表达α1，3半乳糖转移酶的癌细胞/树突状细胞融合肿瘤疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了表达α1，3半乳糖转移酶的癌细胞/树突状细胞融合肿瘤疫苗及其制备方法。本发明所提供的表达α1，3半乳糖转移酶的癌细胞/树突状细胞融合肿瘤疫苗及其制备方法中，制备融合细胞的方法包括将肿瘤细胞和树突状细胞进行融合得到融合细胞的步骤；所述肿瘤细胞为含有α1，3半乳糖转移酶相关基因并表达α1，3半乳糖转移酶的重组细胞；α1，3半乳糖转移酶相关基因由α1，3半乳糖转移酶基因和GTTI连接而成；所述α1，3半乳糖转移酶基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；所述GTTI的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.4的第1位-第548位核苷酸。
【专利说明】
表达a1，3半乳糖转移酶的癌细胞/树突状细胞融合肿瘤 疫苗及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医学领域中表达a 1，3半乳糖转移酶的癌细胞/树突状细胞融合 肿瘤疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤的免疫治疗已经成为手术、放疗和化疗之外的一种新的治疗方法。其中 肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL)过继治疗法一直是肿瘤 免疫治疗的研究重点。肿瘤细胞和树突状细胞（dendritic cells, DC)融合作为一种诱导 CTL的有效方法已被广泛接受。但是融合疫苗的治疗效果仍不理想，需要新方法增强融合细 胞诱导CTL的有效性和靶向性。
[0003] 在 a 1，3 半乳糖转移酶[alpha (1，3) Galactosyltransferase, alpha (1，3) GT]催 化下，尿苷二磷酸半乳糖上的糖基转移到糖脂和糖蛋白链上的N-乙酰葡萄糖胺残基上形 成a -Gal抗原。a半乳糖苷酶抗原（a -Gal或Gal a l-3Gal 0 l-4GlcNAc_R)是一种特殊 的糖类结构，末端a -半乳糖残基是天然抗体特异识别位点，半乳糖与半乳糖之间必须是 以a形式1，3位连接。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何治疗肿瘤。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了制备融合细胞的方法。
[0006] 本发明所提供的制备融合细胞的方法，包括将肿瘤细胞和树突状细胞进行融合得 到融合细胞的步骤；
[0007] 所述肿瘤细胞为M或N :
[0008] M、所述肿瘤细胞为表达a 1，3半乳糖转移酶的重组细胞；
[0009] N、所述肿瘤细胞为含有a 1，3半乳糖转移酶相关基因的重组细胞；
[0010] 所述a 1，3半乳糖转移酶为下述B1)或B2)的蛋白质：
[0011] B1)氨基酸序列为SEQ ID No. 3的蛋白质；
[0012] B2)在SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有所述a 1，3半乳糖转移酶功能的由B1)衍生的蛋白质；
[0013] 所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因由a 1，3半乳糖转移酶基因和名称为GTTI的 DNA分子连接而成；
[0014] 所述a 1，3半乳糖转移酶基因编码所述a 1，3半乳糖转移酶；
[0015] 所述GTTI的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 4的第1位-第548位核苷酸。
[0016] 上述B2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述B2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No. 4的第581位-第1630位核苷酸所 示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错 义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上SEQ ID No. 4的第1646位-第2365位核苷酸 所示的荧光蛋白的编码序列得到。
[0017] 其中，SEQ ID No. 4由2365个核苷酸组成，SEQ ID No. 4的第1位-第548位核苷 酸为名称为GTTI的DNA分子，SEQ ID No. 4的第581位-第1630位核苷酸编码氨基酸序 列为SEQ ID No. 3的a 1，3半乳糖转移酶，SEQ ID No. 4的第1646位-第2365位核苷酸 编码EGFP。
[0018] 上述制备融合细胞的方法中，所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因中，所述GTTI的 3'端连接所述a 1，3半乳糖转移酶基因的5'端，所述GTTI的3'端和所述a 1，3半乳糖 转移酶基因的5'端之间可含有连接所述GTTI和所述a 1，3半乳糖转移酶基因的核苷酸序 列。
[0019] 上述制备融合细胞的方法中，所述含有a 1，3半乳糖转移酶相关基因的重组细胞 是将所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因导入受体肿瘤细胞中得到的重组细胞。
[0020] 上述制备融合细胞的方法中，所述a 1，3半乳糖转移酶基因为如下B11)或B21) 或B31)所示的核酸分子：
[0021] B11)序列表中SEQ ID No. 4的第581位-第1630位核苷酸所示的DNA分子；
[0022] B21)与B11)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述a 1，3 半乳糖转移酶的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0023] B31)在严格条件下与B11)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述a 1，3半乳糖转移 酶的cDNA分子或基因组DNA分子。
[0024] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的SEQ ID No. 4的第581位-第1630位核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高， 或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行 评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用 来评价相关序列之间的同一性。
[0025] 上述制备融合细胞的方法中，所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在 68°C下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0. 5 X SSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗 膜2次，每次15min。
[0026] 上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0027] 上述制备融合细胞的方法中，所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因的核苷酸序列为 序列表中SEQ ID No. 4的第1位-第1630位核苷酸。
[0028] 上述制备融合细胞的方法中，可在所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因的5'端和 /或3'端连上常用标签的编码序列，也可在所述a 1，3半乳糖转移酶基因的5'端和/或 3'端连上常用标签的编码序列。
[0029] 上述制备融合细胞的方法中，所述常用标签可为Hi s、FIag、GST、MBP、Hi s-MBP、HA、 EGFP、eCFP、eYFP、Myc、His-Myc、His_AviTag、Sumo、His_Sumo、SNAP-Tag 或 Halo Tag 标签。
[0030] 在本发明的一个实施例中，所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因的3'端连接EGFP 的编码序列（即SEQ ID No. 4的第1646位-第2365位核苷酸所示的荧光蛋白的编码序 列）。
[0031] 上述制备融合细胞的方法中，所述受体肿瘤细胞可为肝癌细胞，具体可为IfepG2。
[0032] 上述制备融合细胞的方法中，所述树突状细胞可为从外周血中制备的树突状细 胞，所述外周血具体可为人的外周血。
[0033] 为解决上述技术问题，本发明还提供了融合细胞。
[0034] 本发明所提供的融合细胞为利用上述制备融合细胞的方法得到的融合细胞。
[0035] 为解决上述技术问题，本发明还提供了治疗和/或预防肿瘤药物。
[0036] 为解决上述技术问题，本发明还提供了 a 1，3半乳糖转移酶相关基因。
[0037] 本发明所提供的a 1，3半乳糖转移酶相关基因为上述制备融合细胞的方法中所 述的a 1，3半乳糖转移酶相关基因。
[0038] 为解决上述技术问题，本发明还提供了治疗和/或预防肿瘤药物。
[0039] 本发明所提供的治疗和/或预防肿瘤药物的活性成分为下述H1和/或H2 :
[0040] H1、所述融合细胞；
[0041 ] H2、所述融合细胞诱导T淋巴细胞得到的分泌IFN- y的T淋巴细胞。
[0042] 上述治疗和/或预防肿瘤药物中，所述治疗和/或预防肿瘤药物可为治疗和/或 预防肝癌药物。
[0043] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述N1或N2或N3或N4的应用：
[0044] N1、所述融合细胞在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用或在制备分泌IFN- y 的T淋巴细胞中的应用；
[0045] N2、所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应 用；
[0046] N3、与所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因相关的生物材料在制备治疗和/或预防 肿瘤药物中的应用；
[0047] 所述生物材料为下述F1)至F19)中的任一种：
[0048] F1)含有所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因的表达盒；
[0049] F2)含有所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因的重组载体；
[0050] F3)含有F1)所述表达盒的重组载体；
[0051] F4)含有所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因的重组微生物；
[0052] F5)含有F1)所述表达盒的重组微生物；
[0053] F6)含有F2)所述重组载体的重组微生物；
[0054] F7)含有F3)所述重组载体的重组微生物；
[0055] F8)含有所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因的转基因动物细胞系；
[0056] F9)含有F1)所述表达盒的转基因动物细胞系；
[0057] F10)含有F2)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0058] F11)含有F3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0059] F12)含有所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因的转基因动物组织；
[0060] F13)含有F1)所述表达盒的转基因动物组织；
[0061] F14)含有F2)所述重组载体的转基因动物组织；
[0062] F15)含有F3)所述重组载体的转基因动物组织；
[0063] F16)含有所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因的转基因动物器官；
[0064] F17)含有F1)所述表达盒的转基因动物器官；
[0065] F18)含有F2)所述重组载体的转基因动物器官；
[0066] F19)含有F3)所述重组载体的转基因动物器官；
[0067] N4、所述融合细胞诱导T淋巴细胞得到的分泌IFN- Y的T淋巴细胞在制备治疗和 /或预防肿瘤药物中的应用。
[0068] 上述应用中，F1)所述的含有a 1，3半乳糖转移酶相关基因的表达盒，不但可包括 启动a 1，3半乳糖转移酶相关基因转录的启动子，还可包括终止a 1，3半乳糖转移酶相关 基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0069] 可用现有的表达载体构建含有所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因表达盒的重组 载体。
[0070] 上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0071] 上述应用中，F4)_F7)所述的微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
[0072] 上述应用中，所述转基因动物细胞系、所述转基因动物组织和所述转基因动物器 官均不包括繁殖材料。
[0073] 在本发明的一个实施方式中，所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因通过含有所述 a 1，3半乳糖转移酶相关基因的表达盒的重组载体导入肝癌细胞IfepG2中，得到重组癌细 胞。所述重组载体为用序列表中SEQ ID No. 4所示的DNA分子替换pLVX-Puro载体上BamH I和Xba I识别位点间的片段得到的重组载体。
[0074] 上述应用中，所述治疗和/或预防肿瘤药物可为治疗和/或预防肝癌药物。
[0075] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述P1)_P5)中任一种治疗和/或预防肿 瘤药物：
[0076] P1)、利用所述a 1，3半乳糖转移酶相关基因制备的治疗和/或预防肿瘤药物；
[0077] P2)、利用所述与a 1，3半乳糖转移酶相关基因相关的生物材料制备的治疗和/或 预防肿瘤药物；
[0078] P3)、利用所述融合细胞制备的治疗和/或预防肿瘤药物；
[0079] P4)、利用所述含有a 1，3半乳糖转移酶相关基因的肿瘤细胞制备的治疗和/或预 防肿瘤药物；
[0080] P5)、利用所述融合细胞诱导T淋巴细胞得到的分泌IFN- Y的T淋巴细胞的制备 治疗和/或预防肿瘤药物。
[0081] 上述治疗和/或预防肿瘤药物中，所述治疗和/或预防肿瘤药物可为治疗和/或 预防肝癌药物。
[0082] 本发明中，T淋巴细胞可为来源于人外周血的T淋巴细胞。
[0083] 实验证明，本发明的融合细胞DC/HepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- y的T淋巴细 胞能显著延缓肿瘤生长：经DC/HepG2(GT+)诱导的分泌IFN-y的T淋巴细胞治疗后的 肿瘤的体积分别为 PBS、DC/H印G2、DC/IfepG2 (pLVX-Puro)、DC、IfepG2、IfepG2 (GT+)和 HepG2(pLVX-Puro)的 0? 320 倍、0? 486 倍、0? 495 倍、0? 575 倍、0? 286 倍、0? 307 倍、0? 291 倍。本发明的融合细胞DC/IfepG2(GT+)诱导的分泌IFN-y的T淋巴细胞能明显延长荷人 肝癌裸鼠生存时间：与 PBS、DC/IfepG2、DC/IfepG2 (pLVX-Puro)、DC、IfepG2、IfepG2(GT+)和 IfepG2 (pLVX-Puro)相比，在荷人肝癌裸鼠的存活率分别为80 %、60 %、40 %、20 %和0时， DC/IfepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞治疗的荷人肝癌裸鼠距第1次治疗的时间 均延长。实验证明，本申请的DC/IfepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞可明显抑制 肿瘤生长，延长荷人肝癌裸鼠生存时间。
【附图说明】
[0084] 图 1 为 SEQ ID No. 4 中 GTTI、alpha(l, 3)GT 和 EGFP 的连接顺序。
[0085] 图2为H印G2(GT+)中可表达al，3半乳糖转移酶。其中，绿色箭头所指细胞为 HepG2 (GT+)〇
[0086] 图 3 为酶联免疫斑点法检测 DC/IfepG2、DC/IfepG2 (GT+)、DC/IfepG2 (pLVX-Puro)、 DC、IfepG2 (GT+)、IfepG2 和 IfepG2 (pLVX-Puro)诱导 T 淋巴细胞分泌的 IFN- y。
[0087] 图4为DC/HepG2 (GT+)治疗肿瘤情况。其中，A为DC/HepG2 (GT+)诱导的分泌 IFN-y的T淋巴细胞治疗肿瘤后肿瘤体积的变化情况，B为DC/HepG2(GT+)诱导的分泌 IFN-y的T淋巴细胞治疗肿瘤后裸鼠的存活情况。
【具体实施方式】
[0088] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0089] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0090] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0091] 下述实施例中的pLVX-Puro载体为南京金斯瑞公司产品，货号为RP20513。
[0092] 下述实施例中的HepG2细胞购买自ATCC细胞库，货号为HB-8065?。
[0093] 下述实施例中的近交系雌性裸鼠（BALB/c Nude Mice)购买自上海邦耀生物技术 有限公司。
[0094] 下述实施例中的 rhGM-CSF(Recombinant human Granulocyte/Macrophage colony-stimulating factor，重组人粒巨细胞集落刺激因子）为R&D Systems公司 产品，货号为 215-GM-010 ;rhIL_4(Recombinant human interleukin-4,重组人白细胞 介素-4)为 R&D Systems 公司产品，货号为 204-IL-010 ;rhIL_2 (Recombinant human interleukin-2,重组人白细胞介素-2)为R&D Systems公司产品，货号为202-IL-010; rhTNF-a (Recombinant human tumor necrosis factor-a，重组人肿瘤坏死因子-a)为 R&D Systems 公司产品，货号为 210-TA-005。
[0095] 下述实施例中的T淋巴细胞为来源于人外周血的T淋巴细胞。
[0096] 下述实施例中的ISOLECTIN GS-IB4为Invitrogen公司产品，货号为132450,该 ISOLECTIN GS-IB4 结合了 Alexa Fluor? 647〇
[0097] 实施例1、融合细胞的制备
[0098] 融合细胞的制备方法，包括S1)和S2):
[0099] S1)将a 1，3半乳糖转移酶相关基因导入肿瘤细胞中得到重组细胞；
[0100] S2)将所述重组细胞与树突状细胞融合得到所述融合细胞。
[0101] 具体方法如下：
[0102] 1、重组细胞的制备
[0103] 将pLVX-Puro载体上BamH I和Xba I识别位点间的片段替换为序列表 中SEQ ID No. 4所示的DNA分子，保持其他序列不变，得到重组载体pLVX-Puro/GT，该 重组载体pLVX-Puro/GT表达SEQ ID No. 3所示的a 1，3半乳糖转移酶（alpha (1，3) Galactosyltransferase，alpha (1，3) GT)。将该重组载体 pLVX-Puro/GT 导入 HepG2 细胞 中，得到含有 a 1，3 半乳糖转移酶（alpha(l，3)Galactosyltransferase，alpha(l，3)GT)相 关基因编码序列和EGFP编码序列的重组细胞，将该重组细胞命名为IfepG2 (GT+)。
[0104] SEQ ID No. 4由2365个核苷酸组成，其中，SEQ ID No. 4的第1位-第1630位核 苷酸为a 1，3半乳糖转移酶相关基因编码序列，SEQ ID No. 4的第1位-第548位核苷酸 为名称为GTTI的DNA分子，SEQ ID No. 4的第581位-第1630位核苷酸编码SEQ ID No. 3 所示的a 1，3半乳糖转移酶，SEQ ID No. 4的第1646位-第2365位核苷酸编码EGFP (图 1)〇
[0105] 将pLVX-Puro载体导入IfepG2细胞中，得到pLVX-Puro载体的重组细胞，将该重组 细胞命名为H印G2 (pLVX-Puro) 〇
[0106] 免疫荧光法检测IfepG2 (GT+)中alpha(l，3)GT的表达：
[0107] 1) lmg/mL ISOLECTIN GS-IB4 :500 y g ISOLECTIN GS-IB4 用 500 y L 稀释液溶解， 稀释液（pH 7. 2)为含有 1. OmM CaCljP 2mM 叠氮化钠（sodium azide)的 0? 01M PBS，溶解 后分装5 y L或10 y L每支，-20°C避光保存，避免反复冻融。用前先溶解，瞬时离心，取上清 液用0. 01M PBS稀释100倍，得到稀释的GS-IB4,全程避光操作。
[0108] 2)培养对数期细胞，铺在共聚焦专用皿中（35mm玻底培养皿，孔径10mm，玻片厚 0. 085-0. 13mm)，每个皿加入IX 105个细胞铺在中间的小孔里。等细胞贴壁生长良好后，从 培养箱中取出细胞，弃培养基，PBS洗2次（小心避免细胞脱落），用4%多聚甲醛（铺满共 聚焦皿底部）固定细胞，室温20min，PBS洗3次，3min/次。
[0109] 3)加入0.2%作行〇11乂-100(铺满共聚焦皿底部）透化10111111，1\?83洗3次， 3min/ 次。
[0110] 4)加入2%小牛血清（铺满共聚焦皿底部）封闭，室温30min。
[0111] 5)弃封闭液，PBS洗3次，3min/次。加入步骤1)的稀释的GS-IB4(铺满共聚焦皿 底部），4°C湿盒中孵育3h，空白对照组加PBS代替GS-IB4,此步骤避光。PBS洗3次，5min/ 次，此步骤避光。
[0112] 6)共聚焦荧光显微镜下观察拍照。
[0113] IfepG2(GT+)中表达的 alpha(l, 3)GT 催化生成 a -Gal，a -Gal 与 Alexa Fluor? 647标记的凝集素ISOLECTIN GS-IB4结合，被激发红色荧光（图2)，IfepG2(GT+)细胞自发 EGFP绿色荧光（图2)，结果表明，HepG2 (GT+)能够表达alpha (1，3) GT与EGFP的融合蛋白。
[0114] 培养 IfepG2、IfepG2 (GT+)和 IfepG2 (pLVX-Puro)，分别得到处于对数期的 IfepG2、处 于对数期的H印G2 (GT+)和处于对数期的IfepG2 (pLVX-Puro)。
[0115] 2、树突状细胞的制备
[0116] S1、取人的血液用PBS缓冲液进行稀释，将稀释后的血液缓慢的加入放有淋巴细 胞分离液的离心管中（稀释后的血液的体积为淋巴细胞分离液的体积的两倍），使稀释后 的血液沿管壁缓慢流下到淋巴细胞分离液表面分层，使稀释后的血液悬浮在淋巴细胞分离 液上；
[0117] S2、2300rpm，离心30min，离心机升速和降速均为1档；
[0118] S3、管内液体分层，从上到下依次是血浆层，PBMC(外周血单个核细胞）层，分离 液，粒细胞层，红细胞层。轻拿轻放，用lmL注射器吸取中间的云雾状白膜层细胞，收集到新 的50mL离心管中，得到PBMC液体；
[0119] S4、加入4倍于PBMC液体体积的37°C不完全RIPM 1640(即不含血清的RIPM 1640)洗涤，1500rpm，离心10min ;再用4倍于PBMC液体体积的37°C不全RIPM 1640 (即不 含血清的RIPM 1640)洗涤，llOOrpm，lOmin ;再用4倍于PBMC液体体积的37°C不全RIPM 1640 (即不含血清的RIPM 1640)洗涤，lOOOrpm，离心10min ;
[0120] S5、用完全RIPM 1640(即含血清的RIPM 1640)重悬细胞，放于培养瓶中。在37°C， 5% C02培养箱内培养2小时（贴壁细胞即为树突状细胞（DC)的前体细胞（记为DC培养 第 0 天的 DC))，加入 1000U/mL rhGM-CSF 和 500U/mL rhIL-4,置于 37°C，5% C02培养箱内。 DC培养过程中每三天用含有1000U/mL rhGM-CSF、500U/mL rhIL-4的完全RIPM 1640半量 换液；
[0121] S6、在DC培养第5天DC基本呈悬浮状态，加入25ng/mL的rhTNF- a，继续置于 37%，5% C02培养箱内培养，在DC培养第7天得到成熟DC。该成熟DC的细胞形态为体积 变大，呈集落生长有根须状毛刺状突起，形态不规则。
[0122] 经过流式细胞仪测定上述成熟树突状细胞（DC)表达⑶83、⑶86、HLA-DR 和HL A -ABC的水平。首先将上述成熟树突状细胞（DC)分别与FITC-抗HLA-DR抗体 (ebioscience 产品，货号为 11-9956-42)、FITC-抗 HLA-ABC 抗体（ebioscience 产品，货 号为 11-9983-41)、FITC-抗 CD83 抗体（ebioscience 产品，货号为 11-0839-42)和 PE-抗 CD86抗体（ebioscience产品，货号为25-0869-42)在PBS中反应45分钟，反应结束后以 PBS洗三次，上机分析。结果显示成熟DC高表达⑶83、⑶86、HLA-DR和HLA-ABC，与DC培养 第0天的DC (DC的前体细胞）相比，⑶83、⑶86、HLA-DR的表达有了明显的增高，表明上述 步骤中得到的树突状细胞（DC)为成熟DC。
[0123] 3、融合细胞的制备
[0124] 3. 1将步骤2的成熟DC用不含血清的RIPM 1640洗一遍。弃上清，加入500 yL Diluent C(NEB，B8003S)重悬成单个细胞悬液。另在 500 yL Diluent C 加入 lyL PKH26 原液（Sigma)混匀，然后立即加入细胞中，室温孵育4min。加入lmL小牛血清终止lmin，用 6mL完全RIPM 1640培养基洗三次备用，得到染色后的DC，以上步骤需避光进行。
[0125] 3. 2步骤1的处于对数期的IfepG2 (GT+)肿瘤细胞染色步骤：肿瘤细胞用不含血清 的RIPM 1640洗一遍。弃上清，加入lmL含0.1% (质量百分比浓度）BSA的PBS重悬成单 个细胞悬液。另在lmL含0. 1% (质量百分比浓度）BSA的PBS加入3 y LFITC原液（Sigma 公司）混匀，然后立即加入细胞中，37°C孵育8min，每2min震荡一次。加入lmL小牛血清终 止lmin，用6mL完全RIPM 1640培养基洗三次，得到染色后的肿瘤细胞，以上步骤需避光进 行。
[0126] 3. 3将步骤3. 1的染色后的DC和步骤3. 2的染色后的肿瘤细胞混合，1500rpm离 心lOmin后倾倒上清，不加培养液于38°C孵育4min。沿离心管壁缓慢加入38°C下预热的 PEG2000250 y L，滴加过程中要缓慢的旋转离心管，使细胞和PEG2000充分接触。然后38°C， 孵育4min。缓慢沿管壁加40mL PBS终止融合，1200rpm，离心10min洗涤一遍，加入培养液 含10%胎牛血清的完全DMEM置于37°C，5% C02培养箱内培养24h后收集悬浮细胞，按照 如下方法的双荧光染色法选出融合细胞：检测上述待测细胞悬液中的细胞，步骤1的处于 对数期的IfepG2(GT+)只发出绿色荧光不发出红色荧光，步骤2的成熟DC只发出红色荧光 不发出绿色荧光，二者的融合细胞既能发出红色荧光和又发出绿色荧光，选出既能发出红 色荧光和又发出绿色荧光的融合细胞，将该融合细胞命名为DC/HepG2(GT+)。结果表明，融 合细胞DC/IfepG2 (GT+)出现的百分率为65%。
[0127] 按照上述方法，将处于对数期的IfepG2(GT+)替换为步骤1得到的处于对数期的 HepG2细胞，其他步骤不变，得到IfepG2和DC的融合细胞DC/HepG2。
[0128] 按照上述方法，将处于对数期的IfepG2(GT+)替换为步骤1得到的处于对数期 的HepG2 (pLVX-Puro)，其他步骤不变，得到HepG2 (pLVX-Puro)和DC的融合细胞DC/ IfepG2 (pLVX-Puro)。
[0129] 实施例2、DC/HepG2 (GT+)体外诱导分泌IFN- y的T淋巴细胞的产生
[0130] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0131] 按照下述方法得到DC/HepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞，并用酶联 免疫斑点法（enzyme linked immunospot assay，ELISP0T)进行检测T淋巴细胞分泌的 IFN-丫，所用lXWashing buffer、生物素标记的抗体、酶标亲和素均为Human IFN-gamma precoated ELISP0T kit (Human IFN-gamma precoated ELISP0T kit 为达科为生物技术有 限公司产品，货号为DKW22-1000-048)中的试剂，具体步骤如下：
[0132] 1)取出试剂盒中的孔板，向每孔中加入200 yL不全RIPM 1640培养基，室温静置 5-10分钟，将液体倒掉。
[0133] 2)向每孔均加入用不全RIPM 1640培养基悬浮的实施例1的DC/ IfepG2 (GT+) 3 X 104个和T淋巴细胞3 X 10 5个。每孔100 y L液体量，每组4个复孔。
[0134] 3)孵育：盖好板盖，放入培养箱培养5天，得到DC/HepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- y 的T淋巴细胞。
[0135] 4)裂解步骤3)的DC/HepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- Y的T淋巴细胞：倾倒孔内细 胞及培养基。向每孔中加入200 y L 4°C预冷的去离子水，4°C冰箱放置15分钟低渗裂解细 胞。
[0136] 5)洗板：倾倒培养板内的液体，每次每孔用200 y L 1 XWashing buffer洗涤，共 洗5次，每次停留60-80秒。最后一次，倾倒出培养板内的液体后，将培养板倒扣在吸水纸 上至培养板中无液体。
[0137] 6)检测抗体孵育：将用无菌水按照生物素标记的抗体：无菌水=1:1000的比例稀 释得到的生物素标记的抗体加入培养板的每孔中，每孔100 yL。37°C孵育1小时。
[0138] 7)洗板：倾倒培养板内的液体，加入1 XWashing buffer，每孔200 y L，洗涤5-6 次。每次停留60-80秒。最后一次，在吸水纸上扣干。
[0139] 8)酶联亲和素孵育：将用无菌水按照酶标亲和素：无菌水=1:100的比例稀释得 到的酶标亲和素加入培养板的每孔中，每孔l〇〇yL。37°C孵育1小时。
[0140] 9)洗板：倾倒培养板内的液体，加入1 XWashing buffer，每孔200 y L，洗涤5-6 次。每次停留60-80秒。最后一次，在吸水纸上扣干。
[0141] 10)显色：将新鲜配制的AEC显色液工作液加入各实验孔，每孔100 yL。室温避光 静置15-50分钟。
[0142] 11)终止显色：倾倒培养板内的液体，揭开板底座，用去自来水冲洗培养板正反面 及底座5遍，终止显色。
[0143] 12)板晾干后用CTL仪器设置阈值分析，并记录斑点参数，做统计学分析。
[0144] 按照上述方法，将 DC/IfepG2 (GT+)分别替换为 DC/IfepG2、DC/IfepG2 (pLVX-Puro)、 DC、IfepG2 (GT+)、IfepG2 和 IfepG2 (pLVX-Puro)，分别得到 DC/IfepG2 诱导的 T 淋巴细胞、DC/ IfepG2 (pLVX-Puro)诱导的T淋巴细胞、DC诱导的T淋巴细胞、IfepG2 (GT+)诱导的T淋巴细 胞、HepG2诱导的T淋巴细胞和HepG2 (pLVX-Puro)诱导的T淋巴细胞，及这些T淋巴细胞 分泌的IFN-y的量的酶联免疫斑点检测结果（图3)。
[0145] 结果显示，IfepG2 (GT+)、IfepG2和IfepG2 (pLVX-Puro)体外诱导的T淋巴细胞几 乎不分泌IFN-y ;DCAfepG2诱导的T淋巴细胞分泌的IFN-y的斑点数为225±71. 59个 /3X 105个T淋巴细胞；DC/H印G2 (pLVX-Puro)诱导T淋巴细胞分泌的IFN- y的斑点数为 195. 3±60. 88个/3X 105个T淋巴细胞；DC/H印G2 (GT+)诱导T淋巴细胞分泌的IFN- y的 斑点数为 490. 5±36. 83 个 /3 X 105个 T 淋巴细胞，分别为 DCAfepG2、DCAfepG2 (pLVX-Puro) 的2. 18倍、2. 51倍，并远高于DC诱导T淋巴细胞分泌的IFN-y的斑点数。表明，DC/ IfepG2(GT+)可高效诱导分泌IFN-y的T淋巴细胞的产生。
[0146] 实施例3、融合细胞DC/HepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- Y的T淋巴细胞对肿瘤的治 疗作用
[0147] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0148] 将实施例2的DC/IfepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞、DC/IfepG2诱导 的分泌IFN- y的T淋巴细胞、DC/IfepG2 (pLVX-Puro)诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞、DC 诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞、IfepG2 (GT+)诱导的T淋巴细胞、IfepG2诱导的T淋巴细 胞和IfepG2 (pLVX-Puro)诱导的T淋巴细胞分别悬浮于PBS中，分别得到细胞含量均为105 个/ y L的DC/HepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞悬浮液、DC/IfepG2诱导产生的 分泌IFN- y的T淋巴细胞悬浮液、DC/IfepG2 (pLVX-Puro)诱导的分泌IFN- y的T淋巴细 胞悬浮液、DC诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞悬浮液、HepG2 (GT+)诱导的T淋巴细胞悬浮 液、IfepG2诱导的T淋巴细胞悬浮液和IfepG2 (pLVX-Puro)诱导的T淋巴细胞悬浮液。
[0149] 取20只4-5周龄近交系雌性裸鼠（BALB/c Nude Mice)，每只于右侧腋下皮下接 种5X106个IfepG2肝癌细胞。每周两次测量肿瘤长径和短径，根据公式TV = l/2XaXb2 计算肿瘤体积。待肿瘤平均体积长至约100mm3时，对每只荷瘤BalB/c裸鼠的静脉中注射 100yL DC/IfepG2(GT+)诱导的分泌IFN-y的T淋巴细胞悬浮液（DC/IfepG2(GT+)诱导的分 泌IFN- y的T淋巴细胞悬浮液中T淋巴细胞的含量为107个/100 y L)进行治疗，将第一 次注射记为治疗第0天，分别在治疗第6天、治疗第12天、治疗第18天、治疗第24、治疗第 30天和治疗第36天均注射100 y L上述DC/IfepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞 悬浮液，在每次注射当天的注射前分别测量荷瘤BalB/c裸鼠肿瘤的体积（图3和表1)，从 治疗第1天开始记录每只小鼠的存活时间，统计小鼠的存活率（图3和表2)。
[0150] 按照上述方法，分别将DC/IfepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- Y的T淋巴细胞悬浮液替 换为PBS、DC/IfepG2诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞悬浮液、DC/IfepG2 (pLVX-Puro)诱导的 分泌IFN- y的T淋巴细胞悬浮液、DC诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞悬浮液、IfepG2 (GT+) 诱导的T淋巴细胞悬浮液、IfepG2诱导的T淋巴细胞悬浮液和IfepG2 (pLVX-Puro)诱导的T 淋巴细胞悬浮液，其他步骤均不变，分别得到PBS、DC/HepG2诱导的分泌IFN- y的T淋巴细 胞、DC/IfepG2 (pLVX-Puro)诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞、DC诱导的分泌IFN- y的T淋 巴细胞、H印G2 (GT+)诱导的T淋巴细胞、IfepG2诱导的T淋巴细胞和IfepG2 (pLVX-Puro)诱 导的的T淋巴细胞对肿瘤的治疗效果（图3、表1和表2)。
[0151] 表1、不同细胞诱导的T淋巴细胞治疗肿瘤后肿瘤的体积（mm3)
[0153] 在治疗第36天时，经DC/HepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞治疗后的 肿瘤的体积分别为 PBS 以及 DC/IfepG2、DCAfepG2(pLVX-Puro)、DC、IfepG2、IfepG2(GT+)和 IfepG2 (pLVX-Puro)诱导的 T 淋巴细胞的 0? 320 倍、0? 486 倍、0? 495 倍、0? 575 倍、0? 286 倍、 0? 307 倍、0? 291 倍。
[0154] 结果表明，DC/IfepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞能显著延缓肿 瘤生长，效果明显好于 DC/IfepG2、DCAfepG2(pLVX-Puro)、DC、IfepG2、IfepG2(GT+)和 HepG2(pLVX-Puro)诱导的T淋巴细胞对肿瘤的治疗。
[0155] 表2、荷人肝癌裸鼠在不同的存活率时距第1次治疗的时间（天）
[0156]
[0157] 结果表明，DC/IfepG2(GT+)诱导的分泌IFN-y的T淋巴细胞能明显延长荷人肝 癌裸鼠生存时间：与 PBS 以及 DC/IfepG2、DC/H印G2 (pLVX-Puro)、DC、IfepG2、IfepG2 (GT+)和 IfepG2(pLVX-Pur〇)诱导的T淋巴细胞相比，在荷人肝癌裸鼠的存活率分别为80%、60%、 40%、20%和0时，00/11印62阶+)诱导的分泌正^7的1'淋巴细胞治疗的荷人肝癌裸鼠 距第1次治疗的时间均延长；在荷人肝癌裸鼠的存活率为0时，DC/IfepG2(GT+)诱导的分 泌IFN-y的T淋巴细胞治疗的荷人肝癌裸鼠距第1次治疗的时间分别为DC/IfepG2、DC/ IfepG2(pLVX-Puro)、DC、IfepG2、IfepG2(GT+)和 IfepG2(pLVX-Puro)诱导的 T 淋巴细胞的 1. 12 倍、1. 26倍、1. 18倍、1. 83倍、1. 86倍、1. 87倍。在治疗和观察期间，小鼠均无立毛，食欲下 降，行为活动异常等现象。
[0158] 本申请的DC/HepG2 (GT+)诱导的分泌IFN- y的T淋巴细胞可明显延缓肿瘤的生 长，延长荷人肝癌裸鼠生存时间。
【主权项】
1. 制备融合细胞的方法，其特征在于：所述方法包括将肿瘤细胞和树突状细胞进行融 合得到融合细胞的步骤； 所述肿瘤细胞为Μ或N : Μ、所述肿瘤细胞为表达α 1，3半乳糖转移酶的重组细胞； Ν、所述肿瘤细胞为含有α 1，3半乳糖转移酶相关基因的重组细胞； 所述α 1，3半乳糖转移酶为下述Β1)或Β2)的蛋白质： Β1)氨基酸序列为SEQ ID No. 3的蛋白质； B2)在SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个 氨基酸残基得到的具有所述α 1，3半乳糖转移酶功能的由B1)衍生的蛋白质； 所述α 1，3半乳糖转移酶相关基因由α 1，3半乳糖转移酶基因和名称为GTTI的DNA 分子连接而成； 所述α 1，3半乳糖转移酶基因编码所述α 1，3半乳糖转移酶； 所述GTTI的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 4的第1位-第548位核苷酸。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有α 1，3半乳糖转移酶相关基因 的重组细胞是将所述α 1，3半乳糖转移酶相关基因导入受体肿瘤细胞中得到的重组细胞。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述α 1，3半乳糖转移酶基因为如 下Β11)或Β21)或Β31)所示的核酸分子： Β11)序列表中SEQ ID No. 4的第581位-第1630位核苷酸所示的DNA分子； B21)与B11)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述α 1，3半乳 糖转移酶的cDNA分子或基因组DNA分子； B31)在严格条件下与B11)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述α 1，3半乳糖转移酶的 cDNA分子或基因组DNA分子。4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述α 1，3半乳糖转移酶相关 基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 4的第1位-第1630位核苷酸。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述受体肿瘤细胞为肝癌细胞。6. 权利要求1-5中任一所述的方法得到的融合细胞。7. 权利要求1-4中任一所述的α 1，3半乳糖转移酶相关基因。8. 治疗和/或预防肿瘤药物，其特征在于：所述治疗和/或预防肿瘤药物的活性成分 为下述Η1和/或Η2 : Η1、权利要求6所述的融合细胞； Η2、权利要求6所述融合细胞诱导Τ淋巴细胞得到的分泌IFN- γ的Τ淋巴细胞。9. 下述Ν1或Ν2或Ν3或Ν4的应用： Ν1、权利要求6所述的融合细胞在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用或在制备分 泌IFN- γ的Τ淋巴细胞中的应用； Ν2、权利要求7所述的α 1，3半乳糖转移酶相关基因在制备治疗和/或预防肿瘤药物 中的应用； Ν3、与权利要求1-4中任一所述的α 1，3半乳糖转移酶相关基因相关的生物材料在制 备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用；所述生物材料为下述F1)至F19)中的任一种： F1)含有权利要求1-4中任一所述的α 1，3半乳糖转移酶相关基因的表达盒； F2)含有权利要求1-4中任一所述的α 1，3半乳糖转移酶相关基因的重组载体； F3)含有F1)所述表达盒的重组载体； F4)含有权利要求1-4中任一所述的α 1，3半乳糖转移酶相关基因的重组微生物； F5)含有F1)所述表达盒的重组微生物； F6)含有F2)所述重组载体的重组微生物； F7)含有F3)所述重组载体的重组微生物； F8)含有权利要求1-4中任一所述的α 1，3半乳糖转移酶相关基因的转基因动物细胞 系； F9)含有F1)所述表达盒的转基因动物细胞系； F10)含有F2)所述重组载体的转基因动物细胞系； F11)含有F3)所述重组载体的转基因动物细胞系； F12)含有权利要求1-4中任一所述的α 1，3半乳糖转移酶相关基因的转基因动物组 织； F13)含有F1)所述表达盒的转基因动物组织； F14)含有F2)所述重组载体的转基因动物组织； F15)含有F3)所述重组载体的转基因动物组织； F16)含有权利要求1-4中任一所述的α 1，3半乳糖转移酶相关基因的转基因动物器 官； F17)含有F1)所述表达盒的转基因动物器官； F18)含有F2)所述重组载体的转基因动物器官； F19)含有F3)所述重组载体的转基因动物器官。 Ν4、权利要求6所述融合细胞诱导Τ淋巴细胞得到的分泌IFN- γ的Τ淋巴细胞在制备 治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。10.下述Ρ1)-Ρ5)中任一种治疗和/或预防肿瘤药物： Ρ1)、利用权利要求7所述的α 1，3半乳糖转移酶相关基因制备的治疗和/或预防肿瘤 药物； Ρ2)、利用权利要求9所述的生物材料制备的治疗和/或预防肿瘤药物； Ρ3)、利用权利要求6所述的融合细胞制备的治疗和/或预防肿瘤药物； Ρ4)、利用权利要求1或2所述的含有α 1，3半乳糖转移酶相关基因的肿瘤细胞制备的 治疗和/或预防肿瘤药物； Ρ5)、利用权利要求6所述融合细胞诱导Τ淋巴细胞得到的分泌IFN- γ的Τ淋巴细胞 的制备治疗和/或预防肿瘤药物。
【文档编号】A61K35/17GK105821030SQ201510001123
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月4日
【发明人】彭霞, 卢小玲, 陈玥
【申请人】彭霞, 赵永祥