)，
[009引 Raf抑制剂例如索拉非尼，W及
[0094] 基因表达调节剂例如类视黄醇（retinoid)和类视黄醇X受体合成物（rexinoid)， 例如阿达帕林、贝沙罗汀、反式视黄酸、9-顺式-视黄酸、W及N-(4-轻苯基）维甲醜胺拟 及
[0095] 表型定向治疗剂，包括单克隆抗体例如阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、替坦异 贝莫单抗、利妥昔单抗、W及曲妥单抗，免疫毒素例如吉妥珠单抗奧哇米星，放射免疫偶联 物例如I-巧西妥莫抗体（tositumob油），W及
[009引 癌症疫苗。
[0097] 生物治疗剂，包括：
[0098] 干扰素例如干扰素-[a ] 2a和干扰素-[a ] 2b，W及
[0099] 白介素例如阿地白介素、地尼白介素（denileukin diftitox)、W及奧 普瑞白介素。Axl抑制剂，包括1-化7-二氨-5H-苯并化7]环庚[1，2-C]化 嗦-3-基）-N3-((7-(S)-化咯焼-1-基）-6,7,8,9-四氨-5H-苯并[7]轮 帰-2-基）2, 4- H哇-3, 5-二胺炬GB324/R428)，C册451098 (罗氏）和 Axl 抑制剂， 描述于 PCT/US07/089177、PCT/US2010/021275 和 PCT/EP2011/004451 中，通过引用结合于 此。
[0100] 除了该些旨在对抗癌症细胞的药剂之外，抗癌疗法还包括使用保护剂或辅佐剂， 包括：
[0101] 细胞保护剂例如氨磯汀W及右雷佐生，
[0102] 麟酸盐例如帕米麟酸盐W及哇来麟酸盐，W及
[0103] 刺激因子例如依泊亭、达泊亭（darbeopetin)、非格司亭、PEG-非格司亭、W及沙 格司亭。
[0104] 许多组合化疗方案在本领域中是已知的，例如W下组合：卡笛/紫杉醇、卡培他滨 /多西他赛、氣尿嚼巧/左旋咪哇、氣尿嚼巧/亚叶酸、甲氨噪岭/亚叶酸、W及曲妥单抗/ 紫杉醇，单独地或另外与卡笛组合，等等。
[0105] 根据本发明的另外一方面，提供了一种选择患者优选人类患者W便治疗一种Akt3 相关病症的方法，该方法包括鉴别具有升高的Akt3活性或表达的患者，并且选择由此鉴别 的患者用于治疗。可W根据如在此所述的本发明的方法对患者进行鉴别。
[0106] 优选该Akt3相关病症是癌症。该癌症可W是W下癌症中的一种或多种：白血病， 例如但不限于，急性白血病，急性淋己细胞性白血病，急性髓细胞性白血病例如成髓细胞 性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性、红白血病白血病W及骨髓增生异常综合征， 慢性白血病例如但不限于慢性髓细胞性（粒细胞性）白血病、慢性淋己细胞性白血病、毛 细胞白血病；真性红细胞增多症；淋己瘤例如但不限于何杰金氏病、非何杰金氏病；多发性 骨髓瘤，例如但不限于冒烟型多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白 血病、孤立性浆细胞瘤W及髓外浆细胞瘤；华氏巨球蛋白血症；未确定显著性的单克隆丙 种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链疾病；骨和结缔组织肉瘤，例如但不限于骨肉 瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组 织肉瘤、血管肉瘤（血管瘤）、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋己管肉 瘤、转移性癌症、神经銷膜瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑瘤，例如但不限于神经胶质瘤、星形 细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非胶质瘤、听神经瘤、颇咽管瘤、成神经管 细胞瘤、脑膜瘤、成松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤、原发性脑淋己瘤；乳癌，包括但不限于 腺癌、小叶（小细胞）癌、管内癌、髓性乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳头乳癌、原发性癌、佩 吉特氏病、W及炎性乳癌；肾上腺癌，例如但不限于嗜铅细胞瘤W及肾上腺皮质癌；嗜铅细 胞瘤，例如但不限于乳头状或甲状腺滤泡癌、甲状腺髓样癌W及甲状腺未分化癌；膜腺癌， 例如但不限于膜岛瘤、胃泌素瘤、膜高血糖素瘤、血管活性肠肤瘤、生长激素抑制素分泌瘤、 W及类癌瘤或膜岛细胞瘤；垂体癌，例如但不限于库兴氏病、催乳素分泌瘤、肢端服大症、W 及尿崩病（di油etes insipius);眼癌，例如但不限于眼内黑色素瘤（0州Iar melanoma)如 虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、W及睫状体黑色素瘤，W及成视网膜细胞瘤；阴道癌，例如 鱗状细胞癌、腺癌、W及黑色素瘤；外阴癌，例如鱗状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、 肉瘤、W及佩吉特氏病；宫颈癌，例如但不限于鱗状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不限于 子宫内膜癌W及子宫肉瘤；卵巢癌，例如但不限于卵巢上皮性癌、交界性肿瘤、生殖细胞瘤、 W及间质瘤；食管癌，例如但不限于鱗癌、腺癌、腺样囊性癌（adenoid cyctic carcinoma)、 粘液表皮样癌、腺鱗癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、巧状癌、W及燕麦细胞（小细胞）癌；胃 癌，例如但不限于腺癌、真菌样生长（息肉状）、溃瘍、表浅扩散型、广泛扩散型（difTusely spreading)、恶性淋己瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、W及癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌，例如但 不限于肝细胞癌W及肝母细胞癌，胆癌例如腺癌；胆管细胞癌，例如但不限于乳头状、结节 状、W及弥散型癌；肺癌，例如非小细胞肺癌、鱗状细胞癌（表皮样癌）、腺癌、大细胞癌W及 小细胞肺癌；睾丸癌，例如但不限于胚组织瘤、精原细胞瘤、未分化型、经典（典型）型、精母 细胞型、非精原细胞瘤、胚胎性癌、崎胎瘤癌、绒毛膜癌（卵黄囊瘤），前列腺癌例如但不限 于前列腺癌、平滑肌肉瘤、W及横纹肌肉瘤；生殖器癌症，例如阴茎癌；口腔癌，例如但不限 于鱗状细胞癌；基底癌症化asal cancer);唾液腺癌，例如但不限于腺癌、粘液表皮样癌、 W及腺样囊性癌；咽癌，例如但不限于鱗状细胞癌W及巧状体；皮肤癌，例如但不限于基底 细胞癌、鱗状细胞癌W及黑色素瘤，浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、恶性雀斑疲样 黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤；肾癌，例如但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉 瘤、移行细胞癌（肾孟和/或输尿管）；维尔姆斯瘤；膀脫癌，例如但不限于移行细胞癌、鱗 状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌症包括粘液肉瘤、骨原性肉瘤、内皮肉瘤、淋己管内皮肉 瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌 W及乳头状腺癌。优选地，该癌症是选自乳癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌 或神经胶质瘤癌。更优选该癌症是转移性乳癌。
[0107] 转移性癌症的治疗取决于原发性肿瘤位于什么地方。当乳癌扩散至肺部时，例如， 它仍然是乳癌，并且治疗是由乳房内的转移性癌源头确定的，而不是由它现在处于肺部中 的事实确定的。大约5%的时间，发现转移性癌但未能鉴别到原发性肿瘤。该些转移性癌症 的治疗是由它们的位置而非它们的源头指示的。转移性癌症是通过原始肿瘤的组织（如果 已知的话）命名的。例如，已经扩散至脑部的乳癌称为对脑部的转移性乳癌。
[010引可W对根据本发明的方法鉴别或选择的患者进行治疗、或选择W便治疗。例如，女口 果Akt3表达显示在原发性肿瘤中下调，该可W用于推断增加的转移可能性。该信息可W用 作指导治疗方案，即更具侵入性的抗癌手术、化疗或放疗治疗（如乳房根治术）。在一些实 施例中，治疗包括给予Akt3和/或Axl抑制剂，可任选地与在此所述的或本领域中已知的 另外一种治疗剂组合。优选地，Axl抑制剂是BGB324/R428。
[0109] 本发明还提供了对EMT的抑制剂敏感的细胞系，该细胞系具有不足W预防EMT的 Akt3表达水平。优选地，该些细胞系是人类细胞系。
[0110] 本发明还提供了一种鉴别抑制Akt3活性的化合物的方法，该方法包括使来自根 据本发明的细胞系的细胞接触一种测试化合物，并且确定在该细胞中Akt3活性的抑制。 [01U] 本发明的一方面涉及Akt3作为一种生物标志物W检测一位受试者中上皮细胞向 间质细胞转化（EMT)的发生的用途。在一些实施例中，AktS的表达和/或激活的增加指示 上皮细胞向间质细胞转化（EMT)的发生。
[0112] 转移至远方部位是由实体瘤造成死亡的最常见原因（古普培（Gupta) 2006,斯波 恩（Sporn) 1996)。为了实现此结果，肿瘤细胞失去上皮抑制物，重新限定连接复合体并且获 得侵入性运动性W打破穿过基底膜边界。该些转移细胞进而内渗进入淋己和造血循环中， 传播至身体内的远方部位。该些转移细胞的少数成功地外渗穿过毛细血管壁，并且在稀有 情况下定殖外部组织基质（温伯格（Weinberg)等人）。该一恶性过程是由一种发育程序上 皮细胞向间质细胞转化（EMT)协助，该发育程序中在原肠胚形成和器官发生期间上皮细胞 短暂地采取间质细胞表型，W允许单细胞侵入性移动远离上皮层（哈尔化all)，1985 ;蒂里 (Thienr) ,2002)。EMT程序是由形成素信号传导通路的背景激活启动的，该些通路诱导转 录调节因子包括扭曲蛋白（Twist)、Snail、Slug和Zeb2的表达，该些因子改变连接复合体 蛋白质的表达（蒂里（Thiery)和斯利曼（SLeeman) 2006)。EMT基因表达谱反映了表型转 变、E-巧粘素和细胞角蛋白的抑制，伴随波形蛋白和N-巧粘素的诱导（温伯格（Weinberg) 等人2007)。
[0113] 术语"标志物"或"生物标志物"在此用来指代一种基因或蛋白质，当上皮细胞向 间质细胞转化（EMT)发生时，该基因或蛋白质在一个衍生自细胞或哺乳动物的样品中的表 达被改变或调节，例如上调或下调。在该生物标志物是一种蛋白质时，表达的调节或改变涵 盖通过不同的翻译后修饰的调节。
[0114] 翻译后修饰是共价加工事件，其通过蛋白质水解切割或通过添加修饰基团至一个 或多个氨基酸改变蛋白质的特性。通常翻译后修饰包括磯酸化、己醜化、甲基化、醜化、糖基 化、GPI销、泛素化等等。对此类修饰和用于检测的方法的综述可W发现于曼恩（Mann)等 人《自然生物技术》（化化re Biotechnology)3月2003,21卷，255-261页中。
[011引还在此提供了 Akt3作为一种生物标志物W检测Axl的表达和/或激活的用途，其 中Akt3的表达和/或激活的增加指示Axl的表达和/或激活的增加。
[0116] 术语"表达"是指基因的DNA模板的转录W产生相应的mRNA W及该mRNA的翻译 W产生相应基因产物（即，肤、多肤或蛋白质），W及处于可能已经经过翻译后修饰的W - 种或多种形式的蛋白质的"表达"。
[0117] 包括基因表达的表达水平的检测可W通过本领域中已知的方法中的任何一种来 进行，特别是通过微阵列分析、蛋白质印迹或通过PCR技术例如QPCR。改变的表达还可W通 过使用例如如在此所述的化ISA、PET或SELDI-TOF MS的方法并且使用进一步的分析技术 例如2D凝胶电泳对样品的蛋白质含量进行分析来检测。诸如此类的技术可W在检测处于 替代的翻译后修饰形式的形式中的蛋白质的改变的表达中是特别有用的。
[0118] 适合的样品包括但不限于组织样品，例如活检样品、血液、尿液、颊碎片等、血清、 血浆或组织培养物上清液样品。在一个实施例中，基因表达优选是在肿瘤细胞中检测，具体 而言是衍生自W下的细胞；肿瘤例如乳癌、肺癌、胃癌、头颈癌、结直肠癌、肾癌、膜腺癌、子 宫癌、肝癌、膀脫癌、子宫内膜癌W及前列腺癌，W及白血病，或衍生自血细胞例如淋己细胞 并且优选外周淋己细胞例如PBMC。
[0119] 在患者血清并且特别是在血浆样品中的蛋白质的检测中，样品被移除并且经受蛋 白质分析技术例如流式细胞术、ELISA、PET和SELDI-TOF MS，如在此所述。
[0120] 在一个优选实施例中，该方法包括将RNA从所述样品中提取并且通过QPCT检测基 因表达。
[0121] 在一个实施例中，基因表达是通过如例如经蛋白质印迹检测蛋白质产物来检测。
[0122] 本发明的另外一方面提供了一种用于检测样品中上皮细胞向间质细胞转化（EMT) 的发生的方法，所述方法包括对分离自一种细胞、细胞群、动物模型或人类的一个样品中的 Akt3的表达水平或激活相比于一个对照样品进行确定，其中相对于该对照样品Akt3的表 达水平或激活的增加指示上皮细胞向间质细胞转化（EMT)的发生。
[0123] 本发明的另外一方面涉及一种鉴别能够抑制或逆转上皮细胞向间质细胞转化 (EMT)的药剂的方法，所述方法包括向一种细胞、细胞群或动物模型给予所述药剂，并且监 测Akt3的激活和/或表达。
[0124] 在一个实施例中，该方法包括：
[0125] (i)向一种细胞、细胞群或一种动物模型而不是人类给予该药剂；并且
[0126] (ii)对衍生自处理的和未处理的细胞或动物模型的样品中的Akt3表达和/或 A1U3激活进行测量；并且
[0127] (iii)相比于未处理的样品，对处理的样品中的AktS的表达和/或激活的增加进 行检测，作为抑制或逆转上皮细胞向间质细胞转化（EMT)的能力的指示。
[012引在一些实施例中，该动物模型不是人类。
[0129] 在一些实施例中，Akt3的表达水平是通过相对于一个对照样品而言确定编码 Akt3的基因的拷贝数来进行评估，其中该拷贝数的增加指示增加的Akt3表达水平。
[0130] 在一些实施例中，AktS的表达水平是通过确定Akt3蛋白质或mRNA的水平来评估 的。
[013。 在一些实施例中，Akt3活性是通过确定Akt3的磯酸化来评估的，其中Akt3的磯 酸化指示Akt3活性。Akt3磯酸化可W被确定为在丝氨酸472处，如在此所述。可替代地或 另外地，磯酸化可W被确定为在苏氨酸305处和/或酪氨酸174处。
[0132] 在一些实施例中，Akt3活性是通过确定Akt3蛋白质的细胞内定位来评估的，其中 定位于细胞核中指示活性Akt3。
[013引在一些实施例中，Akt3活性是通过确定下游祀标（例如，与EMT关联的基因）的 表达水平来评估的。在另外的实施例中，Akt3激酶活性可W通过确定底物蛋白质（例如， SNAIL)或肤的磯酸化来评估，例如如在图奧米（Tuond)等人，2009中所述。
[0134] AktS
[01巧]Akt3(还称为P邸Y) W两种亚型存在于人类中，亚型1和亚型2。亚型UQ9Y23， 型式1)的序列如下，是"标准"序列：
[0136] SEQ ID NO: 1
[0137] MSDVTIVKEGWVQKRGEYIKNWRPRYFLLKTDGSFIGYKEKP孤VDLPYPLNNFSVAKCQLMKTERPKP NTFIIRCLQWTTVIERTFHVDTP 邸 REEWTEAIQAVADRLQR 犯邸 RMNCSPTSQIDNIGEEEMDASTTHHK 服 TMN D 抑 YLKLLGKGTFGKVILVREKASGKYYAMKILKKEVIIAKDEVAHTLTESRVLKNTRHP 化 TSLKYSFQT 邸化 CF VMEYVNGGELF 即 畑 LKLENLMLD 邸細 IKITDFGLCKEGITDA ATMKTFCGTPEYLA 阳化邸 NDYGRAVDWWGLGVVMYEMMCG 化 PFYN 孤肥 KL 阳 U LMEDIKFPRTLSSDAK 化 L S化 U 邸PNKRLGGGP 孤 AKEIMR 服巧 56￥娜〇0￥￥0邸1^￥--。阳〇￥1561011?￥抑邸。14〇1'口口巧61(￥0￡ DGMDCMD肥RRPHFPgFSYSASGRE
[013引亚型2具有序列：
[013引 沈Q ID NO:2
[0140] MSDVTIV邸GWVQKRGEYIKNWRPRYFLLKTDGSFIGYKEKP孤VDLPYPLNNFSVAKCQLMKTERPK PNTFIIRCLQWTTVIERT 即 VDTP 邸 REEWTEAIQAVADRLQRQ 邸邸 MNCSPTSQIDNIGEEEMDASTTHHK 服 T MND 抑化 KLLGKGTFGKVILVREKASGKYYAMKILKKEVIIA 邸 EVAHTLTESRVLKNTCHPFLT^KYSFQmD RLCFVMEYVNGGELFFHLSRERVFS 抓 RTRFYGAEIVSALD 化 HSGKIVY 畑 LKLENLMLD 邸細IKITDF 化 CK EGITDAATMKTFCGTPEYLAPE 化抓 NDYGRA VDWWGLGVVMYEMMCG 化 PFYNQ 畑 EKLFELI LMEDIKFPCTL SSDAKS化 SGlXI 邸PNKRLGGGPDDAKEIM 畑SFFSGVNW 孤 VYDKKLVPPFKPQVTSETDTRY 抑邸 FTAQTI TITP阳KCQQSDCGMLGNWKK
[0141] 对基因/蛋白质标志物的改变的表达的测量
[0142] 可W使用多种不同技术确定基因和蛋白质表达水平。
[0143] (a)在RNA水平上
[0144] 可W在RNA水平上检测基因表达。可W使用RNA提取技术从细胞中提取RNA，该些 提取技术包括例如使用酸苯酷/脈异硫氯酸醋提取（RNAzol B ;Biogenesis)、RNeasy RNA 制备试剂盒（凯杰（Qiagen))或PAXgene(PreAnal^ix，瑞±)。采用核糖核酸杂交的典 型测定方式包括核连缀分析（nuclear run-on assay)、RT-PCR、RNA酶保护测定（麦尔登 (Melton)等人，《核酸研究》（Nuc. Acids Res.) 12:7035)、RNA印迹W及原位杂交。基因表 达还可W通过如下所述的微阵列分析来检测。
[0145] 对于RNA印迹，首先经由电泳在琼脂糖凝胶中在变性条件下通过大小将RNA样品 分离。然后将RNA转移至膜，与标记探针交联并杂交。可W使用非同位素或高特异性活性 的放射标记的探针，包括随机引物产生的、切口翻译的或PCR生成的DNA探针、体外转录的 RNA探针、W及寡核巧酸。另外，仅具有部分同源性的序列（例如来自不同物种的CDNA或可 能包含外显子的基因组DNA片段）可W用作探针。
[0146] 核酸酶保护测定（Nuclease Protection Assay,包括核糖核酸酶保护测定和Sl核 酸酶测定）提供了用于检测和定量特异性mRNA的极其灵敏的方法。NPA的基础是反义探 针（放射标记的或非同位素的）与RNA样品的溶液杂交。在杂交之后，单链的未杂交探针 和RNA被核酸酶降解。剩余的受保护片段在丙帰醜胺凝胶上分离。NPA允许对若干RNA种 类的同时检测。
[0147] 原位杂交（ISH)是对细胞或组织中的特异性mRNA的定位而言有力且通用的工具。 探针的杂交发生于细胞或组织内。由于细胞结构在整个程序中得W保持，ISH提供了关于 组织样品中mRNA的位置信息。
[014引该程序通过将样品固定在中性缓冲性福尔马林中并且将组织包埋入石蜡中来起 始。然后将该些样品切成薄切片，并且固定至显微镜玻片上。可替代地，可W将组织进行切 片冷冻并且之后固定在多聚甲酵中。在一系列洗涂W脱蜡并且再水合该些切片之后，进行 蛋白激酶K的降解，W增加探针可及性，并且然后使标记探针与样品切片杂交。用干燥于玻 片上的液膜使放射标记的探针可视化，而非同位素标记的探针便利地利用比色或英光试剂 来检测。检测的后一方法是英光原位杂交（FISH)的基础。
[0149] 可W采用的用于检测的方法包括放射活性标记、酶标记、化学发光标记、英光标记 和其他合适的标记。
[0150] 典型地，RT-PCR用于扩增RNA祀标。在此过程中，逆转录酶用于将RNA转化为互补 DNA (CDNA)，然后可W将其进行扩增W协助检测。相对定量RT-PCR涉及在扩增感兴趣基因 的同时扩增内部对照物。该内部对照物用于对样品进行归一化。一旦归一化，可W在该些 样品中做出特异性mRNA的相对丰度的直接比较。通常使用的内部对照物包括例如GAPDH、 HPRT、肌动蛋白和亲环蛋白。
[0151] 许多DNA扩增方法是已知的，大多数方法依赖于酶链式反应（例如，聚合酶链式反 应，连接酶链式反应，或自我持续序列复制）或来自已经将其克隆入内的全部或部分载体 的复制。
[0152] 许多祀标和信号扩增（TA巧方法已经描述于文献中，例如，在兰德格伦 (Landegren)，U.等人，《科学》（Science) 242:229-237 (1988)和路易斯（Lewis)，R.，《基因 工程新闻》（Genetic !Engineering News) 10:1,54-55(1990)中对该些方法的总体综述。
[0153] PCR是一种核酸扩增方法，除其他外描述于US 4, 683, 195和4, 683, 202中。 PCR可W用于在诊断背景下扩增任何已知的核酸（莫（Mok)等人，1994,《妇科肿瘤学》 佑ynaecologic Oncology) 52:247-252)。自我持续序列复制（3SR)是一种TAS的变体，它 涉及核酸模板经由连续多轮的逆转录（RT)、聚合酶和核酸酶活性的恒温扩增，该扩增是由 酶混合物和适当的寡核巧酸引物介导的（瓜泰利（Guatelli)等人，1990,《美国国家科学院 院刊》（Proc.化tl. Acad. Sci. USA) 87:1874)。连接扩增反应或连接扩增体系使用DNA连接 酶W及四种寡核巧酸，其中每个祀标链两种。该技术由吴（Wu),D.Y.和华莱± (Wallace)， R.B. ,1989,《基因组学》佑enomics)4:560描述。在Q目复制酶技术中，用于瞻菌体Q目的 复制单链RNA的RNA复制酶被用于扩增祀标DNA，如由利萨尔迪（Lizardi)等人，1988,《生 物 / 技术》炬i〇/Technology)6:1197 描述。
[0154] 定量PCR(Q-PCR)是允许确定样品内的转录物的相对量的技术。在此描述了用于 进行QPCR的合适方法。
[0155] 可W在本发明中使用替代扩增技术。例如，滚环复制（利萨尔迪（Lizardi)等人， 1998,《自然基因组学》（化t Genet) 19:225)是一种可商购的扩增技术（RCAT?)，它由DNA 聚合酶驱动并且可W采用线性或几何动力学在恒温条件下复制环状寡核巧酸探针。另外的 技术，链置换扩增（SDA;瓦尔克（Wa化er)等人，1992,《美国国家科学院院刊》（Proc.化tl. Acad. Sci. USA)80:392)用针对特异性祀标而言唯一的特异性限定的序列开始。
[0156] 适合的用于检测在此鉴别的Akt3或Akt2的表达的合适探针可W便利地W测试试 剂盒的形式包装于合适的容器中。在此类试剂盒中，探针可W结合至固体支持物上，其中试 剂盒所设计针对的测定形式需要该种结合。该试剂盒还可W包含合适的用于处理有待探针 检测的样品的、使探针与样品中的核酸杂交的试剂，对照试剂，说明书，等等。合适的试剂盒 可W包括例如用于QPCR反应的引物或用于进行FI甜的标记探针。
[0157] 化）在多肤水平上
[0158] 改变的基因或蛋白质表达还可W通过测量由Akt3或Akt2基因编码的多肤来检 巧IJ。该可W通过使用结合至由Akt3或Akt2基因编码的多肤上的分子来实现。用W检测蛋 白质存在的直接或间接结合至多肤的合适分子/试剂包括天然存在的分子，例如肤和蛋白 质，如抗体，或者它们可W是合成分子。
[0159] 用于Akt3或Akt2基因或蛋白质的抗体可W衍生自商业来源或通过对于本领域的 技术人员熟悉的技术。在一个实施例中，并且在改变的表达通过蛋白质生物标志物的翻译 后修饰形式的改变的表达来显示其自身的情况下，可W使用对于该些不同形式具有特异性 的抗体。
[0160] 用于产生抗体的方法是本领域技术人员已知的。如果多克隆抗体是希望的，则将 选择的哺乳动物（例如，小鼠、兔、山羊、马等）用来自多肤的具有一个或多个表位的免疫原 性多肤进行免疫。将来自经免疫动物的血清进行收集并且根据已知程序处理。如果包含针 对来自多肤的表位的多克隆抗体的血清包含针对其他抗原的抗体，则可W通过免疫亲和层 析来纯化该些多克隆抗体。用于产生并处理多克隆抗血清的技术在本领域中是已知的。为 了产生更大的免疫原性反应，多肤或其片段可W半抗原化为另一种多肤，W用于用作动物 或人类中的免疫原。
[0161] 针对多肤中的表位的单克隆抗体还可W易于由本领域技术人员产生。用于由杂交 瘤制造单克隆抗体的通用方法是熟知的。产生抗体的永生化细胞系可W通过细胞融合来 产生，并且还可W通过其他技术来产生，例如用癌性DNA直接转化B淋己细胞、或用艾普斯 登一己尔巧PStein-Barr)病毒转染。针对本发明的多肤中的表位产生的一系列单克隆抗 体可W针对不同特性进行筛选；即针对同种型和表位亲和力。
[0162] 替代技术涉及筛选瞻菌体展示文库，该文库中例如瞻菌体在它们的包衣的表面上 表达具有多种互补决定区（CDR)的SCFv片段。该技术在本领域中是熟知的。
[0163] 出于本发明的意图，除非相反地指明，术语"抗体"包括全抗体或全抗体的保持其 针对祀标抗原的结合活性的片段。此类片段包括Fv、F(油'）和F(油'）2片段，W及单链抗 体（scFv)。另外，抗体或其片段可W是人源化抗体，例如如在EP 239400A中所述。例如，单 克隆和多克隆抗体、重组抗体、抗体的蛋白质水解和重组片段（F油、Fv、scFv、双体）、单一 结构域抗体（VHH、sdAb、纳米体、IgNAR、VNAR)、W及与抗体不相关的已经被工程化为具有抗 体样特异性结合的蛋白质，例如W下：
[0164]
【权利要求】
1. 一种鉴别患有Akt3相关病症的受试者的方法，该方法包括评估该受试者中或一个 衍生自该受试者的样品中的Akt3的表达或活性的水平。
2. 根据权利要求1所述的方法，该方法鉴别具有发展转移性或耐药性癌症的特定风险 的一位受试者，该方法包括评估该受试者中或一个衍生自该受试者的样品中的Akt3的表 达或活性的水平，增加的Akt3表达或活性的水平指示该受试者发展转移性或耐药性癌症 的增加的风险。
3. 根据权利要求1所述的方法，该方法鉴别一位受试者中癌症干细胞的存在，该方法 包括确定该受试者中或一个衍生自该受试者的样品中的Akt3表达或活性的水平，增加的 Akt3的表达或活性指示癌症干细胞（CSC)的存在。
4. 根据权利要求1所述的方法，该方法鉴别经受上皮细胞向间质细胞转化（EMT)的一 位受试者，该方法包括确定该受试者中或一个衍生自该受试者的样品中的Akt3表达或活 性的水平，Akt3的表达或活性的增加指示EMT的发生。
5. -种对一位受试者中的癌症相关结果进行预后的方法，该方法包括评估该受试者中 或一个衍生自该受试者的样品中的Akt3活性或表达。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中相对于一个对照样品，Akt3活性或表达的增加指 示出对用一种能够抑制或逆转EMT的药剂进行的治疗的敏感性。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中该药剂是一种Akt3抑制剂或一种Axl抑制剂。
8. -种鉴别Axl活性的方法，该方法包括确定该受试者中或一个衍生自该受试者的样 品中的Akt3的表达或活性的水平，增加的Akt3的表达或活性与Axl活性相关。
9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中该受试者是哺乳动物。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中该受试者是人类。
11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该受试者或衍生自该受试者的样 品中的表达或活性的水平是相对于一个对照样品确定的。
12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，进一步包括评估该受试者中或一个衍 生自该受试者的样品中的Akt2的表达或活性的水平，其中降低的Akt2表达或活性的水平 指示： (i) 该受试者患有一种Akt3相关病症； (ii) 发展转移性或耐药性癌症的增加的风险； (iii) 一种癌症干细胞的存在；和/或 (iv) EMT的发生。
13. 根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中确定Akt3而非Aktl和/或Akt2 的表达。
14. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中Akt3的表达水平是通过相对于一 个对照样品而言确定编码Akt3的基因的拷贝数来进行评估，其中该拷贝数的增加指示增 加的Akt3表达水平。
15. 根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中Akt3的表达水平是通过确定Akt3 蛋白质或mRNA的水平来评估的。
16. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中Akt3活性是通过确定Akt3的磷 酸化来评估的，其中Akt3的磷酸化指示活性Akt3。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中Akt3磷酸化确定为在丝氨酸472处。
18. 根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中Akt3活性是通过确定Akt3蛋白 质的细胞内定位来评估的，其中在细胞核中的定位指示活性Akt3。
19. 一种选择患者优选人类患者以便治疗一种Akt3相关病症的方法，该方法包括鉴别 具有升高的Akt3活性或表达的患者，并且选择由此鉴别的患者用于治疗。
20. 根据权利要求19所述的选择患者的方法，其中该Akt3相关病症是癌症。
21. 根据权利要求19或20中任一项所述的方法，其中根据权利要求1至18中任一项 所述的方法鉴别该患者。
22. 根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中该治疗包括给予一种能够抑制或 逆转EMT的药剂。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中该药剂包括一种Akt3抑制剂或一种Axl抑制 剂。
24. 根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中该癌症或Akt3相关病症是一种选 自乳癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌或神经胶质瘤的癌症。
25. -种用于在Akt3相关病症的治疗中使用的Akt3抑制剂。
26. 根据权利要求25所述的Akt3抑制剂，其中该病症是癌症。
27. -种用于在EMT的抑制中使用的Akt3抑制剂。
28. -种能够抑制Akt3活性的化合物，用于在一位患有癌症的受试者中预防、抑制、或 治疗耐药性，该方法包括使该受试者接触一种能够抑制Akt3活性的化合物。
29. 根据权利要求25至28中任一项所述的Akt3抑制剂，与另一种治疗剂相组合。
30. -种治疗一位患有Akt3相关病症的受试者的方法，该方法包括使该受试者接触一 种Akt3抑制剂或药物化合物，该Akt3抑制剂或药物化合物被选择作为或衍生自一种通过 根据权利要求42至46中任一项所述的方法获得的候选化合物。
31. 根据权利要求30所述的治疗一位患有Akt3相关病症的受试者的方法，该方法包括 定期地评估该受试者中的Akt3活性。
32. 根据权利要求30或31所述的方法，其中该Akt3相关病症是癌症。
33. 根据权利要求30、31或32所述的方法，其中该受试者的治疗是根据Akt3活性的检 测水平调整的。
34. 根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中该受试者正用一种Axl抑制剂治 疗。
35. -种抑制一位受试者中的EMT的方法，该方法包括使该受试者接触一种能够抑制 Akt3活性的化合物。
36. -种抑制一位受试者中的癌症干细胞的方法，该方法包括使该受试者接触一种能 够抑制Akt3活性的化合物。
37. 根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中该受试者还接触另一种癌症治疗 剂。
38. -种预防或抑制一位患有癌症的受试者中的耐药性的方法，该方法包括使该受试 者接触一种能够抑制Akt3活性的化合物。
39. 根据权利要求30至38中任一项所述的方法，其中该受试者是哺乳动物。
40. 根据权利要求39所述的方法，其中该受试者是人类。
41. 根据权利要求25至29中任一项所述的Akt3抑制剂，或根据权利要求37至40 中任一项所述的治疗方法，其中该另一种治疗剂是一种选自以下项的癌症治疗：烷化剂， 包括烷基磺酸盐例如白消安，氮芥例如苯丁酸氮芥、环磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯 甲基二乙胺、美法仑、以及乌拉莫司汀，乙烯亚胺衍生物例如噻替派，亚硝基脲例如卡莫司 汀、洛莫司汀、以及链佐星，三氮烯例如达卡巴嗪、丙卡巴肼、以及替莫唑胺，钼化合物例如 顺钼、卡钼、奥沙利钼、赛特钼、以及吡钼奥纳钼、四钼、螺钼、异丙钼、氯代（二亚乙基二氨 基）_钼（II)氯化物、二氯（亚乙基二氨基）-钼（II)、二氨基（2-乙基丙二酸根）合钼 (II)、（1，2_二氨基环己烧）丙二酸根合钼（II)、（4-羧基酞）-(1,2-二氨基环己烧）合 钼（II)、（1，2_二氨基环己烷）-(异柠檬酸根）合钼（II)、以及（1，2_二氨基环己烷）-顺 式-(丙酮酸根）合钼（II);抗代谢物，包括叶酸拮抗物例如甲氨喋呤、普美曲塞、雷替曲 塞、以及三甲曲沙，啼陡类似物例如阿扎胞苷、卡培他滨、阿糖胞苷、依达曲沙、氟尿苷、氟尿 嘧啶、吉西他滨、以及曲沙他滨，以及嘌呤类似物例如克拉屈滨、氯脱氧腺苷、克罗拉滨、氟 达拉滨、巯基嘌呤、喷司他丁、以及硫鸟嘌呤；天然产物，包括抗肿瘤抗生素例如博来霉素、 更生霉素、光辉霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、泊非罗霉素、以及蒽环类，如道诺霉素、多柔比 星、表柔比星、伊达比星、以及戊柔比星，有丝分裂抑制剂例如长春花生物碱长春花碱、文韦 西尔、长春新碱、长春地辛、以及长春瑞滨，酶例如L-天冬酰胺酶和PEG-L-天冬酰胺酶，微 管聚合物稳定剂例如紫杉烷紫杉醇和多西他赛，拓扑异构酶I抑制剂例如喜树碱伊立替康 和拓扑替康，以及拓扑异构酶II抑制剂例如鬼臼毒素、安吖啶、依托泊苷、替尼泊苷、洛索 蒽醌以及放线菌素；激素和激素拮抗剂，包括雄激素例如氟甲睾酮和睾内酯，抗雄激素例如 比卡鲁胺、环丙孕酮、氟他米特、以及尼鲁米特，皮质类固醇例如地塞米松和强的松，芳香酶 抑制剂例如氨鲁米特、阿那曲唑、依西美坦、福美司坦、以及来曲唑；雌激素例如己烯雌酚， 抗雌激素例如氟维司群、雷洛昔芬、它莫西芬、以及托瑞米芬，促黄体激素释放激素（LHRH) 激动剂和拮抗剂例如阿巴瑞克、布舍瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林、组氨瑞林、德索瑞林、醋酸 那法瑞林以及曲普瑞林，孕酮例如醋酸甲羟孕酮以及醋酸甲地孕酮，以及甲状腺激素例如 左旋甲状腺素以及碘塞罗宁；PKB通路抑制剂，包括哌立福辛、盐酸恩扎斯托瑞、以及曲西 立滨，P13K抑制剂例如塞玛福尔和SF1126,以及MTOR抑制剂例如雷帕霉素和类似物；⑶K 抑制剂，包括瑟立西克立、埃尔沃茨迪、以及7-羟基十字孢碱；COX-2抑制剂，包括塞来昔 布；HDAC抑制剂，包括曲古抑菌素 A、辛二酰苯胺氧肟酸、以及衣多星；DNA甲基化酶抑制 齐U，包括替莫唑胺，以及其他杂项药剂，包括六甲蜜胺、三氧化二砷、萨力多胺、来那度胺、硝 酸镓、左旋咪唑、米托坦、羟基脲、奥曲肽、丙卡巴肼、苏拉明、光动力化合物如甲氧沙林和卟 吩姆钠，以及蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米；分子靶向治疗剂，包括：功能性治疗剂，包括 基因治疗剂，反义治疗剂，酪氨酸激酶抑制剂例如盐酸埃罗替尼、吉非替尼、甲磺酸伊马替 尼、以及瑟马沙尼，Raf抑制剂例如索拉非尼，以及基因表达调节剂例如类视黄醇和类视黄 醇X受体合成物，例如阿达帕林、贝沙罗汀、反式视黄酸、9-顺式-视黄酸、以及N-(4-羟 苯基）维甲酰胺；以及表型定向治疗剂，包括单克隆抗体例如阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔 单抗、替坦异贝莫单抗、利妥昔单抗、以及曲妥单抗，免疫毒素例如吉妥珠单抗奥唑米星，放 射免疫偶联物例如I-托西妥莫抗体，以及癌症疫苗；生物治疗剂，包括：干扰素例如干扰 素 -[a ]2a和干扰素 -[a ] 2b，以及白介素例如阿地白介素、地尼白介素、以及奥普瑞白介 素抗癌疗法，涉及使用包括以下项的保护剂或辅佐剂：细胞保护剂例如氨磷汀以及右雷佐 生，膦酸盐例如帕米膦酸盐以及唑来膦酸盐，以及刺激因子例如依泊亭、达泊亭、非格司亭、 PEG-非格司亭、以及沙格司亭；以及Axl抑制剂，例如1-(6,7-二氢-5H-苯并[6, 7]环 庚[l，2-c]哒嗪-3-基）-N3-((7-(S)_ 吡咯烷-1-基）-6,7,8,9_ 四氢-5H-苯并[7]轮 烯-2-基）-1H-1，2, 4-三唑-3, 5-二胺；或另外的组合化疗方案，例如以下组合：卡钼/紫 杉醇、卡培他滨/多西他赛、氟尿嘧啶/左旋咪唑、氟尿嘧啶/亚叶酸、甲氨喋呤/亚叶酸、 以及曲妥单抗/紫杉醇，单独地或另外与卡钼组合，等等。
42. -种选择有用于预防、抑制或治疗Akt3相关病症的药物化合物的方法，该方法包 括提供一组候选药物化合物用于测试，在一个测试系统中测试候选药物化合物对Akt3活 性的作用，并且基于对Akt3活性的抑制选择一种候选药物化合物。
43. -种选择有用于治疗转移性或耐药性癌症的候选药物化合物的方法，该方法包括 提供一组候选药物化合物用于测试，在一个测试系统中测试候选药物化合物对Akt3活性 的作用，并且基于其对Akt3活性的抑制选择一种候选药物化合物。
44. 一种选择有用于预防或抑制EMT的候选药物化合物的方法，该方法包括提供一组 候选药物化合物用于测试，在一个测试系统中测试候选药物化合物对Akt3活性的作用，并 且基于对Akt3活性的抑制选择一种候选药物化合物。
45. -种选择有用于预防、抑制或治疗Akt3相关病症的候选药物化合物的方法，该方 法包括选择性地降低一种测试细胞中的Akt3的表达，使该测试细胞接触该候选药物化合 物，并且确定该候选药物化合物对Akt3活性抑制的作用。
46. -种选择有用于预防、抑制或治疗Akt3相关病症的候选药物化合物的方法，该方 法包括选择性地将一种体外测试系统中Akt3的表达降低至一个低水平，使该测试系统接 触一种候选药物化合物，并且选择抑制Akt3活性的候选药物化合物。
47. 根据权利要求5所述的方法，其中选择基本上或完全抑制Akt3活性的候选药物化 合物。
48. 根据权利要求45、46或47所述的选择候选药物化合物的方法，其中Akt3活性的抑 制是通过EMT的减少而指示。
49. 根据权利要求44至48中任一项所述的方法，其中在该测试系统中Akt3在细胞中 的表达降低 90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、或 20%。
50. 根据权利要求49所述的方法，其中Akt3的表达降低以至于不导致EMT的抑制。
51. 根据权利要求44至50中任一项所述的方法，其中Akt3的表达是通过将一种干扰 Akt3表达的核苷酸引入该测试系统中的细胞中而得以选择性地降低。
52. -种对EMT的抑制剂敏感的细胞系，该细胞系具有恰好不足以预防EMT的Akt3表 达水平。
53. 根据权利要求52所述的细胞系，该细胞系是一种人类细胞系。
54. -种鉴别抑制Akt3活性的化合物的方法，该方法包括使来自根据权利要求52或 53的细胞系的细胞接触一种测试化合物，并且确定在该细胞中Akt3活性的抑制。
55. 根据权利要求54所述的方法，其中Akt3活性的抑制是通过EMT的抑制来鉴别的。 56. Akt3作为一种生物标志物用以检测一位受试者中上皮细胞向间质细胞转化（EMT) 的发生的用途。
57. 根据权利要求56所述的用途，其中Akt3的表达和/或激活的增加指示上皮细胞向 间质细胞转化（EMT)的发生。 58. Akt3作为一种生物标志物用以检测Axl的表达和/或激活的用途，其中Akt3的表 达和/或激活的增加指示Axl的表达和/或激活的增加。
59. -种用于检测一个样品中上皮细胞向间质细胞转化（EMT)的发生的方法，所述方 法包括 对分离自一种细胞、细胞群、动物模型或人类的一个样品中的Akt3的表达水平或激活 相比于一个对照样品进行确定，其中相对于该对照样品Akt3的表达水平或激活的增加指 示上皮细胞向间质细胞转化（EMT)的发生。
60. -种鉴别能够抑制或逆转上皮细胞向间质细胞转化（EMT)的药剂的方法，所述方 法包括向一种细胞、细胞群或动物模型给予所述药剂，并且监测Akt3的激活和/或表达。
61. 根据权利要求60所述的方法，该方法包括： (i) 向一种细胞、细胞群或一种动物模型而不是人类给予该药剂；并且 (ii) 对衍生自处理的和未处理的细胞或动物模型的样品中的Akt3表达和/或Akt3激 活进行测量；并且 (iii) 相比于未处理的样品，对处理的样品中的Akt3的表达和/或激活的增加进行检 测，作为抑制或逆转上皮细胞向间质细胞转化（EMT)的能力的指示。
62. 根据权利要求60或权利要求61所述的方法，其中该动物模型不是人类。
63. 根据权利要求57至62中任一项所述的用途或方法，其中Akt3的表达水平是通过 相对于一个对照样品确定编码Akt3的基因的拷贝数来评估的，其中该拷贝数的增加指示 增加的Akt3表达水平。
64. 根据权利要求56至63中任一项所述的用途或方法，其中Akt3的表达水平是通过 确定Akt3蛋白质或mRNA的水平来评估的。
65. 根据权利要求56至64中任一项所述的用途或方法，其中Akt3活性是通过确定 Akt3的磷酸化来评估的，其中Akt3的磷酸化指示Akt3活性。
66. 根据权利要求65所述的用途或方法，其中Akt3磷酸化确定为在丝氨酸472处。
67. 根据权利要求56至66中任一项所述的用途或方法，其中Akt3活性是通过确定 Akt3蛋白质的细胞内定位来评估的，其中在细胞核中的定位指示活性Akt3。
【文档编号】G01N33/574GK104335046SQ201380023276
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2013年5月2日 优先权日:2012年5月2日
【发明者】J.洛伦斯, C.蒂隆 申请人:卑尔根生物股份公司