Cik细胞培养基及其应用

Cik细胞培养基及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及一种CIK细胞培养基及其应用。
【背景技术】
[0002] 细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，弥补了传 统的手术、放疗、化疗的弊端，已经被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有 发展前途的一种治疗手段，也是世界目前唯一有希望完全消灭肿瘤细胞的治疗手段。免疫 细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋己细胞、树突状细胞、单核/巨隧 细胞、粒细胞、肥大细胞等。
[0003] CIK(巧tokine-induced killer，中文名：[自体细胞免疫疗法]多种细胞因子诱导 的杀伤细胞)是单个核细胞在抗CD3单克隆抗体和多种细胞因子的作用下培养获得的一群 异质细胞群，其中CD3+，CD56+淋己细胞是主要效应细胞。CIK可直接杀伤肿瘤细胞和病毒感 染细胞;诱导肿瘤细胞调亡;通过释放大量炎性细胞因子抑制或杀伤肿瘤细胞。CIK细胞具 有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前 体细胞细胞毒性小等特点，是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强，适合临床应用的一种理想 的效应细胞，但运种效应细胞在正常外周血中极其少见，仅为1 %~5%。由此可见，就免疫 细胞治疗来说，如何获得足够数量的、免疫活性强的效应细胞是保证治疗效果的必备条件。
[0004] CIK细胞能通过体外诱导而大量增殖，常规的CIK制备方法是将分离的外周血单个 核细胞加入培养液中，通过添加细胞生长因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的CIK细 胞，但最终获得的CD3+和CD56 乂 IK细胞数量及杀伤活性都不够理想。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中CIK细胞培养基存在扩增效率差， 细胞杀伤活性低等缺陷，提供一种能够提高CIK细胞扩增效率、尤其是提高CD3+和CD56乂IK 细胞数量，提高杀伤活性的CIK细胞培养基。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种CIK细胞培养基，包括PPP、 比-2、比-12、比-27和无血清基础培养基。
[0007] 在本发明提供的CIK细胞培养基中，所述无血清基础培养基为AIM-V培养基。
[000引在本发明提供的CIK细胞培养基中，所述无血清基础培养基中，PPP的体积分数为3 ~5%，化-2的浓度为800~1200IU/ml，比-12的浓度为800~1200IU/ml，比-27的浓度为5~ 30ng/mlO
[0009] 在本发明提供的CIK细胞培养基中，所述无血清基础培养基中，化-27的浓度为15 ~25n邑/ml。
[0010] 在本发明提供的CIK细胞培养基中，所述无血清基础培养基中，PPP的体积分数为 4%，比-2的浓度为lOOOIU/ml，比-12的浓度为lOOOIU/ml，比-27的浓度为18ng/ml。
[0011] 本发明进一步保护上述的CIK细胞培养基在CIK细胞培养过程中的应用。
[0012]实施本发明提供的CIK细胞培养基，可W达到W下有益效果:采用化-27联合化-2 和IL-12,不仅能够降低大剂量细胞因子带来的毒副作用，而且能够提高CIK的扩增率，尤其 是CD3+和CD56 乂 IK细胞，提高其杀伤活性。
【具体实施方式】
[0013] 本发明提供的CIK细胞培养基，包括PPP^oor Platelet Plasma,乏血小板血浆）、 IL-2(Interleukin,白介素2)、IL-12(Interleukin,白介素12)和IL-27(Interleukin,白介 素27);优选地，无血清基础培养基为AIM-V培养基，购于美国Gibco公司。
[0014] 其中，白细胞介素-27,能够显著促进CIK细胞的增殖，并能够诱导初始CD4+T细胞 表达IL-12的受体，使其获得对IL-12的反应性，化-27协同IL-12诱导T淋己细胞产生IFN-丫。
[0015] IFN-丫是由一族具有多种功能的多肤分子组成，具有抑制病毒复制、抑制肿瘤生 长和免疫调节等作用，在机体细胞免疫及体液免疫中发挥重要的作用。IFN-丫能够诱导单 核细胞释放细胞因子IL-12从而激活T细胞表达高亲和性IL-2R，促进CIK细胞的增殖。
[0016] 而IL-27联合IL-2能够明显促进CIK细胞成熟，缩短CIK细胞培养周期，提高CIK细 胞杀伤能力，促进CIK细胞IFN-丫水平高表达和TNFa(Tumo;r化crosis Factor,肿瘤坏死因 子-a)的表达水平。
[0017] 综上，比-27联合IL-12和IL-2培养一方面能够降低大剂量细胞因子带来的毒副作 用，另一方面可获得足够数量和功能的CIK细胞，尤其是CD3+和CD56乂IK细胞；同时，能够降 低细胞因子的使用剂量。
[0018] PPP能够为细胞提供一定的营养支持，且能够提高CIK细胞的扩增率及成熟度，提 高CIK细胞的活性。
[0019] 优选地，在无血清基础培养基中，PPP的体积分数为3~5%，化-2的浓度为800~ 1200IU/ml，比-12的浓度为800~1200IU/ml，化-27的浓度为5~30ng/ml;更为优选地，化-27的浓度为15~25ng/ml。
[0020] 进一步地，本发明提供的CIK细胞培养基在培养CIK细胞过程中的应用，包括W下 步骤
[0021] Sl、获取单个核细胞；
[0022] S2、用CIK细胞诱导剂对单个核细胞进行诱导培养18~36小时，至收获原代CIK细 胞；
[0023] 其中，CIK细胞诱导剂包括IFN-丫（Interferon-丫，丫干扰素）、抗CD3单抗和IL-I曰 (Interle址in，白介素化）；优选地，诱导剂A中，IFN-丫的浓度为800~1200IU/ml，抗CD3单 抗的浓度为10-150ng/ml，比-化的浓度为10-50μg/ml;
[0024] S3、采用本发明提供的CIK细胞培养基对原代CIK细胞进行体外扩增培养7~21天， 每2~3天补加 CIK细胞培养基，W保持CIK细胞培养基中PPP、IL-2、比-12和IL-27浓度不变。
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用W解释本发明，并不用于限 定本发明。
[00%] 实施例1
[0027]本发明提供的CIK细胞培养基，包括W下步骤：
[002引Sla、从外周血中分离出单个核细胞；
[0029] Slla、无菌条件采集健康志愿者外周血20ml，肝素抗凝，在GMP洁净实验室中，20 °C，离屯、1000 g X IOmin，吸取上层血浆置于另一无菌50ml离屯、管中，血浆离屯、后56°C水浴箱 中放置30min备用，加入D-PBS缓冲液与血细胞层Wl: 1的比例稀释，吹打混匀。
[0030] S12a、采用Ficoll密度梯度离屯、法分离人外周血单个核细胞；
[0031] 用两支50ml离屯、管分别装25ml的淋己细胞分离液，用无菌移液管缓慢沿离屯、管管 壁将稀释后的血液加至淋己细胞分离液上层，形成明显的界面，稀释血液与淋己细胞分离 液的体积比例为1:1。
[0032] S13a、高速低溫离屯、机，20°C，离屯、，SOOg X 30min;
[0033] S14a、离屯、后离屯、管中液体被分为四层，由下到上分别是红细胞层、淋己细胞分离 液层、白膜层和血浆层。外周血单个核细胞即位于白膜层，用无菌移液管将此层移入至另一 支50ml无菌离屯、管中。
[0034] S 15a、洗涂白膜层细胞S次，用D-PBS溶液加满到50ml，充分混匀白膜层细胞，20 °C，离屯、：1000 g X IOmin，弃去上清液，获得外周血单个核细胞，重复洗涂S次。
[0035] S16a、离屯、洗涂后，吸掉上清液，用GT-T551培养基将细胞吹打混匀，吸出少量细胞 进行计数，调整细胞浓度为1 X IO6个/ml，种植于被CD3-Ab和FN包被的175cm培养瓶中，加入 适量分离的自体血清，用于CIK细胞体外诱导培养。
[0036] S2a、将外周血单个核细胞进行诱导培养至转化成CIK细胞；
[0037] 将步骤Sla中获得的单个核细胞重悬于AIM-V培养基中，并加入CIK细胞诱导剂，置 于37°C、5%C02培养箱中培养24小时;其中CIK细胞诱导剂中，IFN-丫的浓度为lOOOIU/ml， 抗CD3单抗的浓度为80ng/ml，比-化的浓度为30iig/ml;
[0038] S3a、对CIK细胞进行体外扩增培养；
[0039] 向CIK细胞中添加本发明提供的CIK细胞培养基，其中，AIM-V培养基中，PPP的体积 分数为4%、比-2的浓度为lOOOIU/ml、比-12的浓度为lOOOIU/m巧日化-27的浓度为18ng/ml， 每2~3天补加含有PPP、IL-2、比-12和IL-27的新鲜CIK细胞培养基，培养21天。
[0040] 其中，PPP的获取过程为:取100mL抗凝处理后的外周血，将外周血分别加入到4个 50ml的无菌离屯、管中，300g离屯、lOmin，将所有的上层血浆转移到2个新的无菌离屯、管中，56 °C水浴灭活30min，再于400g离屯、IOmin后，收集上层黄色液体即PPP，4°C储存备用。
[0041 ] 实施例2
[0042] 与实施例1的不同之处在于，该实施例中，所采用的CIK细胞培养基的成分为：
[0043] AIM-V培养基、PPP的体积分数为3 %，化-2的浓度为800IU/ml，化-12的浓度为 800IU/ml，比-27的浓度为5ng/ml。
[0044] 实施例3
[0045] 与实施例1的不同之处在于，该实施例中，所采用的CIK细胞培养基的成分为：
[0046] AIM-V培养基、PPP的体积分数为5%，化-2的浓度为1200IU/ml，化-12的浓度为 1200IU/ml，比-27的浓度为30ng/ml。
[0047] 实施例4
[0048] 与实施例1的不同之处在于，该实施例中，所采用的CIK细胞培养基的成分为：
[0049] AIM-V培养基、PPP的体积分数为4%，化-2的浓度为lOOOIU/ml，化-12的浓度为 lOOOIU/ml，比-27的浓度为 15ng/ml。
[00加]实施例5
[0051]与实施例1的不同之处在于，该实施例中，所采用的CIK细胞培养基的成分为：
[0052] AIM-V培养基、PPP的体积分数为4%，化-2的浓度为lOOOIU/ml，化-12的浓度为 lOOOIU/ml，比-27的浓度为25ng/ml。
[0053] 为进一步验证本发明提供的微囊化免疫细胞冻存和复苏方法具有显著的有益效 果，设置W下实验进行验证。
[0054] 检测组1~5-分别对应本发明实施例1~5获得的扩增后的CIK细胞；
[0055] 对照组一通过现有CIK细胞培养基所获得的CIK细胞，具体为:将采集的外周血单 个核细胞用无血清基础培养基调整浓度为1 X IO6UAil，第1天加入lOOOU/ml的IFN- 丫；
[0056] 随后将培养液置于37°C，(X)2浓度为5%，湿度为100%的恒溫培养箱中培养24小 时；随后加入IL-la、IL-2W及CD3单抗，使得IL-Ia、化-2W及CD3单抗在培养基中的终浓度 分别为300U/ml、lOOOU/ml W及500U/ml;
[0057] 接着继续在37°C，0)2浓度为5%，湿度为100%的恒溫培养箱中培养，每隔3天添加 培养基，使细胞浓度保持在1 X IO6IVml，化-Ia W及CD3单抗的浓度分别保持在300U/ml、 lOOOU/mlW 及 500U/ml。
[0058] I、细胞增殖倍数的测定
[0059] 将取得的CIK细胞用台吩蓝染色后再用血细胞计数器进行计数，将当前的细胞总 数除W培养前的单个核细胞数，数值即为细胞的扩增倍数。用此方法可W动态观察细胞的 增殖状况，具体情况见表1。
[0060] 表 1 FOOAI1

[0062] 检测结果:结果显示，随着培养时间的延长，两组细胞的增长倍数都在提高，但检 测组1~5在每个时间节点上的增长倍数都大幅高于检测组，且两组细胞的扩增倍数都在21 天达到最高峰。
[0063] 2、细胞间表型分析比较
[0064] 分别在第0、7、14、21天取两组CIK细胞，制成细胞悬液，洗涂后调整细胞浓度为IX 10抓/ml,加入标记的单克隆抗体，于室溫暗处解育15分钟，洗去多余抗体，用上流式细胞仪 检测，结果见表2.
[00化]表2
[0OAA1
[(

[0068] 检测结果:随着培养时间的延长，两组细胞中的CD3+细胞及CD3+CD56+细胞的比例 都在增加，且两者之间的差异没有统计学意义;两组细胞中的CD3+CD4+细胞比例随着时间 延长而降低，从第7天开始，两组间的差异有统计学意义;两组细胞中的CD3+CD56+细胞比例 方面，检测组在每个时间节点均高于对照组，且差异有统计学意义(P<〇.01)。运表明两种 方法都可W大幅提高CD+细胞的比例，但在CIK细胞中的CD3+CD56+细胞比例方面，检测组要 明显优于对照组。
[0069] 3、MTT法测试两组细胞体外杀伤活性
[0070] 取对数生长期的K562肿瘤细胞株，重悬细胞浓度为1 X IO5个/ml，5 X IO4个/ml，2.5 X IO4个/ml,每孔100山铺于96孔平地板中，置于37°C，C02浓度为5%，湿度为100%的恒溫培 养箱中培养24小时待用；
[0071 ]将培养14天的两组CIK细胞重悬为1 X IO6个/ml，加入前述96孔板中，使效祀比为 10:1、20:1W及40:1，每个浓度各设4个复孔，并设未与肿瘤细胞反应的两组CIK细胞为效应 细胞空白对照，共培养48小时后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4小时后，离屯、 弃上清，每孔加入DMSO 10化1，于570nm处测定吸光度数值，计算杀伤率，杀伤率计算公式： 杀伤率=【1-(试验孔A值-效应细胞A值)/祀细胞对照孔A值】X 100 %
[0072] 表 3
[0073]

[00741
[0075] 检测结果:在不同的效祀比作用下，检测组对肿瘤细胞株的杀伤率均高于对照组， 不同效祀比之间的差异有统计学意义，在不同效祀比条件下，实验组的杀伤率明显优于对 照组，差异有统计学意义。
[0076] W上对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方 式，上述的【具体实施方式】仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发 明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，运 些均属于本发明的保护之内。
【主权项】
1. 一种CIK细胞培养基，其特征在于，包括PPP、IL-2、IL-12、IL-27和无血清基础培养 基。2. 根据权利要求1所述的CIK细胞培养基，其特征在于，所述无血清基础培养基为AIM-V 培养基。3. 根据权利要求2所述的CIK细胞培养基，其特征在于，所述无血清基础培养基中，PPP 的体积分数为3~5%，IL-2的浓度为800~1200IU/ml，IL-12的浓度为800~1200IU/ml，IL-27的浓度为5~30ng/ml。4. 根据权利要求3所述的CIK细胞培养基，其特征在于，所述无血清基础培养基中，PPP 的体积分数为4%，IL-2的浓度为1000IU/ml，IL-12的浓度为1000IU/ml，IL-27的浓度为 18ng/ml〇5. 根据权利要求3所述的CIK细胞培养基，其特征在于，所述无血清基础培养基中，PPP 的体积分数为3%，IL-2的浓度为800IU/ml，IL-12的浓度为800IU/ml，IL-27的浓度为5ng/ ml 〇6. 根据权利要求3所述的CIK细胞培养基，其特征在于，所述无血清基础培养基中，PPP 的体积分数为5%，IL-2的浓度为1200IU/ml，IL-12的浓度为1200IU/ml，IL-27的浓度为 30ng/ml〇7. 根据权利要求3所述的CIK细胞培养基，其特征在于，所述无血清基础培养基中，IL-27 的浓度为 15 ~ 25ng/ml。8. 根据权利要求7所述的CIK细胞培养基，其特征在于，所述无血清基础培养基中，IL-27 的浓度为 15ng/ml。9. 根据权利要求8所述的CIK细胞培养基，其特征在于，所述无血清基础培养基中，IL-27 的浓度为 25ng/ml。10. -种如权利要求1~9任一项所述的CIK细胞培养基在CIK细胞培养过程中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种CIK细胞培养基，一种CIK细胞培养基，其特征在于，包括PPP、IL-2、IL-12、IL-27和无血清基础培养基。采用IL-27联合IL-2和IL-12，不仅能够降低大剂量细胞因子带来的毒副作用，而且能够提高CIK的扩增率，尤其是CD3+和CD56+CIK细胞，提高其杀伤活性。
【IPC分类】C12N5/0783
【公开号】CN105713876
【申请号】CN201610185670
【发明人】曾宪卓, 曾明哲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司