Cik细胞培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物科学技术领域，尤其是一种CIK细胞培养方法。
【背景技术】
[0002] 随着肿瘤免疫学的发展，越来越多的研究表明，杀伤细胞过继免疫治疗对于消除 残留的肿瘤病灶、促进患者免疫系统的重建具有良好的效果，并逐步成为化学治疗和造血 干细胞移植后清除残留肿瘤细胞的重要治疗手段。CIK细胞是1991年schmidt wolf等 报道的一类由多种细胞因子诱导的杀伤免疫活性细胞CIK细胞表面同时表达有CD3+分子 和CD56+分子，所以兼有T淋巴细胞较强大的抗肿瘤活性和自然杀伤细胞的非主要组织相 容性复合物限制性(MHC)杀瘤优点，其效应细胞为CD3+CD56+细胞，是具有不同特异性的T 细胞受体的异质群体，具有非MHC限制的溶细胞活性对肿瘤细胞。 CIK细胞是一群来源于血液T细胞的异质性细胞群体，通过穿孔素和颗粒酶介导的细 胞毒作用和增强IL-12、IFN-γ等细胞因子的作用来杀伤肿瘤细胞。 于1991年建立的由IL-l、IL-2、IFN-y、Anti-CD3Ab等细胞因子组成的"经典"的CIK 扩增方案目前已被全球众多的研究者所采纳。近年以此为基础，一些其他的细胞因子也开 始被尝试用于扩增CIK细胞，如Anti-CD28、IL-15、IL-24、SCF、FLT3L等。 白细胞介素15 (IL-15)的生物学作用与IL-2相似，是维持和促进效应T淋巴细胞 的增殖的细胞因子，研究总结了 IL-15生物学特性：诱导T、B和自然杀伤（NK)细胞的分 化和增殖；增强⑶8+T细胞的细胞溶解活性；诱导产生持久的抗原刺激⑶8+⑶44hi记 忆性T细胞；刺激B细胞的分化和免疫球蛋白的合成；诱导树突状细胞的成熟，但无刺激 免疫调节性T细胞（Treg细胞）活性。另有研究表明，IL-15在机体内自身也具有强大的 抗肿瘤作用，而不需要通过NK细胞和CD8+细胞介导。 IL-21是IL-2细胞因子家族最新发现的成员，分子结构与IL-15相似，参与调节 B细胞增殖，协同IL-15促进骨髓前体细胞增殖和NK细胞增殖、分化和细胞毒活性，由 活化的⑶4+T细胞分泌，利用携带IL-21基因的慢病毒转染至CIKs细胞内，可以增加 CIK细胞IL-21R、穿孔素、颗粒酶B、FasL、IFN-γ及TNF-α的分泌及表达，主要是激活 JAK-STAT信号转导途径来提高CIK细胞的抗白血病活性。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是：提供一种CIK细胞培养方法，它的细胞扩增比例高，成本低廉， 稳定性好。 本发明是这样实现的：CIK细胞培养方法，从已经取得的外周血100mL中，用生理盐 水悬浮的方式分离出单个核细胞，并种植于T75培养瓶中，加入20mlA頂-V培养基，再加 1000u/ml IFN- γ，在体积浓度为5%的C02, 37°C下的恒温培养箱培养24小时；再加IOOng/ ml单克隆抗体CD3及500u/ml IL-2，继续培养3-5天；每隔2天补加500u/ml IL-2,同 时加 50ng/ml 的 IL-15,或加 100ng/ml 的 IL-21，或加 25ng/ml 的 IL-15 及 50ng/ml 的 IL-21 ;扩增至第10天收获CIK细胞。 所述的培养过程中，每隔2天倍加换液，半量种入新T175培养瓶中，并全量补充上述细 胞因子。 由于采用了以上技术方案，本发明采用新因子体系进行CIK细胞培养，细胞扩增比例 超过使用传统扩增方法所获得的比例，且因子的使用量较小，降低了细胞培养成本，增加了 培养效果的稳定性。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。 【附图说明】， 图1不同细胞因子对外周血T淋巴细胞增殖作用， 【具体实施方式】， 本发明的实施例1 :CIK细胞培养方法， 1、 分离外周血单个核细胞（PBMC )， 用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从已获取的外周血中分离出PBMC，加同外周血 同体积生理盐水1:1混合，取出稀释血缓慢加入含有15ml Ficoll-Hypaque (葡聚糖一泛 影葡胺）的50ml离心管中（将离心管倾斜45°，在Ficoll-Hypaque液面以上Icm处缓 慢加入，注意不要打乱液面界面，两者比例为1:1，将离心机温度设为室温，加速度为最低， 2000rpm离心18min)，用枪头轻轻插入到单个核细胞层(一薄层白膜)，沿着管壁小心地准 确吸取该层细胞转移到另一支50ml离心管中；加入生理盐水定容至45ml，轻轻吹匀细 胞，离心洗涤2次，除去血小板和分离介质。 2、 CIK细胞的体外诱导和扩增， 第0天，生理盐水悬浮的分离出PBMC，再用CIK初始培养液调整细胞浓度为5X IO5 cell /ml，种植于 24 孔板中，每孔 200ul，加 RPMI1640 培养液，加 1000u/ml IFN-γ， 5%C02、37°C恒温培养箱中培养；24小时后加 100ng/ml多克隆抗体CD3及500u/ml IL-2 ;培养4天后调整细胞浓度为lX106cell/ml，每隔2天补加 500u/ml IL-2 (对照组)， 同时 IL-15 组加 50ng/ml 的 IL-15, IL-21 组加 100ng/ml 的 IL-21，IL-15+IL-21 组 加入25ng/ml的IL-15和50ng/ml的IL-21;每隔2天倍加换液，半量种入新T175培养 瓶中，并全量补充上述细胞因子；每次补液前细胞计数板计数，照此法扩增至第10天收获 CIK细胞。 苔盼蓝血球计数板细胞计数法， 用生理盐水吹打均匀的CIK细胞，吸出少量细胞悬液加入I. 5mlEP管中，用移液枪吸出 20ul加入新EP管中，再取20ul0. 2%苔盼蓝混合吹打3次。再用移液枪吸取20ul混合液注 入细胞计数板，将细胞计数板插入细胞计数仪中，记录细胞总数、活细胞数及细胞活率。 3、 流式细胞仪检测细胞表型， DCIK细胞培养第10天时，24孔板每孔细胞用枪头吹打均匀后，分别收集至15ml 离心管中混匀，编号对照组、IL-15组、IL-21及联合组； 2) 分别取50ul至1.5ml EP管中，在管底部分别加入IOul PerCP-CD3/ FITC-CD4/ PE-⑶8三色直标荧光抗体、2. 5ul APC-⑶56直标荧光抗体及PBS缓冲液使反应体系为 IOOul ； 3) 常温避光孵育20min; 4) lml过滤后的PBS缓冲液或鞘液洗2次，以去除未结合的抗体，1500g离心5min， 每次离心后小心吸取上清。上机进行细胞表型检测。 4、CIK细胞的增殖， 在CIK细胞培养的第1-2天，细胞增殖活化尚不明显，且细胞浓度有所下降。 在加入E-2 (对照组)及E-15UL-21 (实验组)后细胞开始明显活化增殖，光镜下可 见细胞悬浮成簇、成团增长，细胞培养的第10天时， 〇11(细胞活力达90%以上；(：11(细胞数量的对照组（7.83±1.18)\105，11^15组 (26.0±9.86)父105/1111，11^-21组（14.58±1.81)\105/1111，联合组（11.53±1.70)\10 5/ ml，CIK细胞培养10天计数实验组细胞数均高于对照组细胞数，差异有统计学意义 (?〈0.05)，且11^-15组高于11^-21组及联合组（？〈0.05)，几-21组高于联合组 表1不同细胞因子对外周血T淋巴细胞增殖作用（IOVmlx ±s)
图1中，*与对照组相比，P〈0. 05， 单纯IL-15、IL-21及两者联合体外培养诱导CIK细胞时，均能提高细胞数量，同时 在单纯IL-15较IL-21及联合对CIK细胞增殖作用有更大的优势（P〈0. 05)，单纯IL-21 扩增CIK细胞作用优于两者联合（P〈0. 05)。 结论， (1)IL-15、IL-21单独及联合应用均能促进CIK细胞的增殖，且IL-15对CIK细胞 体外培养的增殖作用优于IL-21和两者联合。 本发明所述并不限于【具体实施方式】中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明的技 术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。显然本领域的技术人员可 以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些 修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术范围内，则本发明也意图包含这些改动和变 型在内。
【主权项】
1. 一种CIK细胞培养方法，其特征在于：从已经取得的外周血100mL中，用生理盐水悬 浮的方式分离出单个核细胞，并种植于T75培养瓶中，加入20mlA頂-V培养基，再加1000 u/ ml IFN- y，在体积浓度为5%的C02, 37°C下的恒温培养箱培养24小时；再加lOOng/ml单 克隆抗体⑶3及500u/ml IL-2，继续培养3-5天；每隔2天补加500u/ml IL-2,同时 加 50ng/ml 的 IL-15,或加 100ng/ml 的 IL-21，或加 25ng/ml 的 IL-15 及 50ng/ml 的 IL-21 ;扩增至第10天收获CIK细胞。2. 根据权利要求1所述的CIK细胞培养方法，其特征在于：所述的培养过程中，每隔2 天倍加换液，半量种入新T175培养瓶中，并全量补充上述细胞因子。
【专利摘要】本发明提供了一种CIK细胞培养方法。本发明采用新因子体系进行CIK细胞培养，细胞扩增比例超过使用传统扩增方法所获得的比例，且因子的使用量较小，降低了细胞培养成本，增加了培养效果的稳定性。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。
【IPC分类】C12N5/0783
【公开号】CN105018423
【申请号】CN201510277069
【发明人】边曙光
【申请人】贵州北科泛特尔生物科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年5月27日