一种cik细胞的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种CIK细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002] CIK细胞（cytokineinducedkiller，细胞因子诱导的杀伤细胞）是一种新型 的免疫活性细胞，它是自体外周血单个核细胞，经多种细胞因子共同诱导培养产生的一类 CD3+和CD56+两种膜蛋白分子共同表达的杀伤细胞。CIK细胞具有抗肿瘤活性和非MHC杀 瘤特性，是一种具有增殖速度快，杀瘤活性高，杀瘤谱广等特点的效应细胞。
[0003] 树突状细胞（Dendriticcells，DC)是体内功能最强的抗原递呈细胞（Antigen presentingcell,APC)，是唯一能够刺激初始T淋巴细胞成熟的APC，能够将抗原递呈给 ⑶8+T淋巴细胞，从而发挥T淋巴细胞的杀伤作用。
[0004] 由于肿瘤是低免疫原性的疾病，故机体中的初始T细胞不能有效的识别和杀伤肿 瘤细胞，即肿瘤抗原不被DC递呈就不能有效识别和诱导出抗肿瘤免疫。DC可递呈丰富的肿 瘤抗原肽占据相应的T细胞受体，并通过分泌协同刺激分子、趋化因子，激活、聚集和增强 T细胞，产生对肿瘤细胞具有特异性作用的细胞毒性T细胞，诱导免疫应答，杀掉肿瘤细胞； 同时分泌大量的白细胞介素-12 (IL-12)增强杀伤肿瘤细胞的作用。
[0005] CIK细胞和DC共培养能显著增加树突状细胞和共刺激分子递呈抗原的特异性。此 外，两者共培养还能促进树突状细胞IL-12的分泌和CIK细胞的毒性，而IL-12摄取阻断 则会减弱CIK细胞的细胞毒性。因此，将CIK细胞和DC联合起来治疗恶性肿瘤，有助于解 决部分肿瘤患者的T细胞的免疫无能，从而发挥协同抗肿瘤作用。基于这些优点，现有技 术常常将DC和CIK细胞共培养，以其增强CIK细胞的细胞毒性，杀伤肿瘤细胞。例如专利 CN104357394A公开了一种自体外周血淋巴细胞DC-CIK的培养方法，专利CN103642754A公 开了一种高毒性、高增殖能力的人D-CIK细胞的制备方法，专利CN104450616A公开了一种 DC细胞与CIK细胞的共培养方法。
[0006] DC细胞虽然可以促进CIK细胞的增殖及杀伤活性，但是DC细胞必须经过体外的扩 增培养，且扩增的效果还不是很理想，扩增能力较差。且DC细胞的扩增体系需用到多种细 胞因子，甚至有的现有方法还加入了某些单抗，造成了DC和CIK细胞共培养方法的复杂程 度和成本。
[0007] 更为重要的一点，现有的方法所培养的CIK细胞杀伤活性、效应细胞比例 (⑶3+⑶56+)普遍不高，同时分泌IL-2、IFN-γ细胞因子的能力也不理想。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种CIK细胞的培养方法，使得所述方法更加 简便有效，无需进行体外扩增培养和添加多种细胞因子和单抗，同时保证CIK细胞的增殖 及杀伤活性较高，成本较低。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种CIK细胞的培养方法，使得所述方法显著提高 培养出的CIK细胞中的效应细胞（CD3+CD56+)数量。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供一种CIK细胞的培养方法，使得所述方法显著提高 诱导培养出的CIK细胞的杀伤活性。
[0011] 本发明的另一个目的在于提供一种CIK细胞的诱导培养方法，使得所述方法提高 培养出的CIK细胞分泌IL-2、IFN-γ的能力。
[0012] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0013] -种CIK细胞的培养方法，包括：
[0014] 步骤1、将Β细胞用含有Flt3因子和IL-2的免疫细胞培养基重悬，然后加入肿瘤 抗原刺激B细胞；
[0015] 步骤2、将CIK细胞和步骤1的经过肿瘤抗原刺激后的B细胞共培养，并补加含 IL-2的免疫细胞培养基共培养，定期补充含IL-2的免疫细胞培养基。
[0016] 本发明针对现有DC和CIK细胞共培养的缺点，选择B淋巴细胞替代DC和CIK细 胞进行共培养。B淋巴细胞，即骨髓依赖性淋巴细胞，亦可简称B细胞，是体内唯一可以产 生抗体的细胞。在外周血中占淋巴细胞总数的10%-15%。在抗原的刺激下，B淋巴细胞 被激活、增殖，产生抗体，介导特异性体液免疫应答；同时，B淋巴细胞还具有免疫调节的功 能，它可以通过分泌细胞因子参与调节巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞以及T细胞的功能。 另外活化的B淋巴细胞还具有加工和提呈抗原的作用。
[0017] 本发明中B细胞从单个核细胞分选出后无须像DC那样进行体外扩增培养，也不需 要添加很多种的细胞因子和单抗，仅需加培养基重悬后用肿瘤抗原刺激即可以和CIK细胞 共培养，降低了培养方法的复杂程度以及成本，同时保证了CIK细胞增殖及杀伤活性不低 于DC和CIK细胞共培养的效果。
[0018] 其中，本发明所采用B细胞可以通过现有任何常规方法收集获得，本发明提供由 单个核细胞通过CD19分选试剂盒分选出的优选方案，所述CD19分选试剂盒为市售产品， 是用来将B淋巴细胞从外周血或脐血的单个核细胞中分选出来的一类产品，可购自于STEM CELL公司。同时，对于CIK细胞的诱导培养也可采用常规方法，本发明提供CIK细胞由单个 核细胞诱导培养获得的优选方法，作为进一步的优选：
[0019] 将单个核细胞用X-VIV0 15培养基重悬，按照1X106-2X106/ml的密度接种在细 胞培养瓶中，并加入500-1500U/mLIFN-λ，在37°C、5%二氧化碳的培养箱诱导培养CIK细 胞；
[0020] 第 2 天补加 50-150U/mL的IL-1a、10-50ng/ml的 0KT-3 以及 100-1000U/ml的 IL-2溶液继续培养，整个CIK细胞的诱导培养过程为14天。其中，所述IFN-λ浓度在本发 明的一些【具体实施方式】中可以选择为500U000或1500U/mLIFN-λ，而IL-la可以选择 为 50、100 或 150U/mL，0KT-3 可以选择为 10、30 或 50ng/ml，IL-2 可以选择为 100、550 或 1000U/ml〇
[0021] 在上述获得B细胞和CIK细胞的方案中，单个核细胞的分离可参照本领域已有的 分离方法，本发明提供优选地的方案：
[0022] 外周血离心收集下层血细胞加生理盐水稀释，加入淋巴分离液后离心，弃上层液 体，加水生理盐水洗涤，再次离心后去上清，获得单个核细胞。
[0023] 作为优选，步骤1为：
[0024] 将B细胞用含有Flt3因子和IL-2的免疫细胞培养基重悬并在5%的二氧化碳浓 度，95%的湿度的37°C培养箱中维持培养1天，然后加入肿瘤抗原刺激B细胞36-48h。
[0025]作为更优选地，步骤1所述Flt3因子的浓度为10-20ng/ml，IL-2的浓度为 10-50U/ml。在本发明的一些【具体实施方式】中，所述Flt3因子的浓度可以为10、15或20ng/ ml，而IL-2 的浓度可以为 10、20、30、40 或 50U/ml。
[0026] 作为优选，步骤2所述CIK细胞和B细胞的体积比为10:1;
[0027] 作为优选，步骤2所述共培养为在在5%的二氧化碳浓度，95%的湿度的37°C培养 箱中共培养14天；
[0028] 作为优选，步骤2所述共培养中CIK细胞密度为1 X 106/ml;
[0029] 作为优选，步骤2所述IL-2浓度为100-1000U/ml;在本发明的一些【具体实施方式】 中，所述IL-2 浓度可以为 100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000U/ml。
[0030] 作为优选，所述免疫细胞培养基为X-VIV0 15培养基。
[0031] 按照本发明所述培养方法培养的CIK细胞经流式细胞仪检测其表面的抗原标志 物，如⑶3和⑶56。⑶3+⑶56+为CIK细胞中的效应细胞，CIK细胞是一群异质的细胞群， 其CD3+CD56+双阳性表达的细胞越多，其杀伤活性会更好。结果显示，本发明CIK细胞中 ⑶3+⑶56+效应细胞比例为29. 6%，而现有技术方法的比例为16. 6%。
[0032] 此外，对K562细胞的杀伤性检测结果显示，本发明所培养的CIK细胞杀伤活性为 显著高于现有技术方法培养的CIK细胞。同时在CIK细胞分泌IL-2、IFN-γ的能力方面也 有提尚。
[0033] 基于上述试验结果，本发明提供了Β细胞在培养CIK细胞中的应用。
[0034] 由以上技术方案可知，本发明选择Β淋巴细胞替代传统的DC作为和CIK细胞共培 养的细胞，通过B细胞和CIK细胞之间的相互作用促进CIK细胞增殖和杀伤活性的提高，同 时又避免了DC体外扩增培养和添加多种细胞因子和抗体的复杂操作，整体工艺得到简化， 相比现有方法更加具有优势。
【附图说明】
[0035] 图1所示为CIK细胞的流式检测结果，其中A表示现有技术方法的CIK细胞流式 检测结果，B表示本发明所述方法的流式检测结果；
[0036] 图2所示为IFN-γ标准品的吸光度值；
[0037] 图3所示为IL-2标准品的吸光度值。
【具体实施方式】
[0038] 本发明实施例公开了一种CIK细胞的培养方法。本领域技术人员可以借鉴本文内 容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员 来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行 了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的产品及方法进 行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0039] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种CIK细胞的培养方