逆转动物细胞中多种抗性的方法

专利名称：逆转动物细胞中多种抗性的方法
逆转动物细胞中多种抗性的方法 本发明涉及逆转动物细胞中多种药物抗性的方法。在联邦德国共和国每年约350,000人患恶性肿瘤。这些患者50%以下 的可以预期确定治愈。除了手术摘除和放射外，使用细胞抑制剂进行的化 学治疗是当前最常见的癌症治疗形式。与其使用的抗肿瘤活性物质原则上 对生物的所有细胞有效，然而，肿瘤细胞由于它们增加的增殖速度而更易 于化学敏感性。对于多种肿瘤实体如青少年淋巴白血病、 一些淋巴瘤和睾 丸癌可以得到良好的治疗结果。然而，这些肿瘤仅占所有恶性疾病的10 %。多数实体瘤不应答或者仅弱应答使用多种细胞抑制剂的治疗。对于来 自肾、结肠、胰腺和肝脏的癌以及黑素瘤和脑肿瘤尤其是这样。此外，例 如，乳癌、卵巢癌和前列腺癌最初良好应答细胞抑制剂治疗，然而，在治 疗周期过程中变得对使用的细胞抑制剂不敏感。于是，研究表明在P-糖蛋 白表达和肿瘤转移的发生之间存在高度相关性。尽管前些年在建立的治疗 概念如化学疗法和放射疗法的发展中取得了显著进步，但是总而言之，实 体瘤的治疗仍然不令人满意。除了特定肿瘤实体外，肿瘤细胞异质性和肿瘤的血管化、肿瘤细胞自 身的遗传和外遗传改变涉及对细胞抑制剂和放射的抗性的形成。这些可以 分成下面的六大组1.增加的流出活性；2.靶蛋白的调节；3.增强的修复；4.程序性细胞死亡的调节；5.细胞周期；和6.减少的流入。在恶性肿瘤的临床治疗期间，通常观察到复发的肿瘤不仅抗最初使用 的细胞抑制剂，而且抗不同组化合物的其他抗肿瘤药。该现象称作多药抗性或者，以古英语文献的形式，称作多药抗性(MDR)。除了非典型的多 药抗性外，MDR的典型现象是基于膜结合的170 kDa ATP依赖性跨膜糖 蛋白的过表达，该糖蛋白主要从细胞输出亲脂化合物。MDR1蛋白也分别 称作Pgp和P-糖蛋白，是ABC转运蛋白组的部分，MRP(多药相关蛋白) 禾口BCRP (乳腺癌抗性蛋白)也属于ABC转运蛋白。肺泡LRP蛋白(肺
抗性相关蛋白)不属于典型的ABC转运蛋白。然而，在这一点还经常提 到它，由于它也参与与对肿瘤细胞中细胞抑制剂的抗性形成的转运过程(Sugawara I等，CANCER LETTERS 112， 23-31， 1997; Gottesman等，Nat Rev Cancer. 2002,2:48-58)。已知LRP启动子包含倒置CAAT盒(Y盒) (Scheider等，Breast Cancer Res.， 2001, 3， 183-191)。因此，本发明根本的问题是提供治疗此类疾病，尤其治疗前述抗性疾 病，即其细胞抗细胞抑制剂和/或辐射的肿瘤和肿瘤疾病的方法。而且，本 发明根本的问题是逆转或者消除前述的抗性和本文描述的其他抗性。在另 一方面，本发明根本的问题是提供恢复药物敏感性，尤其形成或者参与肿 瘤和肿瘤疾病的细胞的药物敏感性的方法，其中此类细胞不对细胞抑制剂 和/或放射敏感或者不再敏感。根据本发明，通过使用以依赖于YB-1的方式复制的病毒、尤其腺病 毒解决了这些问题。而且，根据本发明，通过所附独立权利要求的主题解 决了这些问题。优选的实施方案来自从属权利要求。因此，在一方面，通过使用病毒，优选腺病毒用于逆转细胞中的抗性， 也解决了本发明根本的问题。因此，在第二方面，通过使用病毒，优选腺病毒用于生产逆转细胞中 抗性的药物，也解决了本发明根本的问题。因此，在第三方面，通过使用病毒，优选腺病毒用于恢复细胞的药物 敏感性，也解决了本发明根本的问题。因此，在第四方面，通过使用病毒，优选腺病毒用于生产恢复细胞的 药物敏感性的药物，也解决了本发明根本的问题。在根据本发明的第一到第四方面的实施方案中，细胞是动物细胞，优 选哺乳动物细胞，更优选人细胞。在优选实施方案中，细胞是肿瘤细胞。在优选实施方案中，细胞对一种或几种药学活性剂和/或放射抗性或 者不敏感。在优选实施方案中，药学活性剂是细胞生长抑制剂。 因此，在第五方面，通过使用病毒，优选腺病毒抑制ABC转运蛋白， 尤其ABC转运蛋白的表达，也解决了本发明根本的问题。 在第一、第二、第三和第四方面的实施方案中，所述抗性由ABC转运 蛋白介导。在第一、第二、第三、第四和第五方面的实施方案中，抗性是多种抗 性或者多抗性，尤其对细胞生长抑制剂和/或放射的多种抗性或者多抗性。因此，在第六方面，通过使用病毒，优选腺病毒生产治疗疾病、尤其 肿瘤疾病的药物，也解决了本发明根本的问题，其中与该疾病有关的细胞或者其部分是抗性的，尤其具有ABC转运蛋白介导的抗性和/或多种抗性 或多抗性，优选对细胞生长抑制剂和/或放射的多种抗性或者多抗性。在第六方面的备选优选实施方案中，治疗包括对将治疗的细胞或者生 物施用腺病毒和另一药学活性剂，或者施用腺病毒和放射，其中腺病毒的 施用引起或者增加所述另 一药学活性剂和/或放射的效力。在第六方面的优选实施方案中，治疗包括对将治疗的细胞或者生物施 用腺病毒和另一药学活性剂，或者施用腺病毒和放射，其中所述另一药学 活性剂和/或放射的施用引起或者增加所述腺病毒的效力。在第五和第六方面的实施方案中，ABC转运蛋白选自包含MRP和MDR， 尤其MDR-1的组。在第五和第六方面的实施方案中，在施用所述另一药学活性剂前，至 少在治疗开始时施用腺病毒。在第五和第六方面的实施方案中，在治疗开始时至少在放射前施用腺病毒。在第五和第六方面的实施方案中，在施用另一药学活性剂之前或者在 放射前约1到3天，优选约1到2天施用腺病毒。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，所述抗 性是对细胞生长抑制剂和/或放射的抗性。在第六方面的实施方案中，所述另一药学活性剂选自包含细胞生长抑 制剂的组。在第六方面的实施方案中，所述放射是用于肿瘤疾病的放射中的放射。在第六方面的实施方案中，以一定剂量并使用放射方案进行放射和/ 或以一定剂量或根据患者的治疗方案施用所述另一药学活性剂，其中患者 选自包含免疫抑制患者、具有坏的或者病理血像的患者和具有坏的或者病 理肾值的患者的组。在第六方面的实施方案中，放射以所述剂量或者根据放射方案进行和 /或所述药学活性剂以一定剂量或者根据患有疾病的患者的治疗方案施 用，其中与这种疾病有关的细胞或者其部分不是抗性的。在第六方面的实施方案中，腺病毒的施用产生施用另一药学活性剂或 者放射的前提条件。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，腺病毒 作为病毒、核酸、载体、复制系统、药物或者药物组合物存在。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，腺病毒以依赖于YB-1的方式复制。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，腺病毒 是E1A负型的。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，腺病毒是溶瘤腺病毒。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，病毒、 优选腺病毒在细胞核中缺少YB-1的细胞中是复制缺陷的，并且其中该病 毒编码癌基因或者癌基因产物，尤其癌基因蛋白质，其反式激活至少一种 病毒基因，优选腺病毒基因，其中该基因选自包含ElB55kDa、 E4orf6、 E4orf3和E3ADP的组。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的优选实施方案中，所 述病毒、尤其腺病毒在细胞核中具有YB-1的细胞中复制。在在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的更优选的实施方案 中，病毒癌基因蛋白质是E1A和/或癌基因是编码E1A和/或癌基因蛋白E1A 的基因。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，病毒癌 基因蛋白E1A能够结合功能Rb肿瘤抑制基因产物。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，病毒癌 基因蛋白E1A不能结合功能Rb肿瘤抑制基因产物。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，病毒癌
蛋白E1A不诱导YB-1向细胞核中的定位。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，药物用于其细胞是Rb阳性或者Rb阴性的患者。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，细胞是 Rb阴性的并且细胞核是YB-1阳性的，优选独立于细胞周期在细胞核中 YB-1阳性的。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，细胞是 p53阳性的或者p53阴性的。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，癌基因 蛋白与野生型癌基因蛋白E1A相比显示出一种或几种突变或缺失，其中缺 失优选是选自包含CR3序列的缺失和N-末端的缺失和C-末端的缺失的组 的缺失。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，E1A癌 基因蛋白能够结合Rb。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，癌基因 蛋白与野生型癌基因蛋白相比显示出一种或几种突变或缺失，其中缺失优 选是CR1区和/或CR2区中的缺失。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，癌基因 蛋白ElA不能结合Rb。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，病毒癌 基因蛋白、优选ElA处于组织和/或肿瘤特异性启动子的控制下。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，病毒、 尤其腺病毒编码YB-1。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，YB-1 处于组织特异和/或肿瘤特异性启动子的控制下。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，病毒、 优选腺病毒编码至少一种蛋白质，其中该蛋白质选自包含E4orf6、E4orf3、 ElB55k和腺病毒E3ADP蛋白的组。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，细胞在 细胞核中包含YB-1，优选地，形成肿瘤的细胞或者其部分在细胞核中具有YB-1。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，在诱导YB-1转运到细胞核中后，肿瘤在细胞核中包含YB-1。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的优选实施方案中，通 过选自放射、施用细胞生长抑制剂和过热的至少一种措施引发YB-1向细 胞核的转运。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的优选实施方案中，将 所述措施应用于细胞、器官或者生物，优选地，需要其的生物，更优选患 有所述疾病的生物。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，病毒、 优选腺病毒选自包含AdA24、 d1922 - 947， ElAd/01/07、 dl1119/1131、 CB106、 d1520和缺少表达的能够结合功能Rb肿瘤抑制基因产物的病毒癌 基因的病毒的组。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，设计病 毒、优选腺病毒使得通过E2晚期启动子的激活，通过YB-1控制复制，优 选地，激活主要通过E2晚期启动子的激活控制。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的优选实施方案中，病 毒包含编码转基因的核酸。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的优选实施方案中，病 毒包含转基因的翻译和/或转录产物。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的优选实施方案中，核 酸包含转基因或者编码转基因的核酸。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的优选实施方案中，转 基因选自包含前体药物基因、细胞因子和细胞因子的基因、程序性细胞死 亡诱导基因、肿瘤抑制基因、金属蛋白酶抑制剂的基因和血管生成抑制剂 的基因的组。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，转基因 选自包含编码siRNA、适配体、反义分子和核酶的核酸的组，其中所述 siRNA、适配体、反义分子和/或核酶耙定耙分子。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的实施方案中，所述靶
分子选自包含抗性相关的因子、抗程序性细胞死亡因子、癌基因、血管生成因子、DNA合成酶、DNA修复酶、生长因子、生长因子的受体、转录因 子、金属蛋白酶、优选基质金属蛋白酶激酶和尿激酶型纤溶酶原激活物的 组。在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施 方案中，药物还包含至少一种药学活性剂。在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的优选实施方案中，药 学活性剂选自包含细胞因子、金属蛋白酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞 生长抑制剂、细胞周期抑制剂、蛋白酶体抑制剂、重组抗体、信号转导途 径的抑制剂和蛋白质激酶抑制剂的组。在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施 方案中，所述药物包含至少两种活性剂的组合，其中所述活性剂的每一种 单独和独立地选自包含细胞生长抑制剂的组。在优选实施方案中，所述活性剂的至少两种靶定不同的靶分子。 在优选实施方案中，所述活性剂的至少两种通过不同的作用方式发挥 活性。在一个实施方案中，至少一种活性剂增加病毒其中进行复制的细胞的 感染力。在一个实施方案中，至少一种活性剂影响细胞的组分的可用性，优选 增加该组分的可用性，其中该组分调节病毒的摄入。在一个实施方案中，至少一种活性剂介导YB-1向细胞核的转移，优 选增加YB-1向细胞核的转移。在一个实施方案中，至少一种活性剂是组蛋白脱乙酰酶抑制剂。在优选实施方案中，组蛋白脱乙酰酶抑制剂选自包含曲古抑菌素A、 FR901228、 MS-27-275、 NVP-LAQ824、 PXDIOI、 apicidine和striptaid 的组。在一个实施方案中，至少一种活性剂选自包含曲古抑菌素A、 FR901228、 MS-27-275、 NVP-LAQ824、 PXDIOI、 apicidine和striptaid的组。在一个实施方案中，至少一种活性剂是拓扑异构酶抑制剂。
在优选实施方案中，拓扑异构酶抑制剂选自包含喜树碱、伊立替康、托泊替康、DX-895If、 SN-38、 9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、柔红霉素 和依托泊苷的组。在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施 方案中，所述药物包含曲古抑菌素A和伊立替康。在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施 方案中，病毒、尤其第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面 的病毒与所述药物中的至少两种活性剂分离。在优选实施方案中，至少一单位剂量的病毒与一种或至少两种活性剂 的至少一单位剂量分离。在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施 方案中，病毒、优选腺病毒表达选自包含E1B蛋白和E4蛋白的组的第一 种蛋白，然后表达选自包含E1A蛋白的组的第二种蛋白。在优选实施方案中，第一种蛋白是E1B蛋白，优选ElB55kd蛋白。在更优选的实施方案中，第一种蛋白是E4蛋白，优选E4orf6蛋白。在一个实施方案中，第一种蛋白是E1B蛋白和E4蛋白的组合，优选 ElB55kD蛋白和E4orf6蛋白的组合。在一个实施方案中，E1A蛋白是E1A12S蛋白。在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施 方案中，病毒包含编码蛋白质的至少一种核酸，所述蛋白质选自包含E1B 蛋白、E4蛋白和E1A蛋白的组，其中所述至少一种蛋白处于启动子的控制 下，该启动子不同于控制野生型腺病毒中蛋白质的表达的启动子。在优选实施方案中，至少一种蛋白是E1B蛋白、优选ElB55kD蛋白。 在优选实施方案中，至少一种蛋白是E4蛋白，优选E4orf6蛋白。 在一个实施方案中，至少一种蛋白是E1A蛋白，优选E1A12S蛋白。 在一个实施方案中，至少一种蛋白是E1B蛋白和E4蛋白的组合，优 选ElB55kD蛋白和E4orf6蛋白的组合。在一个实施方案中，至少一种蛋白是E1B蛋白和E1A蛋白的组合，优 选ElB55kD蛋白禾口 E1A12S蛋白的组合。在一个实施方案中，至少一种蛋白是E4蛋白和E1A蛋白的组合，优 选E4orf6蛋白和E1A12S蛋白的组合。在一个实施方案中，至少一种蛋白是E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白的 组合，优选ElB55kD蛋白、E4orf6蛋白和ElA12S蛋白的组合。在一个实施方案中，E1B蛋白的表达受到启动子的控制，其中该启动 子选自包含肿瘤特异性启动子、器官特异性启动子、组织特异性启动子、 异源启动子和腺病毒启动子的组，其中腺病毒启动子不同于E1B启动子。在一个实施方案中，E4蛋白的表达受到启动子的控制，其中该启动子 选自包含肿瘤特异性启动子、器官特异性启动子、组织特异性启动子、异 源启动子和腺病毒启动子的组，其中腺病毒启动子不同于E4启动子。在一个实施方案中，腺病毒启动子是E1A启动子。在一个实施方案中，E1A蛋白的表达受到启动子的控制，其中该启动 子选自包含肿瘤特异性启动子、器官特异性启动子、组织特异性启动子、 异源启动子和腺病毒启动子的组，其中腺病毒启动子不同于E1A启动子。在一个实施方案中，E1A蛋白的表达受到YB-1控制或者可以通过YB-1 调节。在一个实施方案中，控制E1A蛋白的表达的启动子是腺病毒E2晚期 启动子。在一个实施方案中，E4蛋白，优选E4orf6蛋白和E1B蛋白，优选 ElB55kd蛋白处于相同或者共同的启动子控制下。在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施 方案中，病毒通过至少一种腺病毒蛋白在细胞核中提供YB-1或者通过至 少一种腺病毒蛋白介导细胞核中YB-1的提供，其中优选地，腺病毒蛋白 不同于E1A。在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施 方案中，该病毒通过至少一种腺病毒蛋白提供用于腺病毒复制的YB-1或 者通过至少一种腺病毒蛋白介导用于腺病毒复制的YB-1的提供，其中优 选地，腺病毒蛋白不同于E1A。在一个实施方案中，腺病毒蛋白是E4orf6和ElB55kd的复合体。 在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施 方案中，腺病毒的核酸包含至少一种功能上失活的腺病毒区域，其中该区
域选自包含E1区、E3区、E4区和其组合的组。 在优选实施方案中，所述区域是E1区。 在一个实施方案中，所述区域是E3区。 在一个实施方案中，所述区域是E4区。 在一个实施方案中，所述区域包含E1区、E3区和E4区。 在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施方案中，所述病毒包含至少一个表达盒，其中该表达盒包含至少一个启动子和编码腺病毒蛋白的核酸，其中腺病毒蛋白是E1B蛋白，优选ElB55kD蛋白。在优选实施方案中，该启动子不同于E1B启动子。在优选实施方案中，该启动子选自包含肿瘤特异性启动子、器官特异 性启动子、组织特异性启动子、异源启动子和腺病毒启动子的组，其中该 启动子不同于E1B启动子。在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施 方案中，该病毒包含至少一个表达盒，其中该表达盒包含至少一个启动子 和编码腺病毒蛋白的核酸，其中腺病毒蛋白是E4蛋白，优选E4orf6蛋白。在优选实施方案中，所述启动子不同于E4启动子。在优选实施方案中，该启动子选自包含肿瘤特异性启动子、器官特异 性启动子、组织特异性启动子、异源启动子和腺病毒启动子的组，其中腺 病毒启动子不同于E4启动子。在一个实施方案中，启动子是E1A启动子。在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施 方案中，该病毒包含至少一个表达盒，其中该表达盒包含至少一个启动子 和编码腺病毒蛋白的核酸，其中腺病毒蛋白是E1A蛋白，优选E1A12S蛋 白。在优选实施方案中，所述启动子不同于E1A启动子。 在优选实施方案中，该启动子选自包含肿瘤特异性启动子、器官特异 性启动子、组织特异性启动子、异源启动子和腺病毒启动子的组。 在一个实施方案中，腺病毒包含核酸，其中该核酸编码YB-1。 在优选实施方案中，编码YB-1的核酸处于启动子控制下，其中该启
动子优选为E2晚期启动子。在一个实施方案中，编码YB-1的核酸处于启动子控制下，其中该启动子分别是YB-1依赖性的和受YB-1控制的。在一个实施方案中，编码YB-1的核酸是表达盒的部分，该表达盒包 含编码E1A蛋白的核酸，优选编码E1A12S蛋白的核酸。在优选实施方案中，编码E1A蛋白的核酸与编码YB-1的核酸通过IRES 序列分开。在一个实施方案中，编码E4蛋白、优选E4orf6蛋白的核酸和编码E1B 蛋白、优选ElB55kD蛋白的核酸包含在表达盒中，其中优选这两个编码序 列通过IRES序列分开。在优选实施方案中，表达盒的启动子是选自包含肿瘤特异性启动子、 器官特异性启动子、组织特异性启动子、异源启动子和腺病毒启动子的组， 其中腺病毒启动子不同于E4启动子并且不同于E1B启动子，优选不同于 野生型E4启动子并且不同于野生型E1B启动子。在一个实施方案中，病毒包含表达盒，该表达盒包含启动子和核酸序 列，其中该核酸序列选自包含适配体、核酶、aptazymes、反义分子和siRNA的组。在一个实施方案中，病毒包含表达盒，该表达盒包含启动子和核酸序 列，其中该核酸序列是编码核酸，其中该核酸编码分子，该分子选自包含 肽、多肽、蛋白质、anticalines、抗体和抗体片段的组。在一个实施方案中，病毒包含表达盒，该表达盒包含启动子和核酸序 列，其中该核酸序列选自包含程序性细胞死亡诱导基因、前体药物基因、 蛋白酶抑制剂、肿瘤抑制基因、细胞因子和血管生成抑制剂的组。在一个实施方案中，病毒是重组腺病毒。在一个实施方案中，病毒是腺病毒突变体。在一个实施方案中，病毒是复制缺陷的。在一个实施方案中，病毒能够在包含失调的YB-1或在细胞核中具有 YB-1的细胞中复制。在优选实施方案中，细胞独立于细胞周期在细胞核中含有YB-1。 在一个实施方案中，所述药物包含至少一种其他药学活性剂。
在一个实施方案中，所述药物与其他药学活性剂一起施用或预期一起 施用。在一个实施方案中，所述其他药学活性剂选自包含细胞因子、金属蛋 白酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞生长抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、细 胞周期抑制剂、蛋白酶体抑制剂、信号转导级联的抑制剂和蛋白质激酶抑 制剂和重组抗体的组。在一个实施方案中，所述药物包含至少两种活性剂的组合，其中每一 种活性剂单独和独立地选自包含细胞生长抑制剂的组。在优选实施方案中，所述活性剂的至少两种靶定不同的靶分子。在更优选的实施方案中，所述活性剂的至少两种通过不同的作用方式 发挥活性。在一个实施方案中，至少一种活性剂增加病毒在其中进行复制的细胞 的感染力。在一个实施方案中，活性剂影响细胞的组分的可用性，优选增加该组 分的可用性，其中该组分介导病毒的摄入。在一个实施方案中，该活性剂介导YB-1向细胞核的转移，优选增加YB-1向细胞核的转移。在一个实施方案中，该活性剂是组蛋白脱乙酰酶抑制剂。 在优选实施方案中，组蛋白脱乙酰酶抑制剂选自包含曲古抑菌素A、FR901228、 MS—27—275、 NVP—LAQ824、 PXD101、 apicidine和striptaid的组。在一个实施方案中，至少一种活性剂选自包含曲古抑菌素A、 FR901228、 MS-27-275、 NVP-LAQ824、 PXDIOI、 apicidine和striptaid的组。在一个实施方案中，至少一种活性剂是拓扑异构酶抑制剂。 在优选实施方案中，拓扑异构酶抑制剂选自包含喜树碱、SN-38、托泊替康、DX-895If、伊立替康、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、依托泊苷和柔红霉素的组。在一个实施方案中，所述活性剂包含曲古抑菌素A和伊立替康。 在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施
方案中，病毒包含-缺少功能的野生型E1区，禾口-转运蛋白，其用于将YB-1转运到受到该病毒感染的细胞的细胞核中。在一个实施方案中，所述病毒表达编码蛋白ix的核酸并表达蛋白IX 。在一个实施方案中，所述缺少功能的野生型ElA区是ElA-负型的。 在一个实施方案中，所述缺少功能的野生型E1区是E1B-负型的。 在优选实施方案中，所述缺少的野生型El区是ElB55k-负型和/或ElB19k-负型和/或蛋白IX-负型的。在一个实施方案中，所述转运蛋白是如所述病毒提供的转运蛋白，优选异源转运蛋白。在优选实施方案中，所述转运蛋白是病毒转运蛋白。 在一个实施方案中，所述转运蛋白包含蛋白E4orf6。 在一个实施方案中，所述转运蛋白包含蛋白ElB55k。 在一个实施方案中，所述转运蛋白包含由E4orf4和ElB55k组成的复合体。在一个实施方案中，所述转运蛋白由核酸编码，其中该核酸处于启动 子控制下。在优选实施方案中，转运蛋白是由至少两种因子组成的复合体，其中 每种因子由核酸编码，其中两种核酸受到共同的启动子的控制。在优选实施方案中，两种编码核酸通过调节表达水平的元件连接并且 其中该元件优选选自包含IRES的组。在一个实施方案中，该转运蛋白是由至少两种因子组成的复合体，并 且每种因子由核酸编码，其中两种核酸各自受到自己的启动子的控制。在一个实施方案中，所述启动子不同于E4启动子，尤其不同于腺病 毒E4启动子并且不同于E1B启动子，尤其不同于腺病毒E1B启动子。在一个实施方案中，启动子是选自包含组织特异性启动子、肿瘤特异 性启动子、病毒启动子、CMV启动子，尤其腺病毒启动子的组，条件是它 们不同于E4启动子、E1B启动子并且优选还不同于E2-晚期启动子。在一个实施方案中，编码转运蛋白的核酸在ElB55k的3'包含ElB55k 的3'-UTR。
在一个实施方案中，如果缺失的野生型E1区是ElB55k阳性的，那么编码转运蛋白的核酸不包含编码ElB55k的核酸。在一个实施方案中，编码转运蛋白的核酸编码ElB55k和ElB19k。 在优选实施方案中，编码转运蛋白的核酸编码蛋白n。 在一个实施方案中，编码ElB55k和ElB19k的核酸处于启动子控制下。 在一个实施方案中，编码ElB55k和/或ElB19k禾H/或蛋白IX的核酸处于启动子控制下，其中该启动子优选不同于E1A依赖性的启动子，其中更优选地，该核酸编码ElB55k、 ElB19k和蛋白IX。在一个实施方案中，缺少功能的野生型El区是ElA13S-负型和/或ElA12S-负型的。在一个实施方案中，缺少功能的野生型E1区是ElA13S-负型的。 在一个实施方案中，优选缺少功能的野生型El区是ElA13S-负型和E1A12-负型的，其中该病毒包含编码E1A12S蛋白的核酸，其中该核酸优选是异源核酸。在优选实施方案中，编码E1A12S蛋白的核酸处于启动子控制下，其 中该启动子优选是YB-l-依赖性的启动子，并且更优选选自包含E2-晚期 启动子、肿瘤特异性启动子和组织特异性启动子的组。在优选实施方案中，编码转运蛋白的一种或多种核酸编码E4orf6和 ElB55k。在一个实施方案中，编码E1A12S的核酸和编码蛋白IX的核酸处于共 同的启动子控制下，其中优选地，两种编码核酸通过调节表达的元件相互 连接，其中该元件更优选地选自包含IRES的组。在一个实施方案中，编码E1A12S区的核酸和编码蛋白IX的核酸每种 处于一个启动子控制下，其中该启动子优选为相同的启动子。在一个实施方案中，所述启动子是YB-1-依赖性的启动子，其优选选 自包含E2-晚期启动子、MDR启动子和DNA聚合酶a启动子的组。在一个实施方案中，所述病毒包含编码YB-1的核酸。在优选实施方案中，编码E1A12S蛋白的核酸和编码YB-1的核酸处于 共同的启动子控制下，其中两种编码核酸通过调节表达的元件相互连接， 其中该元件优选地选自包含IRES的组。
在更优选实施方案中，编码YB-1的核酸和编码E1A12S蛋白的核酸每 种处于一个启动子控制下，其中该启动子优选是相同的启动子。在一个实施方案中，所述启动子是YB-1-依赖性的启动子，其优选选 自包含E2-晚期启动子、MDR启动子和DNA聚合酶a启动子的组。在一个实施方案中，将编码E1A12S的核酸克隆到E3区或者E4区中。在一个实施方案中，将编码E1A12S的核酸和编码蛋白IX的核酸或编 码YB-1的核酸克隆到E3区或者E4区中。在一个实施方案中，编码蛋白IX的核酸的表达受到不同于E1B的启 动子、ElB19k或E1A12S的控制。在一个实施方案中，所述病毒包含至少一种转基因，其优选克隆到E3 区中。在优选实施方案中，所述病毒包含至少一种转基因，其优选克隆到E4 区中。在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的实施 方案中，病毒包含-缺乏功能的野生型E1区，和-用于将YB-1转运到被该病毒感染的细胞的细胞核中的转运蛋白， 该病毒包含编码RGD基序的核酸。在根据在第一、第二、第三、第四、第五和第六方面任一方面的优选 实施方案中，病毒包含-缺乏功能的野生型El区，和-用于将YB-1转运到被该病毒感染的细胞的细胞核中的转运蛋白， 该病毒包含MLP基因和/或E2A基因和E1B基因和/或E3基因和/或E4 基因。在一个实施方案中，所述病毒是在细胞核中不含有YB-1的细胞中复 制缺陷的。在一个实施方案中，所述病毒能够在细胞核中具有YB-1的细胞中复 制，尤其独立于细胞周期在细胞核中具有YB-1的细胞中复制。在一个实施方案中，所述病毒能够在YB-1以失调的方式存在的细胞 中复制。 在一个实施方案中，所述药物还包含至少一种药学活性剂。 在优选实施方案中，所述药学活性剂选自包含细胞因子、金属蛋白酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞生长抑制剂、细胞周期抑制剂、蛋白酶体抑制剂、重组抗体、信号转导级联的抑制剂和蛋白质激酶抑制剂的组。在一个实施方案中，所述药物包含至少两种活性剂的组合，其中每种活性剂各自和独立地选自包含细胞生长抑制剂的组。在优选实施方案中，所述至少两种活性剂靶定不同的靶分子。 在优选实施方案中，所述活性剂的至少两种通过不同的作用方式发挥活性。在一个实施方案中，至少一种活性剂增加病毒在其中进行复制的细胞 的感染力。在一个实施方案中，至少一种活性剂影响细胞中化合物的可用性，优 选增加该化合物的可用性，其中该化合物调节病毒的摄入。在一个实施方案中，至少一种活性剂介导YB-1向细胞核的转移，优 选增加YB-1向细胞核的转移。在一个实施方案中，至少一种活性剂是组蛋白脱乙酰酶抑制剂。在一个实施方案中，组蛋白脱乙酰酶抑制剂选自包含曲古抑菌素A、 FR901228、 MS-27-275、 NVP-LAQ824、 PXD101、 Apicidin和Scriptaid的组。在一个实施方案中，所述活性剂选—自包含曲古抑菌素A、 FR901228、MS-27-275、 NVP-LAQ824、 PXD101、 Apicidin和Scriptaid的组。 在一个实施方案中，至少一种活性剂是拓扑异构酶抑制剂。 在优选实施方案中，拓扑异构酶抑制剂选自包含喜树碱、伊立替康、托泊替康、DX-895If、 SN-38、 9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、柔红霉素和依托泊苷的组。在一个实施方案中，所述活性剂包含曲古抑菌素A和伊立替康。 在一个实施方案中，病毒、尤其根据前面权利要求任一项的病毒与所述至少两种活性剂分离。在一个实施方案中，至少一单位剂量的病毒与一种或至少两种活性剂的至少一单位剂量分离。
在第七方面，通过如关于根据本发明的病毒的用途定义的药物解决了 本发明根本的问题。在第八方面，通过治疗需要其的患者的方法解决了本发明根本的问 题，其中将分别如本文定义和公开的药物施用于所述患者。发明人已经令人惊奇地发现需要YB-1进行复制，即以依赖YB-1的方式复制的腺病毒适于分别消除和逆转细胞、尤其动物细胞的抗性。不希望束缚于此，似乎由于在依赖YB-1的病毒的复制中YB-1的使用，YB-1 不再被利用作为抗性形成的重要因子。更具体地，YB-1由于参与该组病 毒、尤其腺病毒的复制，似乎在这样的程度上被除去或者不再被利用使得 其它YB-1控制的过程，如抗性介导基因的YB-1控制的转录不再进行， 或者至少以显著减小的方式进行。因此，在本发明内，通常任何病毒可以用于本发明和本文描述的用途， 其中此类病毒使用YB-1用于它的复制，其中该复制优选导致感染的细胞 的裂解(也称作CPE;细胞病变效应)并且不仅仅导致暂时复制。减小或者逆转的抗性的类型基本上仅仅限于那些抗性，其转录、翻译 和/或活性受到YB-l的控制，优选被YB-1激活。具体地，这些是抗性介 导因子，其包含倒置的CAAT盒(Y-盒)。此类抗性尤其为下面的抗性。 典型的和非典型的多药抗性(MDR)，其中除了非典型的多药抗性外，MDR 的典型表型基于膜结合的170kDaATP-依赖性跨膜糖蛋白的过表达，该糖 蛋白主要从细胞输出亲脂化合物。MDR1蛋白也分别称作Pgp和P-糖蛋白， 是ABC转运蛋白组的成员，MRP(多药相关蛋白)和BCRP (乳腺癌抗性蛋 白)也属于ABC转运蛋白。因此，在本发明的含义中其他抗性是ABC转 运蛋白，MDR-1， Pgp， P糖蛋白，MRP禾口/或BCRP介导的抗性。肺泡 LRP蛋白不形成典型ABC转运蛋白的部分(肺抗性相关蛋白)。然而，它 在这方面经常被提及，因为它也参与转运过程，该转运过程与肿瘤细胞中 对细胞抑制剂的抗性的形成有关(SugawaraI等，CANCER LETTERS 112, 23-31, 1997; Gottesman等，Nat Rev Cancer. 2002,2:48-58)。已知LRP启动 子包含倒置的CAAT盒(Y盒)(Scheider等，Breast Cancer Res" 2001, 3, 183-191)。肺泡LRP蛋白质介导的那些抗性也是在本发明的含义中的抗性。 其他抗性是本文中一般描述的抗性和更具体体地与待治疗的多种肿瘤相
关的抗性，包括但不限于MDR、 MRP、拓扑异构酶、BCL2、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、和蛋白激酶C(PKC)。由于细胞抑制剂的作用是基于诱导程 序性细胞死亡，所以程序性细胞死亡相关的基因的表达在抗性形成中起重 要作用，从而，因此，下面的因子也是相关的，即Fas、 BCL2 —家族、HSP 70禾卩EGFR [Kim等，Cancer Chemther. Pharmacol. 2002, 50， 343-352]，因 此定义在本发明含义内的抗性。根据本发明使用的病毒、尤其腺病毒是依赖YB-1的，即需要YB-l 进行复制的病毒。与此相关，在本发明内，此类病毒已经是现有技术中已 知的并且可以根据本发明使用，或者可以基于本文提供的内容设计此类病 毒。将注意到根据本发明的术语病毒或者腺病毒或者根据本发明使用的病 毒或者腺病毒迄今对于本发明的目的而言是同义的，即本文描述的病毒只 要使用YB-1用于复制，那么它们就可以用于本发明。用于复制的YB-1 可以是去调节或者定位于细胞核的YB-1，尤其独立于细胞周期定位于细 胞核的YB-1，如同下述更详细说明。含有去调节形式的YB-1的细胞是包含至少一种下面的特征的细胞和/ 或含有YB-1的那些细胞，其中YB-1显示出至少一种下面的特征(1)YB-1 在细胞中过表达，优选独立于细胞周期过表达，其中优选地，作为使用的 正常细胞中YB-1的表达的度量，正常细胞是与肿瘤细胞不同的细胞或者 分别如下的细胞和细胞系肝细胞以及成纤维细胞细胞系WI38和 CCD32-Lu。优选地，当表达增强2到10倍，优选5到10倍时，存在过 表达。测量表达、尤其测量过表达的方法是本领域技术人员已知的并且包 括测量蛋白质浓度，尤其YB-1的蛋白质浓度，测量RNA，尤其YB-1的 RNA，蛋白质印迹分析、RNA印迹分析和RT-PCR，每种优选为YB-1的 或者与YB-1相关。除了 YB-1以外，替代标记也可以如本文中描述的使 用。显示出YB-1的过表达的细胞系的实例如下结肠癌细胞系257RDB、 胰腺癌细胞系181RDB、乳癌细胞系MCF-7Adr、前列腺癌细胞系DU145、 前列腺癌细胞系PC3、神经胶质瘤细胞系U373、神经胶质瘤细胞系U87、 肺癌细胞系A549、肝癌细胞系Hep3B和HepG2。 (2)细胞中存在的YB-1 使得根据本发明的病毒能够复制。本发明优选此类条件下的复制效率与显 著降低的复制不同。
在一个实施方案中，显著降低的复制具体是与野生型相比，降低2倍、 优选5倍、更优选10倍、最优选100倍的复制。在优选实施方案中，通 过使用相似或者相同的细胞系、相似或相同的病毒感染效价(感染复数
MOI，或者空斑形成单位pfb)和/或相同或相似的一般实验条件进行复制
的比较。术语复制具体指颗粒形成。在另一实施方案中，病毒核酸合成的 程度可以理解为复制的度量。测定病毒核酸合成的程度的方法以及测定颗 粒形成的方法是本领域技术人员己知的。
本文所涉及的去调节的YB-1的另一种形式是磷酸化的YB-1 。其合理 性如下。YB-1在相当多的肿瘤中高度表达，但在正常细胞中几乎不可检 测到。另外，确定通过应激刺激如UV照射和化疗剂，YB-1移位到核内 (Okamoto T et al.， Oncogene, 19， 6194-6202, 2000: Koike K et al.， FEBS Letters, 417, 390-394, 1997)。丝氨酸/苏氨酸激酶一Akt通过磷酸化转录因 子和细胞周期蛋白来启动肿瘤细胞生长(Nicholson KM and Anderson NG， Cell. Signal., 14, 381-395, 2002)。另外，发现活化的Akt (磷酸化的Akt)与 YB-1的蛋白表达正相关，并且Akt在丝氨酸102处结合和磷酸化YB-1冷 激结构域(Sutherland BW et al.， Oncogene, 24, 4282-4292, 2005)。这些数据 指出存在信号转导途径，其改变YB-1的s亚细胞定位，并同样指导它的 功能。另外，这种磷酸化增加了参与应激应答、细胞增殖和致癌性转化的 蛋白如MDRl和MRP的产生(Evdokimova V et al.， Molecular and Cellular Biology, 26, 277-292， 2006)。然而，Akt将YB-1磷酸化还减弱了它的帽-结合能力，由此促进了沉默mRNA种类的翻译活性(Evdokimova V et al., Molecular and Cellular Biology, 26, 277-292, 2006)。由于Akt在正常细胞中 是无活性的，因此YB-1不以磷酸化形式存在，但在肿瘤细胞中YB-1以 去调节形式如磷酸化和/或过表达形式存在。
利用本文描述的病毒和/或利用本文描述的药物分别被治疗的各种疾 病和患者为如本文所述的那些。关于根据本发明的病毒的施用和放射或者 细胞抑制剂的施用之间的时间选择，将指出它主要由病毒的复制效率和肿 瘤的类型和大小决定。本领域技术人员将理解，当施用病毒时，它可以持 续一些时间，典型地约1到3天，直到发生YB-1的复制和由此的络合， 和因此它对于其他因子和尤其各自引起抗性的因子的转录的非利用性。迄
今尤其在抗性疾病的治疗开始时，任何其他治疗、尤其药学活性化合物如 药物活性剂和/或放射的施用前病毒的施用是有利的。
药学活性化合物的施用优选包括例如施用如本文公开的抗肿瘤或者 抗癌剂。其他各自药剂是本领域技术人员已知的。尤其优选细胞抑制剂。 示例性细胞抑制剂为在本文中关于药物组合物和与病毒一起施用的(药) 剂描述的那些。
在本发明中，惯用于治疗肿瘤疾病的剂量和治疗方案也可以与本发明 一起应用，然而，其并不限于此。例如，将施用的细胞抑制剂的量优选基
于体表(m"计算；例如，多柔比星的剂量为约50 mg/m2。治疗方案可以 不同地设计并且包括一天施用以及分别几天、几周或甚至几个月施用细胞 抑制剂和放射。施用和放射还可以以循环的方式另外发生。放射和/或细胞 抑制剂的施用又可以是单一疗法或者组合疗法，其根据本发明进一步通过 病毒的施用完成。
为了更好地理解本发明，将简要概述病毒复制的要素。腺病毒的复制 是非常复杂的过程并且通常基于人转录因子E2F。在病毒感染期间，首先 表达"早期基因"E1、 E2、 E3和E4。"晚期基因"组负责合成病毒的结构蛋 白。由编码不同的E1A和E1B蛋白质的两个转录单位E1A和E1B组成的 El区，在早期和晚期基因的激活中起关键作用，因为它们诱导E2、 E3和 E4基因的转录(Nevins,J.R., Cell 26, 213-220, 1981)。另夕卜，E1A蛋白可以 启动静止细胞中的DNA合成，并因此促使它们进入S期(参见Boulanger 和Blair， 1991)。另外，它们与Rb类的肿瘤抑制剂相互作用(Whyte, P.等, Nature 334, 124-127， 1988)。在这种情况下，释放细胞转录因子E2F。 E2F 因子可以随后结合细胞基因以及病毒基因的相应的启动子区域(特别是腺 病毒E2早期启动子)，并引发转录和由此的复制(Nevins, J. R., Science 258， 424-429， 1992)。 pRb和E2F的活性通过磷酸化调节。pRb的低磷酸化形式 主要存在于G1和M期。相反，pRb的超磷酸化形式存在于S和G2期。 通过pRb的磷酸化，从由E2F和低磷酸化的pRb组成的复合体中释放E2F。 E2F从由E2F和低磷酸化的pRb的复合体中的释放导致E2F依赖性的基 因的转录。ElA蛋白仅仅结合低磷酸化形式的pRb，其中ElA与pRb的 结合大部分通过E1A蛋白的CR2区域发生。另外，它还与CR1区域结合，
尽管亲禾口力较低(Ben-Israel禾口 Kleiberger, Frontiers in Bioscience, 7, 1369-1395, 2002; Helt和Galloway, Carcinogenesis, 24， 159-169, 2003)。
复制的引发和完成特别需要E2区域的基因产物，因为它们编码三个 关键蛋白。E2蛋白的转录受两个启动子控制，"E2-早期E2F-依赖型"启动 子，其在本文中也称为E2-早期启动子或早期E2启动子，禾B"E2-晚期"启 动子(Swaminathan 禾卩 Thimmapaya, The Molecular Repertoire of Adenoviruses III: Current Topics in Microbiology and Immunology,巻199, 177-194, Springer Verlag 1995)。另夕卜，E4区域的产物与EIA和ElB-55kDa 蛋白一起对E2F的活性和p53的稳定性起重要作用。例如，通过由E4区 域编码的E4or伤/7蛋白与由E2F和DPI组成的杂二聚体直接相互作用更 加反式激活E2启动子(Swaminathan禾卩Thimmapaya, JBC 258， 736-746, 1996)。另夕卜，p53使由ElB-55kDa和E4orf6组成的复合体失活(Steegenga, W. T.等，Oncogene 16,349-357, 1998)，以便成功地完成裂解性的感染周期。 另外，ElB-55kDa蛋白具有另一重要功能，即当与E4orf6蛋白相互作用时， 它促进病毒RNA从核中输出，而细胞的RNA保持在核内(Bridge和Ketner, Virology 174， 345-353, 1990)。另一个重要发现是，由ElB-55kDa/ E4orf6 组成的蛋白复合体定位于所谓的"病毒包涵体"。推测这些结构是复制和转 录的位点(Ornelles和Shenk, J. Virology 65， 424-429, 1991)。
对于复制、特别是对于腺病毒的释放的另一重要区域是E3区域。E3 区域更具体地包含多种相对小蛋白的遗传信息，该蛋白不是腺病毒体外感 染周期(即在细胞培养中)所必需的。然而，它们对于体内急性和/或潜伏 感染期间的病毒的存活起重要作用，因为它们尤其具有免疫调节和程序性 细胞死亡功能(Marshall S. Horwitz， Virololgie， 279, 1-8， 2001; Russell,上 文)。可以证实，具有约11.6 kDa大小的蛋白能诱导细胞死亡。由于其功 能，该蛋白称为ADP-术语为腺病毒死亡蛋白(adenovirus death protein)-(Tollefson, J. Virology, 70, 2296-2306, 1996)。该蛋白主要在感染周 期的晚期形成。而且，蛋白的过量表达导致感染细胞的更好裂解(Doronin 等，J. Virology, 74, 6147-6155, 2000)。由此，各自基因和蛋白质包含在根据 本发明的病毒中。
在下文中，描述了可以用作本发明的病毒的多种腺病毒的一些。与此
相关，仅仅为了清楚的原因，将它们分成组，并且称作病毒组§1、病毒组 §2和病毒组§3。为了清楚和实施的原因，这些病毒公开在下述由本申请人 共有的申请中，它们全文结合于此作为参考。更具体地，病毒组§1描述在
国际专利申请PCT/EP/05583，公开号为WO 03/099859， 2003年5月27日 提交，要求下列优先权2002年5月27日的DE 102 23 534.1， 2002年6 月7日的DE 102 25 400.1， 2002年10月15日的DE 102 48 039.7和2003 年5月19日的DE 103 22 530.7;病毒组§2描述在国际专利申请 PCT/EP03/11427，公开号为WO 2004/035616， 2003年10月15日提交， 要求下述优先权2002年10月15日的DE 102 48 039.7， 2003年5月19 日的DE 103 22 530.9， 2003年5月27日的DE 103 24 085.3和2003年5 月27日的PCT/EP03/05583;病毒组§3描述在国际专利申请标题为 "El-minus Adenovirusen und deren Verwendung" ， 2006年1月2日提交，要 求2004年12月31日提交的DE 10 2004 063662.1的优先权。
在本发明内，关于个别组提供的说明也可以应用于其他组，条件是这 不被明确地排除；这尤其应用于特定实施方案中提供的定义。也在本发明 范围内的是，在一个方面涉及的任何特征、实施方案、益处等也应用于如 本文所述的每个和任何其它发明中。同样在本发明范围内的是与按照本发 明的任何病毒或腺病毒相关所涉及的任何特征、实施方案、益处等同样应 用于按照本文所述的病毒或腺病毒的任何应用，反之亦然。
如实施方案中使用的，术语功能野生型E1区具体指如野生型的腺病 毒Ad5中所含的E1区。在一个实施方案中，术语缺少功能野生型E1区 指E1区，其不包含如在野生型腺病毒中存在的E1区的一种或几种功能或 者功能性或者不完全包含它们。功能性或者功能在下面通常指通过核酸或 者蛋白质介导的，优选通过蛋白质代表或者介导的功能。
关于本发明，功能的缺乏可以通过在翻译水平无活性的功能引起，艮口， 介导功能的蛋白质不存在，尽管其编码核酸仍然存在于病毒基因组中。这 可以例如，由于控制其翻译的调节元件不存在引起，其中如mRNA的 3'UTR，其提供了 mRNA的稳定性。优选地，这些调节元件不再如存在于 野生型病毒中那样存在于调节和控制背景中发挥各自的功能。
关于本发明，功能的缺乏可以备选或者额外地，通过在转录水平上无 活性的功能引起，即，介导功能的蛋白质不存在并且编码其的核酸不包含 在病毒基因组中或者不完全包含在病毒基因组中。在该实施方案中，编码 核酸包含一种或几种导致功能丧失的突变。此类突变优选是点突变和/或包 含几个碱基的缺失和/或编码该蛋白质的可读框或者核酸的完全缺失。如果蛋白质不包含如对应的野生型蛋白质显示的所有功能或者活性， 那么在上面实施方案意义中，功能是缺乏的。在一个实施方案中，复制的 程度用于测量在此类条件下可以得到的活性，其中优选与利用野生型蛋 白、基因型和/或表型的复制显著不同。在本发明的优选实施方案中，当与野生型病毒比较时，功能包含在病 毒中不同的调节背景中时，也存在功能缺乏。不同的调节背景在优选实施 方案中是这样的背景，该背景下的功能与其他功能相比，在不同的时间点 表达和/或处于不同的转录和/或翻译控制或者影响元件的控制下。此类元 件在具体实施方案中是启动子。在一个实施方案中，本文中强烈减小的复制具体指与野生型相比减小 2倍、优选5倍、更优选10倍，最优选100倍的减小。在优选实施方案中， 使用相同或者相似的细胞系、相同或相似的病毒感染效价(感染复数，MOI或者噬菌斑形成单位，pfo)和/或相同或相似的常规实验条件来比较复制。复制特别是指颗粒的形成。在其他实施方案中，复制的测量可以是 病毒核酸合成的程度。测定病毒核酸合成的程度的方法以及测定颗粒形成 的方法为本领域技术人员所已知。上面意义中功能的缺乏在本发明中通过称作"负型(minus)"的各自功 能指示。例如，E1A13S的缺乏通过ElA13S-负型表示。病毒组§1该组病毒是基于令人惊奇的发现，即YB-1核阳性肿瘤细胞中E1A修 饰的腺病毒的DNA复制是基于E2晚期启动子的激活。如本文使用的E1A 修饰的腺病毒是这样的腺病毒，其(a)不在YB-1核阴性细胞中复制或者 与各自野生型相比，显示出YB-1核阴性细胞中降低的、优选显著降低的 复制，(b)至少一种病毒基因的反式激活，其中该基因具体选自包含 ElB-55kDa、 E4or伤、E4orf3和E3ADP的组和/或(c)不能通过腺病毒将
细胞的YB-1转移至核内。任选地，根据本发明使用的腺病毒分别具有其它特征，即腺病毒编码的ElA蛋白的结合会干扰E2F与Rb的结合，并且 能够分解由E2F和Rb组成的各自复合物。具有一个或数个前述的特征a) 至c)、优选全部特征a)至c)的腺病毒在核内不含有YB-l的细胞中是复制 缺陷的。以下不希望受此束缚，本发明的发明人假定E2-早期启动子(即由E2F 转录因子控制的早期E2启动子)对于按照本发明使用的病毒复制不是非 常重要的。复制的打开独立于细胞的Rb状态，即意味着使用本文公开的 病毒感染的和优选随后裂解的肿瘤细胞可以包含功能性的以及无活性的 Rb蛋白。另外，使用本文公开的腺病毒或在本文公开的条件下的腺病毒 的复制不需要任何功能性的p53蛋白，但是也不受其存在的影响。如此，该技术教导背离了使用能消解肿瘤或能裂解肿瘤的腺病毒的原理，所述腺 病毒的类型为AdA24、 dl922-947、 ElAd/01/07、 CB016，或例如在欧洲专 利EP 0 931 830中描述的那些腺病毒，己经在以下假设下在E1A蛋白中引 入了一个或数个缺失完好的功能性的Rb蛋白会阻碍体内有效复制，因 此仅分别在Rb-阴性和Rb-突变细胞中体内地提供了腺病毒的复制。现有 技术的这些腺病毒系统是基于E1A，以便通过早期E2启动子(E2早期启 动子)禾H"自由E2F'控制腺病毒的体内复制。然而，根据本发明可以将现 有技术中的这些病毒用于细胞中的复制，所述细胞在独立于细胞周期的核 内含有YB-1。根据本发明可以使用在所述欧洲专利EP0 931 830中描述的病毒，特 别是腺病毒。更具体地，在所述专利中描述的病毒是复制缺陷的，且不能 表达病毒癌蛋白的病毒，该癌蛋白能够结合功能性的Rb肿瘤抑制基因产 物。腺病毒可以具体地为不能表达病毒E1A癌蛋白的任何腺病毒，该E1A 癌蛋白能够结合功能性的肿瘤抑制剂基因产物，更具体地是Rb。病毒ElA 癌蛋白可以包含失活突变，例如在Ad5的氨基酸位点30-85、核苷酸位点 697-790的CR1结构域和/或Ad5的氨基酸位点120-139、核苷酸位点 920-967的CR2结构域，其涉及pl05Rb蛋白、p130和p107蛋白的结合。 但是，本发明还包括，腺病毒是类型2的dl312或类型5的NTd11010。要根据本发明使用的腺病毒的另一特征是它们编码在此也称为癌基 因蛋白的病毒癌蛋白，其中癌基因蛋白优选为E1A，其中癌基因蛋白能够 激活至少一个对病毒复制和/或受病毒感染细胞的细胞裂解有影响的病毒 基因。优选地，对复制的影响是这样的，与其中各种病毒的癌基因蛋白缺 失的情形相比，病毒在癌基因蛋白存在下复制得更好。该过程在本文中也称为反式激活，当反式激活是通过E1A介导时，具体地称作E1A反式激活。术语"反式激活"优选地描述以下过程，即各种病毒癌蛋白对一个或多 个不同于编码病毒癌蛋白基因本身基因的其它基因的表达和/或转录有影 响，即优选控制其表达和/或翻译，特别是激活它(们)。这些病毒基因优选地为ElB55kDa、 E4orf6、 E4orf3禾tl E3ADP，以及前述基因和基因产 物各自的任何组合。根据本发明使用的腺病毒的另一个尽管只是优选地任选的特征是它们 对肿瘤抑制剂Rb的结合特征。原则上，本发明包括，根据本发明使用的 腺病毒能或不能与Rb结合。两种腺病毒备选实施方案的任一种的应用可 独立于要处理细胞的Rb状态。为了赋予不结合Rb的能力，可以对ElA癌蛋白进行下列缺失如CR1 区域(Ad5中氨基酸位点30-85)的缺失和CR2区域(AD5中氨基酸位点 120-139)的缺失。在进行过程中，CR3区域被保留，且可对其它早期病 毒基因具有反式激活功能。但是，为了赋予ElA结合Rb的能力，下列对E1A癌蛋白的缺失原则 上是可能的CR3区域(氨基酸位点140-185)的缺失；N-末端(氨基酸 位点1-29)的缺失；氨基酸位点85-119的缺失；和C-末端(氨基酸位点 186-289)的缺失。上述列出的区域不影响E2F与Rb的结合。反式激活功 能保持完整，但是与野生型Ad5相比有所降低。与本发明相关，要根据本发明使用的各种腺病毒的修饰的E1A癌蛋白 能够在YB-1核-阳性的细胞中反式激活早期病毒基因，例如E1B55K， E4orf3, E4or伤，E3ADP。与此相关，优选地，对病毒基因组无其它改变， 各种腺病毒可以另外对应于野生型的腺病毒或其任何衍生物。在本文中公开的编码或包含反式激活本发明意义上的癌基因蛋白的 病毒，包含例如腺病毒AdA24, dl922-947, ElAd/01/07， CB106禾口/或在欧洲 专利EP 0 931 830中所述的腺病毒，其各自能够反式激活早期基因，如E1B， E2, E3禾卩/或E4，并且比得上野生型腺病毒，特别是野生型Ad5。在这些 情况下，E1A蛋白的特定区域负责反式激活。在各种腺病毒的血清型中， 在E1A蛋白中存在3个高度保守的区域。氨基酸位点41-80的CR1区域， 氨基酸位点120-139的CR2区域和氨基酸位点140-188的CR3区域。反式 激活功能主要基于E1A蛋白中CR3区域的存在。CR3的氨基酸序列在前 述腺病毒中以未改变的方式存在。这导致早期基因E1B, E2, E3和E4的反 式激活，其独立于YB-1存在于核还是细胞质中。然而，在重组腺病毒d1520中，CR3区域已经缺失。因此，dl520表 达所谓的E1A12S蛋白，其不包含CR3区域的氨基酸序列。结果，d1520 仅可以发挥极弱的反式激活功能，特别是在E2区域，因此在YB-l核-阴 性的细胞中不复制。在YB-l核-阳性的细胞中，YB-1反式激活E2区域， 并因此允许d1520的有效复制。为了本文所述目的的象d1520的系统和源 自d1520的系统的应用以此为基础。两种前述腺病毒组(例如S24 (本文 也称为AdA24)和dl520)之间的另一重要区别在于，与YB-l核-阴性的 细胞相比，早期基因E1B、 E3和E4在YB-1核-阳性的细胞中被dl520更 强烈地反式激活。与此相反，用524没有或仅有微小差异。然而，与野生 型腺病毒相比，dl520和更具体地ElA12S蛋白的反式激活作用显著降低。 然而，该反式激活足以提供YB-l核-阳性的细胞中的有效复制，也如实施 例10所示。在本文所述的特别是在这方面所述的E1A蛋白的设计，和编 码它们的核酸的设计，以便E1A蛋白与野生型癌基因蛋白E1A相比具有 一个或数个缺失和/或突变，其中缺失优选是选自包含CR3区域的缺失和 N-末端的缺失和C-末端的缺失的组，包括和特别优选如与dl520或AdA24、 d1922 一 947， ElAd/01/07、 CB106禾口/或在欧洲专利EP 0 931 830中所述腺 病毒相关的所述的E1A蛋白的那些实施方案，是病毒特别是腺病毒的实施 方案，其复制受到YB-1由激活E2-晚期启动子的激活控制，优选主要由 激活E2-晚期启动子的激活控制。本领域技术人员基于本文提供的内容可 以产生允许腺病毒的该形式的复制的E1A蛋白的其他实施方案。将新构建的腺病毒在本文中也称为衍生物，且可以根据本发明使用， 它们典型地具有El缺失、El/E3缺失和/或E4缺失，即相应的腺病毒分别 不能产生功能活性的El和/或E3和/或E4表达产物和相应的产物。或者换句话说，这些腺病毒仅能够产生在功能上无活性的E1、 E3和/或E4表 达产物，其中功能上无活性的El、 E3和/或E4表达产物是这样的表达产 物，其或者根本不作为表达产物存在，无论是转录水平和/或翻译水平，或 者它以至少缺少一种功能(在野生型腺病毒中存在该功能)的形式存在。 野生型腺病毒的该表达产物的该功能为本领域技术人员所已知，例如在 Russell， W. C.， Journal of Virology, 81， 2573-2604, 2000中描述。Russell (上 文)也描述了腺病毒和腺病毒载体的构建原理，其结合于此作为参考。本 发明还包括，修饰的EIA癌蛋白，即E1B-55K、 E4orf6禾口/或E3ADP (腺 病毒死亡蛋白(ADP))(Tollefson， A.等，J. Virology, 70， 2296-2306， 1996)在这 样的载体中单独地或任意组合地表达。单独提及的基因以及本文公开的转 基因可以克隆到El和/或E3和/或E4区域中，并且可以使用适当的启动 子或在适当启动子的控制下相互独立地表达。基本上，El、 E3和E4区 类似地适合作为腺病毒核酸内的克隆位点，其中不用于克隆的区域可以单 独或者一起存在、被部分缺失和/或完全缺失。对于存在这些区域的情况， 尤其完全存在的情况，本发明包括，它们是完整的并且优选提供翻译产物 和/或转录产物，和/或不是完整的并且优选不提供翻译产物和/或转录产物。 合适的启动子为例如本文中分别关于E1A、尤其经修饰的E1A的控制和 表达公开的那些启动子。
最后，在一个实施方案中，将根据本发明使用的腺病毒是E1B缺陷型 的，特别是E1B 19kDa缺陷型的。如本文使用的，术语缺陷型通常是指 一种状况，其中E1B不能表现出野生型E1B内在的所有特征，并且缺少 这些特征中的至少一个。腺病毒BCL2同源物ElB19k通过与程序性细胞 死亡前蛋白(pro-apoptotic protein) Bak和Bax相互作用抑制E1A诱导的程 序性细胞死亡。因为此原因，在受感染的细胞中最大的复制和/或颗粒形成 是可能的(Ramya Sundaramjan禾口 Eileen White, Journal of Virology 2001， 75, 7506-7516)。 ElB19k的缺乏导致病毒的更好的释放，因为它降低了腺病毒 死亡蛋白的功能(如果存在)。通过此类缺失增强该病毒诱导的细胞病变 效应(Ta-Chiang Liu等，Molecular Therapy, 2004)，并且从而导致受感染 的肿瘤细胞的更强的裂解。此外，ElB19k的缺乏导致TNF — a对肿瘤细 胞中此类重组腺病毒的复制没有影响，而在正常细胞中，该处理导致感染 性病毒的复制和释放减弱。从而，选择性和特异性增强(Ta-ChiangLiu等， Molecular Therapy 2004， 9， 786-803)。根据本文公开的本发明使用的腺病毒 在一些实施方案中基本上是本领域已知的。根据本发明使用的腺病毒优选地是重组腺病毒，更具体地，如果与野 生型相比，在本文提供的技术教导的意义上己经进行了变化。缺失或诱变 与本发明无关的那些腺病毒核酸序列为本领域技术人员所知。如本文所 述，这些缺失可以例如与编码E3和E4的核酸的一部分有关。如果这些缺失不延伸至蛋白E4orf6，或换句话说，要根据本发明使用的腺病毒能编码 E4orf6，特别优选的是E4缺失。在优选的实施方案中，这些腺病毒核酸 可以还包装在病毒衣壳中，并因此形成感染性的颗粒。对根据本发明的核 酸的应用同样如此。通常应当注意，腺病毒系统可以缺失单个或数个表达 产物。与此相关，应当考虑这可能是由编码该表达产物的核酸的突变或缺 失造成的，其中这样的突变和缺失分别是彻底的，或者达到不再形成表达 产物的程度，或者由控制表达的启动子或者转录因子的缺乏、或者以不同 于野生型的方式发生活化所造成，所述缺失或活化分别在核酸水平上(缺 少启动子；顺式-作用元件)或在翻译系统和转录系统水平上(反式-作用 元件)。特别是后一方面可能依赖于细胞的背景。除了使用根据本发明的已知的腺病毒以外，根据本发明还可以使用新 的腺病毒，对其的使用相同于已经公幵的在本文所述的其它腺病毒。本发 明的新的腺病毒来自本文提供的技术教导。特别优选的代表是，例如，在 图l6和

图17中描述的病毒Xvir03和Xvir03/01，其设计原理也进一步在 实施例11和12中说明。在载体Xvir03的情形中，将CMV启动子克隆到E1区域中，该El区 域编码被IRES序列分开的E1B 55K和E40RF6的核酸。与此相关，E3 区域可以是部分或者完全缺失的或者可以存在并且是完整的。由于分别引 入这两个基因和由于其产生的基因产物，产生了几乎对应于野生型病毒之 一的复制效率，其中对细胞，特别是肿瘤细胞保持了复制的选择性，复制 特别发生在YB-1核-阳性的细胞中、更具体地在去调节YB-1的那些细胞 中。其中存在去调节的YB-1的细胞优选为显示出与正常的或非肿瘤的细 胞相比增加的YB-1表达，优选隔室独立表达的细胞。还可以通过克隆进
行ElB55k和E4orf6向E4区域中的导入，其中E3区域可以是完整的和/ 或部分或完全缺失的。另外开发的病毒Xvir03是病毒Xvir03/01，在优选的实施方案中，其 中已经克隆了在特定启动子、尤其是肿瘤特异性的或组织特异性的启动子 控制下的治疗基因或转基因。该病毒范围内，E4区域也是功能上无活性 的，优选缺失。本文所述的转基因也可以克隆到E4区域中，其中这可以 作为备选或除了转基因克隆到E3区域中以外而发生，并且E3区域保持部 分或者完全完整。如本文使用的转基因可以分别是治疗基因或者病毒基 因，优选腺病毒基因，其优选不存在于野生型腺病毒的基因组中或基因组 中的位置上，其中它们现在存在于该具体的病毒。在优选实施方案中，分别关于根据本发明的腺病毒和根据本发明的腺 病毒复制系统和根据本发明它们的用途，腺病毒核酸对于癌基因蛋白、尤 其E1A蛋白的表达缺失，这意味着它不编码12S E1A蛋白或不编码13S E1A蛋白，或者它不编码12S E1A蛋白也不编码13S E1A蛋白，或被修 饰的，如本文所定义，腺病毒复制系统另外还包含辅助病毒的核酸，其中 辅助病毒的核酸包含编码癌基因蛋白、特别是E1A蛋白的核酸序列，其分 别具有下列特征和赋予腺病毒下列特征它优选不在YB-1核-阴性的细胞 中复制，而在独立于细胞周期的YB-1核-阳性的细胞中复制，反式激活至 少一种病毒基因，特别是ElB55kDa， E4orf6， E4orf3禾口/或E3ADP，在YB-1 核-阳性的细胞中，和/或不将细胞YB-l转移至核内。本发明包括，本文所 述转基因是由辅助病毒单独地或集中地编码和/或由其表达。病毒组§2再次为了清楚的原因，这些病毒分类为i组和n组。首先在涉及病毒 组§2的权利要求中定义的病毒在本文中也称作i组腺病毒，包含反式激活癌基因蛋白如E1A的腺病毒和/或在本文中称作、尤其上面根据本发明使 用的那些腺病毒在本文中称作II组腺病毒。I组和II组腺病毒在本文中一 起称作腺病毒或者根据本发明的腺病毒或者根据本发明的病毒。另外，优 选地，在本发明的范围内，涉及I组的本文所述的任何特征、实施方案和/ 或用途同样适用于II组，反之亦然。
这些病毒是基于一项意外发现，即腺病毒基因的表达序列的反转导致 有效的复制和任选地裂解受腺病毒感染的细胞。优选地，相比于在野生型病毒，优选野生型腺病毒中各自基因的表达和/或可利用次序(order)，这种 反转是按时间顺序(chronological)分别反转基因的表达禾B/或可利用性和基 因产物。关于腺病毒基因的时间上的变化的表达，重点放在E1B蛋白和 E4蛋白上，它们在这里还单独地或集中地称作第一种蛋白，它们在第二 种蛋白之前表达。第二种蛋白选自包含E1A蛋白的组。该表达顺序与野生 型腺病毒相比是反转的，在野生型腺病毒中，首先表达E1A蛋白，随后才 表达E1B蛋白和E4蛋白，以确保激活转录因子，例如转运进受感染的细 胞的核中，并影响或控制进一步的复制活性。野生型腺病毒中的腺病毒转 录物的动力学记载在例如Glenn G. M.和Ricciardi R. P. Virus Research 1988, 9， 73-91中，其报道说，在野生型中，通常在转录物和翻译产物(分别是 E4orf6和ElB55k)之前就可以检测到E1A转录物(即E1A12S转录物和 E1A13S转录物)。在本文中，如果没有相反的说明，E1B蛋白通常优选地 是ElB-55kD蛋白。在本文中，如果没有相反的说明，E4蛋白通常优选 地是E4orf6蛋白。在本文中，如果没有相反的说明，E1A蛋白通常优选 地是E1A12S蛋白，或者是在本文中所述的与ElA-修饰的腺病毒有关的 E1A蛋白。在这些病毒中，，原则上E1A蛋白(更具体地也是E1A12S蛋白)可 以是取代的。如果没有相反的说明，这种取代的E1A蛋白和E1A12S蛋白 在本文中也分别称作E1A蛋白和E1A12S蛋白，或者认为是由该术语包括。 不只是E1A12S蛋白，还可以使用具有肿瘤抑制功能的E1A蛋白，例如 Dickopp A, Esche H， Swart G, Seeber S, Kirch HC， Opalka B. Cancer Gene Ther. 2000, M;7(7):1043-50中所记载的。如这里所使用的和/或提及的E1A 蛋白(特别是E1A12S蛋白)的其它衍生物，通常也是能从Rb/E2F复合 体中释放出因子E2F的蛋白。它们特别是如Chellappan S.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 4549-4533所述的猿猴病毒40肿瘤抗原(SV40大 T抗原)、乳头状瘤病毒E7蛋白(HPVE7)。在这些病毒中，可以使用E4orf6和ElB55k的衍生物，如这里所使用 的，其中所述的术语E4orf6和ElB55k包含这样的衍生物。衍生物记载在
例如Shen Y等，J. of Virology 2001， 75， 4297-4307; Querido E.等，J. of Virology 2001, 75， 699-709中。在这些病毒中，E1B蛋白在E1A蛋白之前表达，或E4蛋白在E1A蛋 白之前表达，或E1B蛋白和E4蛋白都在E1A蛋白之前表达，每一种都如 上所述。以该方式设计的腺病毒能在感染细胞后以特别高的水平复制，所述的 细胞在核中表达YB-1，优选地在独立于细胞周期的核中表达YB-1，或者其包含去调节的YB-1，优选在细胞质中。希望不限于此，本发明的发明 人在下面假设，E1B蛋白和/或E4蛋白组成的复合物和这两种蛋白中的单 独一种分别能将去调节的YB-1转运进细胞核中，或者能在先于E1A蛋白 表达的E1B蛋白和/或E4蛋白的影响下在那里启动腺病毒的复制。 一旦在 细胞核中或者以活化的形式存在于那里，如这里所述，更具体地使用E2-晚期启动子，YB-1有效地复制。因此，E1B蛋白和/或E4蛋白的时间上 较早表达避免了在伴有E1A蛋白的初始表达的野生型中观察到的级联。在 一个优选的实施方案中，E1A蛋白是特别不再反式激活或仅能将E1B蛋 白和/或E4蛋白反式激活到非常有限程度的ElA蛋白。优选地，该反式激 活既不足以确保有效的复制，也不足以确保在细胞中的复制，所述细胞的 核中不含有YB-1。优选的是，反式激活不发生在这样的细胞中，其独立 于细胞周期的核中不含有YB-1，或者不具有去调节的YB-1。而且，这些病毒是基于一项意外发现，即腺病毒能以特别有效的方式 复制，如果其包含至少一种能编码蛋白的核酸，其中所述的蛋白选自包含 E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白的组，其中的至少一种蛋白在启动子的控 制下，所述启动子与在野生型腺病毒中控制各蛋白表达的启动子不同。这 样的复制是特别有效的，且通常导致肿瘤裂解，如果该细胞在核中含有 YB-1，特别是在独立于细胞周期的核中含有YB-1，或者如果该细胞含有 去调节的YB-1，特别是在细胞质中含有去调节的YB-1。已经在上面关于 E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白描述的内容也适用于此。在野生型腺病毒 中，E1B蛋白由E1B启动子控制，E4蛋白由E4启动子控制，E1A蛋白 由E1A启动子控制。通过选择与在野生型腺病毒中控制前述蛋白表达的启 动子不同的启动子，由此改变前述蛋白的表达以及各腺病毒核酸和蛋白的
调节性的相互作用。通过选择启动子，可以建立时间上不同的表达图谱， 希望在下面不受此限制，导致细胞中观察到的复制，其中的机制可能是己经在前面关于腺病毒蛋白E1B、E4和E1A的时间上不同的表达所描述的。通过启动子(与在野生型腺病毒中控制各蛋白的表达的启动子不同)控制 所述蛋白的具体设计的实例，可以从下面的权利要求和实施例部分中得至lj，其中更具体地，提及的病毒XVirPSJLl和XVirPSJL2是其中的代表性 的。优选地，ElB蛋白是ElB55kD蛋白，E4蛋白是E4orf6蛋白，且E1A 蛋白是E1A12S蛋白。优选地控制E1B蛋白和E4蛋白的启动子选自包含肿瘤特异性的启动 子、器官特异性的启动子、组织特异性的启动子、异源启动子和腺病毒启 动子的组，其条件是，当使用腺病毒启动子时，它们与控制E1B蛋白表达 的E1B启动子不同，且与控制E4蛋白表达的E4启动子不同。特别优选 的是，使用E1A启动子控制E1B蛋白和/或E4蛋白表达。E1A启动子记 载在例如BoulangerP. A.禾口 Blair, G. E. Biochem. J. 1991， 275, 281-299中。 另外，还可以使用每一种和任何其它的异源启动子，即与在野生型腺病毒 中控制各蛋白表达的启动子不同的启动子。代表性的实例是CMV启动子， 其它的启动子对本领域的技术人员而言是显而易见的。用于控制E1A蛋白的启动子还可以选自包含肿瘤特异性的启动子、器 官特异性的启动子、组织特异性的启动子、异源启动子和腺病毒启动子的 组，其条件是腺病毒启动子与E1A启动子不同。本发明包括，前述蛋白(即 E1B蛋白、E4蛋白或E1A蛋白)中的一种或多种是在相同启动子的控制 下，尽管如此，优选的是，特别是E1B蛋白和E4蛋白是在相同启动子的 控制下。特别优选的是，E1A蛋白的表达由YB-l-控制的启动子或可以被 YB-1调节的启动子控制。这样的启动子在本文中与本发明的其它方面有 关地公开。特别优选地，用腺病毒E2-晚期启动子控制E1A启动子的表达， 因为它首先可以被YB-1调节，其次还在没有YB-1的情况下仅仅表现出 微小的实际上可以忽略的转录，因而能确保非常好地控制由E2-晚期启动 子控制的核酸的表达。认可的是可以使用其它YB-1独立的或YB-1控制 的启动子，它们对于本领域的普通技术人员而言是已知的，或在本文进行 了描述。这显著地提高了生物安全性，特别是当用于医药领域时。
而且，本发明的发明人已经发现，腺病毒在细胞中能特别好地复制， 所述的细胞在核中含有YB-1，更具体地在独立于细胞周期的核中含有YB-1，和/或含有去调节的YB-1，优选地在细胞质中含有去调节的YB-1， 如果直接地或间接地特别是在细胞核中为复制提供YB-1，或者如果YB-1 的提供是直接地或间接地通过腺病毒蛋白介导，其中所述的腺病毒蛋白与 E1A不同。本发明的该方面与本文中同样公开的方面不同，即反式激活 ElA-修饰的腺病毒优选II组腺病毒的应用能使这些病毒在YB-1核-阳性 的肿瘤细胞中复制，特别是YB-1阳性的独立于细胞周期的YB-1核-阳性 的细胞，以及含有去调节的YB-1、特别是在细胞质中含有YB-1的那些细 胞，在这里没有利用E1A蛋白(特别是E1A13S蛋白)的反式激活特征， 即关于I组腺病毒，而是在一个优选的实施方案中，E1A13S蛋白是功能 上失活的，因而不再能反式激活E4orf6和ElB55k，它们分别直接地或间 接地参与YB-1向核中的转运和提供。结果，根据本发明的该方面，不能 有效地复制腺病毒。在该范围内，现在核中的YB-1的提供和为腺病毒复 制进行的YB-1的提供分别不再受E1A蛋白的直接或间接参与的控制，而 是通过不受E1A控制的E1B蛋白(特别是ElB55kD蛋白)禾口/或E4蛋白 (特别是E4orf6蛋白)的表达来实现。腺病毒的该实施方案还可以通过上述措施中的一种来实现，例如通过 与E1A蛋白的表达相比，提前E1B蛋白和/或E4蛋白的时间上表达，或 者通过将E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白中的一种或多种置于与在野生型 腺病毒中控制各蛋白的表达的启动子不同的启动子的控制下。最后，本发明的发明人从意外的发现开始，即有效的腺病毒复制还可 以发生特别是在核中含有YB-1的细胞中，更具体地在独立于细胞周期的 核中含有YB-1的细胞中，或者在含有去调节的YB-1、优选在细胞质中含 有去调节的YB-1的细胞中，如果E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白中的至 少一个、特别是它们的优选形式是在启动子控制下的表达盒中表达。在本 发明的一个实施方案中，基本提供了3种表达盒，每一个都含有单独一种 所述蛋白。在一个备选实施方案中，表达盒还可以分别含有两种或多种蛋 白E1B、 E4和E1A和它们的衍生物以及可能的替代物，特别是在E1A12S 的情况下。以前所述的关于腺病毒包含与蛋白E1B、 E4和E1A有关的核酸的内容，也适用于设计各种蛋白和各自使用的启动子。当使用这样的表 达盒时，优选的是，完全地或部分地缺失了野生型腺病毒的基因组中的蛋 白及编码它们的核酸，所述蛋白对应于表达盒的各蛋白，以确保病毒是稳 定的，并防止重组，至少是在较大的程度上。原则上，可以将表达盒分别克隆进腺病毒的每个区域和每个位点，其 中优选地将一个或几个表达盒分别地或彼此组合地插入到病毒的El区、E3区禾卩/或E4区。El、 E3和E4区的核酸可能被完全的、部分地缺失，或 者根本未被缺失，然而根据本发明关于腺病毒优选的是，编码E1A13S基 因的核酸是失活的或缺失的，所以该病毒不能提供任何反式激活E1A蛋 白。 一个或多个区域E1、 E3和E4的这种缺失程度取决于使用的表达盒和 任选地进一步导入的外源基因或转基因或含有它们的其它表达盒，即与腺 病毒基因不同的基因，至少在一定程度上不同，即它们不是由在野生型腺 病毒中占优势的腺病毒核酸的调节内容提供，也不是由在该位点的野生型 腺病毒的腺病毒核酸序列提供。本发明包括，在腺病毒基因组中部分地或 完全地缺失了在一个或多个编码E1B蛋白、E4蛋白和/或ElA蛋白的表达盒中含有的核酸。在一个实施方案中，例如在根据本发明的腺病毒 XvirPSJLl或2中，部分或完全地缺失了编码E4orf6的腺病毒核酸，但是 表达盒中含有能编码它的完整核酸。优选地，这也可以在ElB55k(也称作 El 55Kd)蛋白禾口/或E1A12S蛋白实现。缺失的程度将在优选的实施方案中 选择，以使最大包装大小达到野生型腺病毒的最大包装大小的约103%， 尽管该界限只是一个优选的界限。在腺病毒基因组中制作的可能的缺失在 优选的实施方案中只进行限制，以确保还可以生产出感染性的和包装的颗 粒。在本文公开的内容和标准实验的基础上，本领域的技术人员能够确定 缺失的精确程度。作为构建本文所述的腺病毒的起点，可以使用任何野生型腺病毒，但 是也可以使用其它的腺病毒，只要它们是根据本发明的技术教导构建的。 特别优选地使用C亚群腺病毒，在该群内又优选使用腺病毒2和腺病毒5。如果没有相反的说明，术语E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白的单复数 形式在本文中以同义的方式使用。如这里所使用的术语"去调节的"YB-1是指如这里所使用的YB-1分子或YB-1蛋白，其存在形式与在细胞中、优选地在非肿瘤细胞中通常存在的YB-1定量地和/或定性地不同。可以通过特定病毒将去调节的YB-1表征和鉴别为能在含有这样的去调节的YB-1的细胞背景中，在存在去调节的YB-1的情况下进行复制。与其相关的特定病毒是这样的，其中的E1A 蛋白是突变的且表现出反式激活功能。这些特定病毒的实例是AD524，dl 922-947， El Ad/01/07禾口 CB 016禾口/或[Howe， J. A等，Molecular Therapy 2, 485-495, 2000; Fueyo J.等，Oncogene 19, 2-12， 2000; Heise C.等，Nature Medicine 6， 1134-1139, 2001; Balague, C等，J. Virol. 75， 7602-7611， 2001; Bautista, D.S.等，Virology 1991, 182， 578-596; Jelsma T.N.等，Virology 1988， 163, 494-502; Wong, H. K.和Ziff E.B.， J. of Virology 1994, 68, 4910-4920]所 述的那些。这样的细胞和具有这样背景的细胞可以分别用于I组腺病毒和/ 或II组腺病毒的复制。另外，根据本发明的腺病毒可以裂解含有这种细胞 的肿瘤。而且，本发明是基于意外的发现，即E1A-修饰的腺病毒在YB-1核阳 性的肿瘤细胞中的DNA复制是基于E2-晚期启动子的激活。ElA-修饰的 腺病毒应当理解为是这样的，其(a)在YB-1核-阴性的细胞中的复制与 野生型相比有所减少，或根本不复制，(b)对至少一种病毒基因具有反式 激活活性，其中该基因特别选自包含ElB-55kDa、E4orf6、E4orf3和E3ADP 的组，和/或(c)不能通过腺病毒将细胞的YB-1转移至核内。任选地， 根据本发明使用的腺病毒具有其它特征，即腺病毒编码的E1A蛋白的结合 会干扰E2F与Rb的结合，并且能够溶解由E2F和Rb组成的各自复合物。 具有一个或数个前述的特征a)至c)、优选全部特征a)至c)的腺病毒在核内 不含有YB-1的细胞中是复制缺陷的。以下不希望受此束缚，本发明的发明人假定腺病毒E2表达未由E2-早期启动子(即早期E2启动子)通过人细胞E2F转录因子打开到足够的 程度(manner),所述E2F转录因子与根据本发明使用的病毒的复制相关， 还与本文公开的腺病毒的根据本发明的应用相关。在这样的环境下，复制 的开始独立于细胞的Rb状态，即使用本文公开的病毒感染的和优选随后 裂解的肿瘤细胞可以包含功能性的以及无活性的Rb蛋白。另外，使用本文公开的腺病毒或使用本文公开的条件的腺病毒的复制不需要任何功能 性的p53蛋白，但是也不受其存在的负面影响。如此，该技术教导背离了 使用能消解肿瘤或能裂解肿瘤的腺病毒的原理，所述腺病毒的类型为AdA24、 dl922画947、 ElAd/01/07、 CB016，或例如在欧洲专利EP 0 931 830 中描述的那些腺病毒，其已经在以下假设下在E1A蛋白中引入了一个和/ 或数个缺失完好的功能性的Rb蛋白会阻碍体内有效复制，因此仅在Rb-阴性和Rb-突变细胞中体内地提供了腺病毒的复制。现有技术的这些腺病 毒系统是基于E1A，以便通过早期E2启动子(E2早期启动子)禾n"自由 E2F"控制腺病毒的体内复制。然而，根据本发明可以将现有技术中的这些 已知病毒用于细胞中的复制，所述细胞在独立于细胞周期的核内含有 YB-1，或者含有去调节的YB-1。根据本发明可以使用在所述欧洲专利EP0 931 830中描述的病毒，特 别是腺病毒。更具体地，在所述专利中描述的病毒是复制缺陷的，且不能 表达病毒癌蛋白的病毒，该癌蛋白能够结合功能性的Rb肿瘤抑制基因产 物。腺病毒可以具体地为不能表达病毒E1A癌蛋白的任何腺病毒，该E1A 癌蛋白能够结合功能性的肿瘤抑制剂基因产物，更具体地是Rb。病毒ElA 癌蛋白可以表现出失活突变，例如在腺病毒Ad5 (在本文中也称作Ad5) 的氨基酸位点30-85的CR1结构域，在核苷酸位点697-7卯和/或Ad5的 氨基酸位点120-130的CR2结构域，核苷酸位点920-967，其涉及p105 Rb 蛋白、p130和p107蛋白的结合。但是，本发明还包括，腺病毒是类型2 的dl312或类型5的NTdl 1010。一部分要根据本发明使用的腺病毒(它们与本发明的其它腺病毒不 同)的另一特征是它们编码在此也称为癌基因蛋白的病毒癌基因，其中癌 基因蛋白优选为E1A，其中癌基因蛋白能够激活至少一个对病毒复制和/ 或受病毒感染细胞的细胞裂解有影响的病毒基因。优选地，对复制的影响 是这样的，与其中各种病毒的癌基因蛋白缺失的情形相比，病毒在癌基因 蛋白存在下复制得更好。该过程在本文中也称为反式激活，当反式激活是 通过E1A介导时，具体地称作E1A反式激活。术语"反式激活"优选地描 述以下过程，即各种病毒癌蛋白对一个或多个不同于编码病毒癌蛋白本身 基因的其它基因的表达和/或转录有影响，即控制其表达和/或翻译，特别 是激活它们。这些病毒基因优选地为ElB55kDa、 E4orf6、E4orf3和
E3ADP，以及前述基因和基因产物各自的任何组合。根据本发明使用的腺病毒和本发明的腺病毒的另一个尽管只是任选的特征分别是它们对肿瘤抑制剂Rb的结合特征，以及由它们编码的蛋白中 的具体一些的对肿瘤抑制剂Rb的结合特征。基本上，本发明包括，根据 本发明使用的腺病毒能或不能与Rb结合。两种腺病毒备选实施方案的任 一种的应用独立于处理的或要处理细胞的Rb状态。为了赋予ElA不结合Rb的能力，可以对E1A癌蛋白进行下列缺失 CR1区域(Ad5中氨基酸位点30-85)的缺失和CR2区域(AD5中氨基酸 位点120-139)的缺失。在进行过程中，CR3区域被保留，且可对其它早期病毒基因具有反式激活功能。但是，为了赋予ElA结合Rb的能力，下列对E1A癌蛋白的缺失基本 上是可能的CR3区域(氨基酸位点140-185)的缺失；N-末端(氨基酸 位点1-29)的缺失；氨基酸位点85-119的缺失；和C-末端(氨基酸位点 186-289)的缺失。上述列出的区域不影响E2F与Rb的结合。反式激活功 能保持完整，但是与野生型Ad5相比有所降低。本发明还包括，特别是关于本发明的腺病毒，将E1A蛋白、特别是 E1A12S蛋白设计成这样，在一个实施方案中，它能结合到Rb，在不同的 实施方案中，它不能结合到Rb，其中这样的E1A12S蛋白是E1A蛋白， 更具体地是本发明意义上的E1A12S蛋白，然而其在现有技术中有时称作 修饰的E1A12S。 E1A12S蛋白的各种设计，更具体地关于E1A蛋白(它 在本文中也简称为E1A)的前述缺失，均为本领域技术人员所知。在现有技术中基本已经已知的且没有显示出任何反式激活的这些腺 病毒通常认为是复制缺陷型。然而，本发明的发明人的贡献在于，已经发 现这类病毒仍然能够在适当背景下特别是适当的细胞背景下复制。YB-1 在核内的存在，优选YB-1在核内的独立于细胞周期的存在，或去调节的 YB-1，能产生或提供该适当的细胞背景。在本发明的一个和任何其它方面 所用的术语细胞或细胞系统包含细胞提取物的片段或级分，以及体外、体 内或原位存在的细胞。在这个程度上，术语细胞系统或细胞还包含分别存 在于细胞培养物、组织培养物、器官培养物或任何体内和原位组织或器官 中的细胞，其为分离的、成群的或作为组织、器官或生物体的一部分，但
是也同样在优选的活体中存在。生物体优选地为任何脊椎生物，更优选哺 乳动物。更优选地，生物体是人生物体。其它优选的生物体是根据本发明 的各个方面公开的那些。与本发明相关，根据本发明使用的各种腺病毒的修饰的E1A癌蛋白能够在YB-1核-阳性的细胞中或包含去调节的YB-1的细胞中反式激活早期 病毒基因，例如E1B55K， E4orf3, E4orf6, E3ADP。优选地，对病毒基因 组无其它改变，各种腺病毒在此程度上可以另外对应于野生型的腺病毒或 其衍生物。在本文中公开的编码或包含本发明意义上的反式激活癌基因蛋白的病 毒，包含例如腺病毒AdA24， dl922-947, ElAd/01/07， CB106和/或在欧洲专 利EP 0 931 830中所述的腺病毒，其各自能够反式激活早期基因，如E1B， E2, E3和/或E4，并且比得上野生型腺病毒，特别是野生型Ad5。在这些 情况下，E1A蛋白的特定区域负责反式激活。在各种腺病毒的血清型中， 在E1A蛋白中存在3个高度保守的区域。氨基酸位点41-80的CR1区域， 氨基酸位点120-139的CR2区域和氨基酸位点140-188的CR3区域。反式 激活功能主要基于E1A蛋白中CR3区域的存在。CR3的氨基酸序列在前 述腺病毒中以未改变的方式存在。这导致早期基因E1B, E2， E3和E4的反 式激活，其独立于YB-1存在于核还是细胞质中。与此相反，在重组腺病毒d1520中，CR3区域已经缺失。因此，d1520 表达所谓的E1A12S蛋白，其不包含CR3区域的氨基酸序列。结果，d1520 仅可以发挥极弱的反式激活功能，特别是在E2区域，因此在YB-1核-阴 性的细胞中不复制。在YB-1核-阳性的细胞中，YB-1反式激活E2区域， 并因此允许d1520的有效复制。为了本文所述目的，象d1520的系统和源 自它们的系统的应用以此为基础。两种前述腺病毒组(例如524 (本文也 称为AdA24)和例如d1520)之间的另一重要区别在于，与YB-1核-阴性 的细胞或不含有去调节的YB-1的细胞相比，早期基因E1B、 E3和E4在 YB-1核-阳性的独立于细胞周期的细胞或含有去调节的YB-1的细胞中被 更全面地反式激活。与此相反，在S24中没有或仅有微小差异。然而，与 野生型腺病毒相比，d1520和更具体地E1A12S蛋白的反式激活作用显著 降低。然而，该反式激活足以提供YB-l核-阳性的细胞中的有效复制，也
如实施例10所示。在本文所述的特别是在这方面所述的E1A蛋白的设计，和编码它们的核酸的设计，以便E1A蛋白与野生型癌基因蛋白E1A相比 具有一个或数个缺失和/或突变，包括和特别优选如与d1520或AdA24、 d1922 — 947， E1A薩/07、 CB106和/或在欧洲专禾(J EP 0 931 830中所述腺 病毒相关的所述的E1A蛋白的那些设计，是病毒特别是腺病毒的实施方 案，其复制受到控制，优选主要由激活E2-晚期启动子控制。优选地，缺 失是选自包含CR3区域的缺失和N-末端的缺失和C-末端的缺失的组。基 于本文提供的公开内容，本领域技术人员可以产生E1A蛋白的其它允许这 种腺病毒复制形式的实施方案。如前所述的E1A蛋白的实施方案是也可以 根据本发明的腺病毒使用的实施方案，所述的腺病毒在本文中也称作本发 明的腺病毒或I组腺病毒。本发明的腺病毒、特别是I组腺病毒在本文中也称为衍生物，且可以 根据本发明使用，它们典型地包含E1缺失、E1/E3缺失禾口/或E4缺失，即 相应的腺病毒分别不能产生功能活性的El禾口/或E3禾口/或E4表达产物和 相应的产物。或者换句话说，这些腺病毒仅能够产生在功能上无活性的 El、 E3和/或E4表达产物，其中功能上无活性的E1、 E3和/或E4表达产物是这样的表达产物，其或者无论是转录水平和/或翻译水平上根本不作为 表达产物存在，或者它以至少缺少一种功能(在野生型腺病毒中归因于它) 的形式存在。野生型腺病毒的表达产物固有的这个/这些功能为本领域技术 人员所已知，例如在Russell, W. C., Journal of Virology, 81, 2573-2604， 2000 中描述。Russell (上文)也描述了腺病毒和腺病毒载体的设计原理，其结 合于此作为参考。本发明还包括，修饰的E1A癌蛋白，即不再反式激活的 EIA蛋白和其它的蛋白，例如E1A12S、 E1B-55K、 E4orf6禾口/或E3ADP (腺病毒死亡蛋白(ADP))(Tollefson， A.等，J. Virology, 70, 2296-2306， 1996) 在这样的载体中单独地或任意组合地表达。单独提及的基因以及本文公开 的转基因可以相互独立地克隆到El和/或E3和/或E4区域中，并且可以 使用适当的启动子或在适当启动子的控制下表达。基本上，El、 E3和E4 每一个区域适合作为腺病毒核酸内的克隆位点，其中不用于克隆的区域可 以存在或者部分和/或完全缺失。对于这些区域存在，尤其完全存在的情况， 本发明包括这些区域是完整的并且优选提供翻译产物和/或转录产物，和/
或不是完整的并且优选不提供翻译产物和/或转录产物。在一些实施方案 中，适当的启动子分别是与E1A、优选修饰的E1A的控制和表达有关的 在本文中公开的那些。最后，在一个实施方案中，根据本发明使用的n组腺病毒是EiB缺陷型的，特别是E1B 19kDa缺陷型的。如本文一般地使用的，术语缺陷型 通常是指一种状况，其中E1B不能表现出野生型E1B的所有特征，并且 缺少这些特征中的至少一个。腺病毒BCL2同源物ElB19k通过与程序性细胞死亡前蛋白Bak和Bax 相互作用避免E1A诱导的程序性细胞死亡。因为此原因，在受感染的细胞 中最大的复制和/或颗粒形成是可能的(Ramya Sundararajan和Eileen White， Journal of Virology 2001， 75, 7506-7516)。 ElB19k的缺乏导致病毒的更好的 释放，因为它(如果存在)可能最小化腺病毒死亡蛋白的功能。通过此类 缺失增强该病毒诱导的细胞病变效应(Ta-Chiang Liu等，Molecular Therapy, 2004)，并且从而导致受感染的肿瘤细胞的更强的裂解。此外， ElB19k的缺乏导致TNF — a对肿瘤细胞中此类腺病毒的复制没有影响， 而在正常细胞中，该处理导致感染性病毒的复制和释放减弱。从而，选择 性和特异性增强(Ta-Chiang Liu等，Molecular Therapy 2004， 9， 786-803)。根据本文公开的本发明使用的II组腺病毒的至少一些实施方案同样 在本领域是已知的。根据本发明使用的腺病毒优选地是重组腺病毒，更具 体地，如果与野生型相比，在本文提供的技术教导的意义上已经进行了变 化。分别缺失或诱变与本发明无关的腺病毒核酸序列为本领域技术人员所 知。如本文所述，这些缺失可以例如与编码E3和E4的核酸的一部分有关。 如果这些缺失不延伸至蛋白E4orf6，换句话说，要根据本发明使用的腺病 毒能编码E4orf6，特别优选的是E4缺失。在优选的实施方案中，这些腺 病毒核酸可以还包装在病毒衣壳中，并因此形成感染性的颗粒。对根据本 发明的核酸的应用同样如此。通常应当注意，腺病毒系统可以缺失单个或 数个表达产物。与此相关，这与I组腺病毒和II组腺病毒相关，应当考虑 这可能是由编码该表达产物的核酸的突变或缺失造成的，其中这样的突变 和缺失分别是彻底的，或者达到不再形成表达产物的程度，或者由调控元 件和控制表达的元件造成，例如以不同于野生型的方式发生缺失或活化的
启动子和转录因子，其分别在核酸水平上(缺少启动子；顺式-作用元件) 或在翻译和转录系统水平上(反式-作用元件)。特别是后一方面可能依赖 于各细胞的背景。除了使用同样已经已知的腺病毒以外，根据本发明还可以使用新的腺 病毒，例如II组腺病毒，其可用于已经公开的在本文所述对于其它腺病毒 的目的。本发明的新的腺病毒来自本文提供的技术教导。特别优选的代表是，例如，在图16和图17中描述的病毒Xvir03和Xvir03/01，其设计原 理也进一步在实施例11和12中说明。在载体Xvir03的情形中，将CMV启动子克隆到E1区域中，该El区 域控制被IRES序列分开的E1B 55K和E4orf6的核酸。与此相关，E3区 域和E4区域可以是缺失的和/或存在并且完整的。由于分别将这两个基因 克隆进病毒和由于其产生的基因产物，维持高复制功效结果以使复制特别 发生在YB-1核-阳性的细胞中、更具体地在本发明公开的意义上的包含去 调节的YB-1的那些细胞中，所述结果实际上对应于一种野生型病毒，其 中在细胞、优选是肿瘤细胞中选择性的复制。在一个实施方案中，其中存 在去调节的YB-1的细胞显示出与正常的或非肿瘤的细胞相比增加的YB-1 表达，优选YB-1的隔室独立表达。然而，通过克隆也可以将E1B 55k和 E4orf6导入E4区域，其中E3区域可以是完整的或可以是缺失的。另外开发的病毒Xvir03是病毒Xvir03/01，在优选的实施方案中，其 中已经克隆了在^^定启动子、尤其是肿瘤特异性的或组织特异性的启动子 控制下的治疗基因或转基因。与该病毒相关，E3和E3区域可以是缺失的 和/或存在且完整的。与该病毒相关，E4区域也是功能上无活性的，优选 缺失。本文所述的转基因也可以克隆到E4区域中，其中这可以作为备选 或除了转基因克隆到E3区域中以外而发生。本文所述的和特别在下面所述的转基因，还可以分别通过本发明的腺 病毒(即I组腺病毒和它们的核酸)或本发明的复制系统或与之相关地表 达，并由此包含在含有启动子和核酸序列的表达盒中，其中该核酸序列编 码一个或多个所述的转基因。El、 E3和/或E4区是腺病毒基因组中特别 合适的克隆位点，但是，克隆位点不限于此。本文所用的转基因可以是治 疗基因或病毒基因，优选腺病毒基因，其优选不包含在野生型腺病毒的基
因组中或者不存在于该基因组中的所述位点上，而它们现在存在于该特定 病毒中。
编码YB-1的核酸可以包含介导YB-1转运至核内的核酸序列，所述 YB-1可以是根据本发明使用的腺病毒，特别是II组腺病毒，也可以是本 发明的腺病毒，即I组腺病毒的一个实施方案中腺病毒的一部分。依照本 发明的核酸、腺病毒和腺病毒系统以及现有技术已知的腺病毒，例如 Onyx-015， AdA24， dl922-947, ElAd/01/07， CB016， dl 520和在专利EP 0 931 830中描述的腺病毒可以分别用作腺病毒和腺病毒系统，和相应的核酸， 结合根据本发明的这些核酸。介导核转运的适当的核酸序列为本领域技术 人员所已知，例如在(Whittaker， G.R.等，Virology, 246， 1-23， 1998; Friedberg, E.C., TIBS 17, 347， 1992; Jans， D.A.等，Bioassays 2000 Jun; 22(6): 532-44; Yoneda， Y., J. Biocehm. (Tokyo) 1997 May; 121(5): 811-7; Boulikas, T" Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1993; 3(3): 193-227; Lyons RH, Mol. Cell Biol" 7， 2451-2456, 1987)中描述。介导核转运的核酸序列可以使用不同的原理。一 种这样的原理是，YB-1与信号肽一起形成融合蛋白，或为其提供这样的 信号肽，借助该信号肽将其导入细胞核内，借此发生根据本发明的腺病毒 的复制。
可以在根据本发明使用的腺病毒、更具体地是II组腺病毒，但也是根 据本发明的腺病毒，即I组腺病毒的设计中使用的另一原理是，给YB-1 提供转运序列，其优选从细胞质中的合成开始，将YB-1转移或者移位至 细胞核内，并促进那里的病毒复制。介导转运至核的特别有效的核酸序列 的实例是HIV的TAT序列，其例如与其它该类合适的核酸序列一起记载 在Efthymiadis, A" Briggs， LJ， Jans, DA" JBC 273， 1623-1628, 1998。本发明包括，按照本发明使用的腺病毒，具体地n组腺病毒，但也是根据本发明 的腺病毒，即i组腺病毒，包含编码介导核转运的肽的核酸序列。本发明包括，YB-1以其全长的、特别是以对应于野生型YB-1的形式 存在。而且，本发明包括，YB-1作为衍生物，例如以縮短或截短形式使 用或存在。与本发明有关的可以使用或可以存在的YB-1衍生物是优选能 够结合E2-晚期启动子和因此激活腺病毒E2区域基因表达的YB-1。该衍 生物特别包含本文公开的YB-1衍生物。通过在N-末端、在C-末端或在氨
基酸序列内缺失单个或数个氨基酸可以产生其它衍生物。本发明包括，还将YB-1片段用作本发明意义上的YB-1蛋白。在:mrchottK等[JBC 2003, 278,27988-27996]的论文中公开了多种YB-1片段，其特征在于在C-和N-末端的缺失。各禾中YB-1片段的分布已经证实，冷激结构域(CSD)和C-末 端都与细胞周期调节的使YB-1进入细胞核中的转运有关。因此本发明包 括，与天然YB-1相比，与ElB55k和E4orf6的创造性表达有关的截短的 YB-1 (本文也称作YB-1蛋白)更好地迁移进核中并由此介导更强的CPE， 而不需更好地结合E2-晚期启动子，其中不能排除的是，截短的YB-1还 更好地迁移进核中并造成两种效果，即诱导CPE和结合到E2-晚期启动子。 最后，这种截短的YB-1片段也可以更好地迁移进核中并更有效地结合到 E2-晚期启动子，而不诱导更好的CPE。本发明还包括，截短的YB-1蛋白 和片段分别包含与这里公开的全长YB-1有关的其它序列，特别是细胞定 位信号序列(NLS)等。根据本发明可能的是，根据本发明使用的腺病毒、更具体地n组腺病 毒、但也包括I组腺病毒和编码它们的核酸分别可以是任何各自的腺病毒 核酸，该腺病毒核酸同样或与其它核酸序列组合导致复制事件。如本文所 解释，可能通过辅助病毒提供复制所需的序列和/或基因产物。在提及编码 核酸序列方面和在该核酸序列是已知的核酸序列的方面，本发明包括不仅 使用相同的序列，而且使用其衍生的序列。这里，术语衍生序列应当特别 是指仍产生基因产物(核酸或多肽)的任何序列，其具有的功能相应于非 衍生序列或非衍生序列的功能。这可以通过本领域技术人员已知的常规试 验确定。该衍生的核酸序列的实例是编码相同基因产物、特别是相同氨基 酸序列的那些核酸序列，然而，由于遗传密码的简并性而具有不同的碱基 序列。在一个实施方案中，分别关于根据本发明的n组腺病毒和/或根据本 发明的对应的腺病毒复制系统和根据本发明的它们应用，腺病毒核酸对于 表达癌基因蛋白是缺失的、特别是E1A蛋白缺失，即，不编码12S E1A 蛋白(本文也称作E1A12S蛋白)或不编码13S E1A蛋白(本文也称作 E1A1 S蛋白)，或者它均不编码12SE1A蛋白和13SE1A蛋白，或被修 饰的，如本文所定义，如果没有相反的说明，腺病毒复制系统另外还包含
辅助病毒的核酸，其中辅助病毒的核酸包含编码癌基因蛋白、特别是E1A 蛋白的核酸序列，其分别具有下列特征和赋予腺病毒下列特征它优选不在YB-1核-阴性的细胞中复制，而在独立于细胞周期的YB-1核-阳性的细 胞中或表现去调节的YB-1的细胞中复制，反式激活至少一种病毒基因， 特别是ElB55kDa, E4orf6， E4orf3和/或E3ADP，在YB-1核-阳性的细胞中， 和/或不将细胞YB-l转移至核内。本发明包括，本文所述转基因是由辅助 病毒单独地或集中地编码和/或表达。对于I组腺病毒和II组腺病毒均施用 辅助病毒。1组腺病毒和/或11组腺病毒以及§1和§3组病毒的特征分别在于本文 公开的各种核酸和基因产物，并可以另外包含本领域技术人员已知的且是 野生型腺病毒固有的所有那些元件(Shenk, T.: Adenoviridae: The virus and their replication. Fields Virology,第三巻,编车葺.Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley， RM.等,Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996,第67章)。如已经提到的，I组和/或II组腺病毒能够在此类细胞和细胞系统中复 制，所述细胞和细胞系统在核中具有YB-1。关于根据本发明使用的这些 腺病毒是否也能够复制和因此能够裂解肿瘤的问题，含有或不含Rb (即 成视网膜细胞瘤抑制剂产物)的细胞的状态是不相关的。另外，关于所述 腺病毒根据本发明的应用，当使用本文公开的与YB-l核-阳性的细胞(即 在独立于细胞状态的核内含有YB-1的细胞)有关的腺病毒系统时，不需 要考虑感染细胞、待感染细胞或待治疗细胞的p53的状态，该p53状态以 及Rb状态对实施本文公开的技术教导的腺病毒的复制无任何影响。反式激活的癌基因和癌基因蛋白，特别是E1A，优选II组腺病毒，可 以分别在专有的天然腺病毒启动子的控制下和/或通过肿瘤特异性的或组 织特异性的启动子控制。适当的非腺病毒启动子可以选自包含巨细胞病毒 启动子、RSV (劳斯肉瘤病毒)启动子、基于腺病毒的启动子VaI和非病 毒的YB-1启动子(Makino Y.等，Nucleic Acids Res. 1996, 15， 1873-1878)的 组。可以在本文公开的本发明任何方面使用的其它启动子是端粒酶启动 子、a甲胎蛋白(AFP)启动子、caecinoembryonic抗原启动子(CEA)(Cao,G.， Kuriyama, S.， Gao, J., Mitoro， A" Cui, L.， Nakatani， T.， Zhang, X., Kikukawa, M.， Pan, X., Fukui， H.， Qi, Z. Int. J. Cancer, 78， 242-247, 1998)、 L-丝束蛋白
启动子(Chung, I., Schwartz, PE.， Crystal, RC.， Pizzorno， G, Leavitt, J.， Deisseroth， AB. Cancer Gene Therapy, 6， 99-106， 1999)、精氨酸血管升压素 启动子(Coulson， JM, Staley, J., Woll, PJ. British J. Cancer， 80， 1935-1944， 1999)、E2f启动子(Tsukada等Cancer Res,， 62, 3428 — 3477， 2002)、uroplakin II启动子(Zhang等，Cancer Res.， 62， 3743-3750， 2002)和PSA启动子 (Hallenbeck PL, Chang, YN, Hay, C, Golightly, D., Stewart, D., Lin， J., Phipps， S., Chiang, YL. Human Gene Therapy, 10, 1721-1733, 1999)、酪氨酸酶启动 子(Nettelbeck, DM. Anti-Cancer Drugs, 14， 577-584， 2003),环加氧酶2启 云力子(Nettelbeck, DM.， Rivera, AA, Davydova, J., Dieckmann， D.， Yamamoto, M.， Curiel, DT. Melanoma Res., 13, 287-292， 2003)，和诱导系统例如四环素 (Xu， XL, Mizuguchi, H.， Mayumi, T.， Hayakawa， T. Gene, 309, 145-151, 2003)。另外，如德国专利申请DE 101 50 984.7所述的腺病毒的YB-1依 赖性E2-晚期启动子是可以用于本发明的启动子。本发明包括，上述多种启动子也用于根据本发明的腺病毒、优选I组 腺病毒以及与病毒§1组和病毒§2组的多种实施方案中，尤其当将使用的 启动子不同于控制野生型腺病毒中各自蛋白质或表达产物的表达的启动 子时。从而，前述启动子是本发明意义中的合适的异源启动子。在根据本 发明的腺病毒、尤其I组腺病毒的优选实施方案中，预期当直接或间接应 用与细胞相关的腺病毒或将腺病毒应用于细胞时，所述细胞以独立于细胞 周期的方式在核内具有YB-1，或者以独立于细胞周期的方式在核内不具 有YB-1但包含如本文定义的去调节的YB-1，发生这种情况使得E1B蛋 白和/或E4蛋白的表达从此类异源启动子发生，其中优选地，但不排除， 通过YB-1控制E1A蛋白质的表达。E1A蛋白的表达在这个和其他实施方 案中处于YB-1可控制的启动子如腺病毒E2晚期启动子的控制下。当E1B 蛋白和/或E4蛋白在表达盒中表达时，也是这种情况。在根据本发明的腺病毒、尤其I组腺病毒的优选实施方案中，预期当 腺病毒用于细胞时，所述细胞在核内不含有YB-1，特别是不以独立于细 胞的方式，并且所述细胞不含有任何去调节的YB-1，启动子每种并且独 立地是肿瘤特异性的启动子、器官特异性的启动子或组织特异性的启动 子。与此相关，当控制E1B蛋白、E4蛋白和/或E1A蛋白的表达的至少一
种启动子是这种特异启动子时就足够了。通过这种肿瘤、器官和组织特异 性，确保根据本发明的腺病毒的复制仅在各自肿瘤、器官或者组织的细胞 中发生，并且除此之外，没有其它组织受到腺病毒的复制的损害，如被裂 解。优选地，第二种并且更优选所有三种蛋白质都受到此类肿瘤特异性、 器官特异性或者组织特异性启动子的控制。使用这种腺病毒，可能还裂解 那些不形成肿瘤或者不能发育成这种肿瘤，但是由于其他原因，如医学原 因，将被破坏或者从生物体、优选从哺乳动物、更优选从人生物体除去的 那些细胞，例如因为它们产生不需要的因子或者以太高的水平产生这种因 子。§3组病毒该组病毒是基于令人惊奇的发现，即，根据本发明的病毒，即缺少如 野生型腺病毒中存在的功能型El区并且同时包含转运蛋白、具体地编码 可以转运或转移YB-1到细胞核中的转运蛋白，所述病毒能够在以独立于 细胞周期的方式在核中含有YB-1的细胞中复制或者在具有或包含去调节 的YB-1的细胞中复制。此外，本发明人发现根据本发明的病毒还可以独立于E1A13S复制， 尤其如果该复制通过YB-1介导。复制在此类条件下，尤其在前述细胞中 发生。如本文使用的，在细胞核中含有YB-1，优选在细胞核中独立于细 胞周期含有YB-1的细胞也是由于使用根据本发明的病毒，尤其由于用它 们感染细胞，在细胞核中含有YB-1的那些细胞。最后，本发明人还认识到蛋白IX是对于根据本发明的病毒的功效尤 其重要的因子，尤其当用作溶瘤病毒时，并且本文公开的构建体提供了该 因子的表达，其导致也以YB-1介导的独立于E1A13S的病毒复制的方式 进行高水平的颗粒形成。在这个范围内，该组的病毒还包含以依赖于YB-1的方式复制的病毒，其中所述病毒包含或编码蛋白ix。根据本发明的病毒包含用于将YB-1转运到细胞核的转运蛋白。在优 选实施方案中，转运蛋白是蛋白质，优选病毒蛋白质。通过转运蛋白转运 到细胞核中的YB-1优选为去调节的YB-1，尤其如本文定义。然而，本发 明还包括，YB-1是根据本发明的病毒编码、任选或额外编码成去调节的YB-1并且在该病毒感染的细胞中表达的YB-1。在这个范围内，所描述的 与§2组病毒相关的各个特征同样适用于§3组病毒。
细胞优选为含有去调节的YB-1的那些细胞，其中根据本发明的病毒 的转运蛋白将YB-1转运到细胞核中。
本领域技术人员可以评估这种病毒是否包含这种转运蛋白或者编码 该转运蛋白。与此相关，在一个实施方案中，以独立于细胞周期的方式在 核内包含YB-1的细胞，如子宫颈癌细胞系HeLa或者骨肉瘤细胞系U20S 可以被使用和随后确定，是否由于病毒的感染和随后复制，对应的受感染 的细胞在核中含有YB-1。在备选实施方案中，细胞用作与之相关含有去 调节的YB-1的细胞。可以使用本文描述的手段，尤其如本领域技术人员 可以制备的针对YB-1的抗体，可以在此类实验条件下在核中检测YB-1。 如果，在病毒的影响下，在细胞核中检测到YB-1，那么这些受试病毒包 含转运蛋白。
本发明包括，在前述实施方案的意义上，E1A区域关于E1区域编码 的一个或两个蛋白质组是"负型"的。所述两个蛋白质组是E1A蛋白质组， 尤其E1A13S蛋白，也在文中称作E1A13S，禾BE1A12S蛋白，在文中也 称作ElA12S，和E1B蛋白质组，尤其ElB55k蛋白，在文中也称作ElB55k， ElB19k蛋白，在文中也称作ElB19k，和蛋白IX。
在本发明的实施方案内，如果E1A13S处于与E1A启动子、优选腺病 毒E1A启动子、更优选野生型的腺病毒E1A启动子不同的启动子的控制 下，那么病毒是E1A13S负型的；如果E1A12S处于与E1A启动子、优选 腺病毒E1A启动子、更优选野生型的腺病毒E1A启动子不同的启动子的 控制下，那么病毒是E1A12S负型的。如果ElB55k处于与ElB启动子、 优选腺病毒E1A启动子、更优选野生型的腺病毒E1B启动子不同的启动 子的控制下，那么病毒是ElB55k负型的；如果ElB19k处于与ElB启动 子、优选腺病毒E1B启动子、更优选野生型的腺病毒E1B启动子不同的 启动子的控制下，那么病毒是ElB19k负型的；如果蛋白IX处于与EIB IX 启动子、优选腺病毒E1BIX启动子、更优选野生型的腺病毒E1BIX启动 子不同的启动子的控制下，或者如果它处于E1BIX启动子控制下，然而， 所述启动子由于缺少指导E1B IX启动子的活性的特定病毒因子而无活性，
那么病毒是蛋白IX负型的；从而后一种情况是调节背景被改变，更具体 地调节背景被间接改变或者在更高的整合或者调节水平上改变的实例。因 此，通常术语改变的调节背景还包括间接改变或者在更高的整合或者调节 水平活性上的改变，然而，在任一情况中，都不同于野生型、尤其野生型 腺病毒的特征。与蛋白质或蛋白质功能和编码它们的各自核酸是"负型的" 相关，然而认可的是这类蛋白，蛋白质功能和编码它们的核酸可被包含在 病毒的优选实施方案中，但是在不同于野生型病毒中各自环境的环境中。 这类蛋白质，蛋白质功能和各自的核酸处于在本文也称为异源的条件下。 在本发明的实施方案中，病毒是E1A13S负型。在另一实施方案中，病毒也是E1A12负型的。关于此，尤其优选当病毒E1A12S处于启动子控 制下时，该启动子的活性受到YB-1的控制，尤其受到YB-1的激活。这 些启动子在本文中称作依赖YB-1的启动子。尤其优选的依赖YB-1的启 动子是腺病毒E2晚期启动子。通过该构架，确保仅当YB-1存在于核中时， 在病毒复制过程中，E1A12S被活化。对于具有去调节的YB-1的细胞， 这通过根据本发明的病毒的转运蛋白实现，该转运蛋白将去调节的YB-1 转移到受感染的细胞的细胞核中。由于与野生型中的表达相比，病毒转运 蛋白和E1A12S的时间上相反的表达，E1A12S仅在含有去调节形式的 YB-1的此类细胞中表达，并且因此，将病毒的复制局限于这些细胞，将 裂解局限于特定的这些细胞，这代表该病毒设计在安全性中的显著优点。 在这些条件下，与依赖YB-1的复制有关的颗粒数目将增加。本发明 人认识到蛋白IX在依赖YB-1的复制中也起重要作用并且它的表达不受前 述转运蛋白表达中时间上的改变的影响，当利用本文公开的设计时，转运 蛋白优选由E1B区和E1A12S的蛋白质提供。现有技术中描述的用于依赖 YB-1的复制而设计的腺病毒尽管显示出出色的溶瘤活性，但是在一些应 用中，颗粒形成很低，例如，需要进一步应用溶瘤病毒。此类进一步应用 病毒在原则上是可能的，然而，在多数情况下是不希望的。通过本文描述 的构建体，特别是本文描述的与§3组病毒有关的构建体可以显著提高颗粒 形成。腺病毒蛋白IX粘合壳体结构并且对于病毒DNA包装成病毒体是重要 的(Boulanger等，Journal of Virology, 44, 783-800， 1979; Jones禾口 Shenk，Cell, 17, 683-689, 1979)。该基因位于病毒基因组中3581和4071位之间 (Colby禾卩ShenkT， Journal of Virology, 1981, 39, 977-980)，从而蛋白IX的 基因仅从复制的DNA分子表达(Matsui T等，Molecular and Cellular Biology, 1986， 6， 4149-4154)。在现有技术中描述并且进行依赖YB-l的复制的病毒Xvir03-3'UTR包 含启动子以及蛋白IX的序列，如同时与本发明进行的分析中所示，3'UTR 序列含有相同的序列。然而，该蛋白质在肿瘤细胞中仅仅弱表达并且导致 与野生型病毒相比较低的颗粒形成。病毒Xvk03-3'UTR表达病毒蛋白 ElB55k禾Q E4orf6，该表达通过导入Xvir03-3'UTR的异源CMV启动子(公 司Clonetech: PlasmidpShuttle)介导。除了CMV启动子外，还可以使用关 于E1A的表达在本文中描述的所有那些启动子。两种基因的可读框通过所 称作的IRES序歹ij (internal ribosomal entry site)相互连接(Pelletier，丄和 Sonenberg, N. Nature, 1988, 334, 320-325)。该元件(公司Novagen: pCITE) 允许两种蛋白质从一个mRNA表达。从一个RNA表达两种蛋白质的另一 选择是使用短肽(2A)，其来自口蹄病病毒(Pablo de Felipe, Genetic Vaccines and Therapy, 2004, 2， 13)。该元件可以原则上用作本文所述的多种实施方 案中调节性IRES序列的备选方案。从蛋白IX在依赖于YB-1的复制病毒、尤其腺病毒(本申请之前未知 的)中的表达的调节背景，本发明人认识到与依赖于YB-1的复制和在依 赖YB-l的方式复制的病毒的情况有关的蛋白IX的表达可以基本上通过下面的不同策略提供1. 通过优选分别控制蛋白E1A12S或者蛋白ElB19k表达的独立的 启动子。独立的启动子优选为与E1B IX启动子不同的启动子。优选地，该独 立的启动子选自组织特异性、肿瘤特异性、依赖于YB-l和病毒启动子。2. 通过E1A12S控制蛋白IX的表达。通过E1A12S蛋白的表达发生 受感染的细胞中S期的诱导，其导致蛋白IX被它的自然启动子活化。在本发明内，此类启动子原则上用于转运蛋白的表达，这些启动子不 同于控制野生型病毒中转运蛋白的表达的启动子。在优选实施方案中，这 意味着ElB55k被不同于E1B的启动子控制，E4orf6被不同于E4启动子
的启动子控制。在另一实施方案中，启动子是独立于E1A的启动子，艮卩，它的活性不受E1A影响。优选的启动子从而优选是组织特异性启动子、肿 瘤特异性启动子和病毒启动子，尤其本文描述的那些启动子。可以用于本发明的依赖YB-1的启动子，特别与其任何方面相关的启 动子包括但不限于，腺病毒E2晚期启动子、MDR启动子[Stein等，J.Biol. Chem， 2001, 276, 28562-28569;]以及DNA聚合酶a启动子[En-Nia等，J. Biol. Chem.， 2004， Epub ahead of print]。可用于本发明的合适的非腺病毒启动子可以选自包含巨细胞病毒启 动子、RSV (劳斯肉瘤病毒)启动子、基于腺病毒的启动子VaI和非病毒 的YB-I启动子(Makino Y.等，Nucleic Acids Res. 1996, 15, 1873-1S78)的 组。可以在本文公开的本发明任何方面使用的其它启动子是端粒酶启动 子、a甲胎蛋白(AFP)启动子、caecinoembryonic抗原启动子(CEA) (Cao， G., Kuriyama, S., Gao， J.， Mitoro, A., Cui， L.， Nakatani， T.， Zhang, X., Kikukawa, M., Pan, X.， Fukui, H.， Qi， Z. Int. J. Cancer, 78, 242-247， 1998)、 L-丝束蛋白 启动子(Chung, I.， Schwartz, PE.， Crystal, RC., Pizzomo， G, Leavitt, J., Deisseroth, AB. Cancer Gene Therapy, 6， 99-106, 1999)、精氨酸血管升压素 启动子(Coulson, JM, Staley, J., Woll， PJ. British J. Cancer, 80， 1935-1944, 1999)、 E2f启动子(Tsukada等Cancer Res., 62, 3428 - 3477)、 uroplakin II 启动子(Zhang等，Cancer Res., 62， 3743-3750， 2002)和PSA启动子 (Hallenbeck PL, Chang, YN, Hay, C， Golightly, D.， Stewart, D.， Lin, J" Phipps: S., Chiang, YL. Human Gene Therapy, 10， 1721-1733， 1999)。此外，如德国 专利申请DE 101 50 984.7公开的腺病毒的独立于YB-1的E2晚期启动子 是可以用于本发明的启动子。根据本发明的病毒与现有技术的依赖YB-1的病毒相比允许显著增加 的颗粒形成。优选地，颗粒形成增加2到50倍，更优选增加10到50倍。最后，在优选实施方案中，根据本发明使用的腺病毒是EIB缺陷的， 尤其ElB19k缺陷的。如本文中通常使用的，术语缺陷的指其中EIB不显 示出野生型内在特征的完整性并且缺少这些特征的至少一种的状况。腺病 毒BCL2同源物ElB19k通过与程序性细胞死亡前蛋白Bak和Bax相互作 用抑制E1A诱导的程序性细胞死亡。从而，在受感染的细胞中最大的复制
和/或颗粒形成是可能的(Ramya Sundararajan禾tl Eileen White, Journal of Virology 2001， 75, 7506-7516)。 ElB19k的缺乏导致病毒的更好的释放，因 为它最小化了腺病毒死亡蛋白的功能(如果存在)。通过此类缺失增强致 该病毒诱导的细胞病变效应(Ta-Chiang Liu等，Molecular Therapy, 2004)，并且从而导致受感染的肿瘤细胞的更强的裂解。此外，ElB19k的 缺乏导致TNF — a对肿瘤细胞中此类重组腺病毒的复制没有任何影响，而 在正常细胞中，该处理导致感染性病毒的复制和释放减弱。从而，选择性 和特异性增强(Ta-Chiang Liu等，Molecular Therapy 2004, 9， 786-803)。
下面的方面、特征和实施方案可应用于根据本发明使用的所有病毒并 且用于本发明、尤其腺病毒。
本文使用的术语转基因在实施方案中包括不包含在病毒中、尤其野生 型腺病毒、更优选腺病毒Ad5野生型中，或者包含在如本文定义的不同的 调节背景中的所有那些基因。在本发明的实施方案内，本文描述的一种或 几种转基因由一种或几种辅助病毒编码和/或表达。
本文描述的发现、方法、用途或者核酸、蛋白质、复制系统等等分别 不一定局限于腺病毒。原则上，此类系统也存在于本文包括和公开的其他 病毒中。
当使用根据本发明的病毒或者当根据本发明使用时，本文描述的腺病 毒复制的程度与一种野生型病毒复制的程度相当，与现有技术为10到 100pfu/细胞的感染数相比，该程度可以用1到10 pfU/细胞的感染数来实 现。
根据本发明的病毒与现有技术的依赖于YB-1的病毒相比提供了显著 增强的颗粒形成。优选地，颗粒形成增加了 2到50倍，更优选10到50倍。
本领域技术人员可以在其掌握的技术内分别缺失和突变与本发明无 关的腺病毒核酸序列。此类缺失可以例如与也在本文描述的E3和E4编码 核酸的部分相关。对于E4的缺失，尤其优选它不延伸到蛋白质E4orf6， 这意味着将用于本发明的腺病毒编码E4orf6。在优选实施方案中，这些腺 病毒核酸可以仍然包装成病毒壳体并从而形成感染性颗粒。对于使用根据 本发明的核酸，尤其是这样。通常，注意到腺病毒系统可以关于一种或几
种表达产生是缺陷的。关于此，考虑到一方面，这可以基于如下事实编 码表达产物的核酸完全被突变或者缺失或者一定程度上突变或者缺失使 得基本上不再形成表达产物或者调节和表达控制元件如启动子或者转录 因子缺乏或者以不同于野生型的方式有活性，其为核酸水平上(启动子缺 乏；顺式作用元件)或者在翻译或转录系统的水平上(反式作用元件)。 尤其最后一方面可以依赖于各自的细胞背景。在本发明的另一个方面，病毒，病毒系统，编码或包含它们的复制系 统，编码它们的核酸，包含它们的载体用于制备药物。优选该药物用于治 疗本文所述的疾病，特别是与本文所述的各种病毒的依照本发明的应用相 关的所描述的疾病。本文所述的腺病毒作为药物的应用，特别地与全身给药相关，可以通 过腺病毒的适当靶向来改善。通过腺病毒对肿瘤细胞的感染尤其在一定程度上依赖于coxackievirus-腺病毒受体CAR和独特的整联蛋白的存在。它 们如果在细胞、尤其肿瘤细胞中强烈表达，在非常低效价(pfb/细胞)发生感 染是可能的。为了实现所谓的重组腺病毒的重新靶向，迄今已经尝试了多 种策略，例如分别通过将异源序列插入到纤维结节区和蛋白IX的C-末端， 使用双特异性的抗体，用聚合物包被腺病毒，将配体导入Ad纤维，将血 清型5结节(knob)和血清型5纤维轴(shaft)和结节分别替代为血清型 3结节和Ad35纤维轴和结节，修饰五邻体基底(pentonbase) (Nicklin S.A.等，Molecular Therapy 2001, 4， 534-542; Magnusson, M. K.等，J. ofVirology 2001， 75, 7280-7289; Bamett B. G.等，Biochimica et Biophysica Acta 2002， 1575, 1陽14; Dimitrev IP et al., Journal of Virology, 2002, 76， 6893-6899; Mizuguchi und Hayakawa， Human Gene Therapy, 2004, 15,1034_1044)。实现这些另外设计和特征在本发明的范围，所述设计和特征与根据本发明的腺病毒和根据本发明使用的腺病毒在它们的按照本发明 的各种实施方案中有关。本文所述病毒的一些包含一种或多种转基因，如本文所述。这些转基 因对于作用方式，更精确地对于病毒的复制方式是重要的或有益的，或者 对于它们作为药物的应用是重要的或有益的，在所述药物中，在某些实施 方案中所述转基因是治疗性基因。
多种转基因，包括ElB55kD、 E4orf6、 ADP等等，尤其如果它们是病 毒基因，可以原则上从任一各自的病毒克隆，优选腺病毒，更优选腺病毒 Ad5。多种质粒还在现有技术中另外描述，它们含有各自的基因并且可以 从它们得到这些基因并导入根据本发明的腺病毒以及将用于本发明的病 毒中。表达ElB55kD的质粒的一个实例例如由Dobbelstein， M.等，EMBO Journal, 16,4276-4284, 1997描述。ElB55kD基因的编码区可以例如与该基 因的3'非编码区(3'UTR区优选位于腺病毒野生型基因组的约碱基位置 3507-4107)通过BamHI从质粒pDCRElB—起切割。包含ElB55kD基 因以及3'非编码区的各自的片段对应于腺病毒5型的核苷酸2019到4107。 然而，在本发明内，分别通过限制酶Bam HI和Bfrl和Xbal从质粒切 割ElB55kD基因，并随后克隆到腺病毒中。还在本发明内，其类似物以 及尤其3' UTR区的类似物可以用于本发明。3' UTR区的类似物是与3' UTR区具有相同作用的任一序列，尤其对于基因、优选ElB55kD基因的 表达具有相同作用。此类类似物可以由本领域技术人员通过常规实验确 定，例如，通过将3' UTR区延长或者縮短一个或几个核苷酸并随后测试 所得到的类似物是否仍然具有与以前描述的3' UTR区相同的作用。在一 个实施方案中，术语3' UTR区还包含其每种和任一种类似物。在一个优选的实施方案中，病毒中的治疗基因或者转基因优选被克隆 处于特异性启动子、尤其肿瘤特异性或者组织特异性启动子的控制下，这 些病毒是根据本发明的病毒的进一步发展。在此类病毒中，E4区也功能 性失活并且优选被缺失。还可以将本文描述的转基因克隆到E4区中，其 中这可以是转基因向E3区的克隆的备选或者附加的，并且E3区可以分别 保持部分或者完全完整。本文中使用的转基因可以是治疗基因或者病毒基 因，优选腺病毒基因，其优选分别不存在于野生型腺病毒的基因组中和不 存在于基因组的位点上，所述位点为它们目前位于具体病毒的位点。该治疗基因可以是前药基因、细胞因子的基因、诱导程序性细胞死亡 的基因、肿瘤抑制基因、金属蛋白酶抑制剂和/或血管生成抑制剂和酪氨酸 激酶抑制剂的基因。另外，可以表达siRNA、适配体、反义分子和核酶， 其优选地针对与癌症相关的靶分子。优选地，单个或多个靶分子选自包含 抗性相关因子、抗程序性细胞死亡因子、癌基因、血管生成因子、DNA 合成酶、DNA修复酶、生长因子和它们的受体、转录因子、金属蛋白酶， 特别是基质金属蛋白酶和尿激酶类型的纤溶酶原激活剂的组。其优选的实 施方案已经在本文中公开。在一个实施方案中，抗性相关的因子优选选自包含P-糖蛋白、MRP 和GST的组并且还包含其编码核酸。可以用于优选的实施方案中的可能的前药基因是,例如，胞嘧啶脱氨 酶，胸苷激酶，羧肽酶，尿嘧啶磷酸核糖基转移酶；或嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP); [Kirn等，Trends in Molecular Medicine,巻8, No.4 (增刊)，2002; Wybranietz W.A.等，Gene Therapy, 8， 1654-1664， 2001; Niculescu-Duvaz等， Curr. Opin, Mol. Therapy, 1, 480.486, 1999; Koyama等，Cancer Gene Therapy, 7, 1015-1022, 2000; Rogers等，Human Gene Therapy, 7, 2235-2245， 1996; Lockett等，Clinical Cancer Res., 3， 2075-2080， 1997; Vijayakrishna等，J. Pharmacol.禾口 Exp. Therapeutics, 304, 1280-1284, 2003]。可以用于优选的实施方案中的可能的细胞因子是，例如，GM-CSF， TNF-a, 11-12， 11-2， 11-6， CSF，干扰素-y; Gene Therapy, Advances in Pharmacology,巻40,编车葺J. Thomas August, Academic Press; Zhang禾口 Deg訓t, Endocrinology, 144, 1393-1398, 2003; Descamps等，J. Mol. Med.， 74, 183-189, 1996; Majumdar等，Cancer Gene Therapy, 7， 1086-1099， 2000。在一个实施方案中，抗程序性细胞死亡因子选自包含BCL2的组并且 还包含其编码核酸。在一个实施方案中，癌基因选自包含Ras，尤其突变 的Ras、 Rb和Myc的组并且还包含其编码核酸。在一个实施方案中，血 管生成因子选自包含VEGF和HMG蛋白的组，并且还包含其编码核酸。 在一个实施方案中，DNA合成酶选自包含端粒酶的组，并且还包含其编 码核酸。在一个实施方案中，DNA修复酶选自包含Ku-80的组，并且还 包含其编码核酸。在一个实施方案中，生长因子选自包含PDGF、 EGF和 M-CSF的组，并且还包含其编码核酸。在一个实施方案中，受体尤其是生 长因子的那些受体，其中优选生长因子选自包含PDGF、 EGF和M-CSF 的组，并且还包含其编码核酸。在一个实施方案中，转录因子选自包含 YB-1的组，并且还包含其编码核酸。在一个实施方案中，金属蛋白酶尤 其是基质金属蛋白酶。在优选实施方案中，基质金属蛋白酶选自包含
MMP-l和MMP-2的组，并且还包含其编码核酸。在一个实施方案中，尿 激酶型纤溶酶原激活物选自包含uPa-R的组，并且还包含其编码核酸。可以用于优选的实施方案中的可能的程序性细胞死亡诱导基因是,例 如，核心蛋白聚糖[Tralhao等，FASEB J, 17, 464-466， 2003];成视网膜细胞 瘤94: [Zhang等，Cancer Res.，63， 760-765, 2003]; Bax禾Q Bad[Zhang等，Hum. Gene Ther" 20, 2051-2064， 2002〗;细胞程序性细胞死亡素(apoptin) [Noteborn禾卩Pietersen， Adv. Exp. Med. Biol" 465， 153-161, 2000]]; ADP[Toth等，Cancer Gene Therapy, 10， 193-200， 2003]; bcl-xs[Sumantmn等， Cancer Res, 55, 2507-2512， 1995]; E4orf4[Bmithwaite和Russell, Apoptosis, 6， 359-370， 2001]; FasL， Apo-l禾卩Trail[ Boehringer Manheim, Guide to Apoptotic Pathways, Arai 等，PNAC， 94, 13862-13867， 1997]; Bims[Yamaguchi等，Gene Therapy, 10, 375-385， 2003; GNR163: Oncology News, 17 June, 2000]。可以用于优选的实施方案中的可能的肿瘤抑制基因是，例如，EM^U 卢p27,尸27,或MDZ-7。 [Opalka等，Cell Tissues Organs, 172, 126-132, 2002, Ji等，Cancer Res" 59, 3333-3339, 1999, Su等，Oncogene, 22， 1164-1180,2003]。可以用于优选的实施方案中的可能的血管生成抑制剂是，例如， A座妙,(endostatin)或逾,生长湖素(angiostatin) [Hajitou等，FASEB J" 16, 1802-1804, 2002],和针对VEGF的抗体(Ferrara， N., Semin Oncol 2002 Dec; 29 (6 Suppl 16): 10-4)。可以用于优选的实施方案中的可能的金属蛋白酶抑制剂是，例如， r—-3 [Ahonen等，Mol Therapy, 5， 705-715， 2002];[Soff等，J. Clin. Invest" 96, 2593-2600, 1995]; T一-7， [Brandt K. Curr. Gene Therapy, 2, 255-271,2002]。可以通过按照本发明的i组腺病毒和n组腺病毒表达的本发明意义上的其它转基因也是酪氨酸激酶抑制剂。示例性的酪氨酸激酶是EGFR (表 皮生长因子受体)[Onkologie, Entstehung und Progression maligner Tumoren; author: Christoph Wagner， Georg Thieme Verlag， Stuttgart, 1999〗。优选的酪氨 酸激酶抑制剂是曲妥单抗(herceptin) [Zhang H等，Cancer Biol Ther. 2003， Jul-Aug; 2 (4 suppl 1): S122-6]。如可以用于本发明的SiRNA (短干扰RNA)由2条、优选2条分开 的RNA链组成，其由于碱基互补性而彼此杂交，该互补性是指它们基本 上碱基配对地存在，且优选地具有高达50个核苷酸、优选18-30个核苷酸、 更优选少于25个核苷酸和最优选21、 22或23个核苷酸的长度，其中这 些数字是指siRNA的单链，特别是一段单链序列的长度，该单链与一条、 更具体地与第二条单链杂交或与其碱基配对。SiRNA特异性地诱导或介导 mRNA的降解。其所需的特异性由siRNA的序列和由此它的结合位点介 导。待降解的靶序列基本上与siRNA形成链的第一或第二条链互补。尽管 作用的确切方式还不清楚，推测siRNA代表细胞在发育期间抑制分开的等 位基因(distinct allele)和保护其自身对抗病毒的生物学策略。siRNA介 导的RNA干扰可以用作通过引入基因特异性的双链RNA来特异性地抑制 或完全剔除蛋白的表达的方法。对于高等生物，包含19-23个核苷酸的 siRNA照此是特别合适的，因为它不会激活非特异性的防御反应，例如白 介素应答。直接转染21个核苷酸的具有对称的2个核苷酸长的3'突出端 的双链RNA适用于介导哺乳动物细胞中的RNA干扰，并且与其它技术如 核酶和反义分子相比是高效的(ElbasWr, S. Harborth J. Lendeckel W. Yalvcin, A. Weber K Tuschl T: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 2001, 411: 494-498)。仅需要 极少siRNA分子即可足以抑制耙基因的表达。为了避免外源施用的siRNA 的限制，该限制特别在于干扰现象和siRNA分子特异性传递的瞬时性质， 现有技术使用允许内源性siRNA表达的载体。为此目的，例如，将具有 64个核苷酸长度的寡核苷酸以有义和反义方向引入包含19个核苷酸长的 靶序列的载体，其被例如9个核苷酸长的间隔序列分开。产生的转录物折 叠成发卡结构，其茎结构具有例如19个碱基对。环在细胞中快速降解， 以便产生功能性的siRNA(Brummelkamp等，Science, 296， 550-553， 2002)。在另一个实施方案中，药物还包含至少一种药学活性化合物或药学活 性剂，其中如果未相反指出，术语化合物和药剂可互换使用。在优选实施方案中，药学活性化合物选自包含下述各项的组细胞因 子、金属蛋白酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞抑制剂，如针对结肠直肠
癌的伊立替康和CPT-ll和针对白血病的柔红霉素、细胞周期抑制剂，如CYC202，其抑制CDK2/CyclinE激酶活性并且可以用于抗结肠直肠肿瘤 (McClue SJ, Int. J. Cancer 2002, 102， 463-468)和BAY 43-9006，其抑制 Raf-l并且例如有效抗乳腺癌(Wilhelm SM等，Cancer Res. 2004， 64， 7099-7109)，蛋白酶体抑制剂，如PS-341，其抑制26S蛋白酶体活性并且 用于抗鳞状细胞癌(Fribley A等，Mol Cell Biol 2004 Nov; 24(22): 9695-704)，如抗EGF受体的重组抗体(Herceptin用于乳腺癌和前列腺肿瘤； H.G van der Poel， European Urology 2004， 1-17; Erbitux抗头颈肿瘤; Bauman M等，Radiother. Oncol., 2004, 72， 257-266)和信号转导级联的抑制 剂，如STI 571，其抑制c-kit并且可以用于抗胃肠肿瘤(H.G van der Poel, EuropeanUrology 2004,45, 1-17), ABT-627: —种内皮縮血管肽抑制剂，其 可以用于抗前列腺肿瘤(H.G. van der Poel， European Urology 2004, 45, 1-17), SU5416,其可以抑制VEGF酪氨酸激酶受体的磷酸化并且可以用于抗成 胶质细胞瘤和前列腺癌(Bischof M等Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2004; 60 (4): 1220-32)， ZD1839，其抑制EGFR赖氨酸活性并且可以用于抗前列 腺肿瘤(H.G. van der Poel， European Urology 2004, 45， l-17);雷帕霉素衍生 物，如CCI-779和RAD001，其抑制mTOR并且可以用于抗前列腺肿瘤。 本发明包括，本文描述的多种腺病毒和本发明中使用的腺病毒分别可以在 原则上与上述化合物的每一种用于任一种和与之相关描述的每一种和任 一种适应症。在尤其优选的实施方案中，适应症是关于前述药学活性化合 物的任一种描述的适应症。发明人还令人惊奇地发现本文描述的病毒和尤其根据本发明使用的 病毒的功效可以通过使用至少两种化合物的组合增强，其中至少两种化合 物的每一种单独和独立地选自包含细胞生长抑制剂的组。如优选实施方案中使用的，细胞生长抑制剂具体为化学或者生物化合 物，其在施用于细胞或者含有这种细胞的生物体期间或者之后，导致细胞 不再生长和/或不再分裂或者减慢细胞分裂和/或细胞生长。细胞生长抑制 剂还包括仅在细胞内或者含有这种细胞的生物体内转化成前述意义上的 细胞生长抑制剂的化合物。因此，术语细胞生长抑制剂还包括前细胞生长 抑制剂。
细胞生长抑制剂根据它们的作用方式分组。区分出下面的组，它们在 原则上可以用于本发明-垸化剂，即通过垸化核酸以及蛋白质的磷酸根、氨基、sulphydryl、羧基和羟基而产生它们的细胞毒性作用。此类化合物通常自身是致癌的。 该组细胞生长抑制剂的典型的实例是顺铂和铂衍生物、环磷酰胺、达卡巴 嗪、丝裂霉素、丙卡巴肼。
-抗代谢物，即由于它们的结构相似性或者结合能力而阻断代谢过程 或者影响代谢过程的化合物。在抗代谢物组内，区分了结构上相似的抗代 谢物、改变结构的抗代谢物和间接作用的抗代谢物。结构上相似的抗代谢 物由于化学相似性而与代谢物竞争，从而不发挥代谢物的功能。改变结构 的抗代谢物结合代谢物，其阻碍了代谢物的功能或者再吸收或者化学上修 饰该代谢物。间接作用的抗代谢物例如通过结合离子而干扰代谢物的功 能。该组的典型实例是叶酸拮抗剂，如氨甲喋呤、嘧啶类似物，如氟尿嘧 啶、嘌呤类似物，如硫唑嘌呤和巯嘌呤。
-有丝分裂抑制剂，即抑制细胞分裂的化合物。在有丝分裂抑制剂的组内，分成细胞分裂毒素、纺锤体毒素和染色体毒素。该组的典型实例是紫杉垸类和长春花生物碱类。紫杉烷类又可以分成两个主要组紫杉酚类 和紫杉萜类，其中尤其优选的紫杉酚是紫杉醇，尤其优选的紫杉萜是多西 他赛。
-对依赖DNA的RNA聚合酶具有抑制作用的抗生素。典型的实例是 蒽环类，如博来霉素、柔红霉素、多柔比星和丝裂霉素。
-拓扑异构酶抑制剂，尤其拓扑异构酶I抑制剂。拓扑异构酶抑制剂 是通过以三个阶段过程催化改变DNA扭曲数决定DNA的三维结构的化合物。基本上区分了两种形式的拓扑异构酶。I型拓扑异构酶仅切割DNA链 并且是独立于ATP的，而II型拓扑异构酶切割DNA的两条链，其中它们 是依赖ATP的。拓扑异构酶I抑制剂的典型的实例是伊立替康和托泊替康， 拓扑异构酶II抑制剂的抑制剂是依托泊苷和柔红霉素。
在本发明内，至少一种并且优选两种试剂选自前述组。然而，还在本 发明内，尤其选择3、 4或者5种不同的试剂。为本发明的实施方案进行 下面的注解，其中仅仅一种和优选两种试剂与病毒一起使用。这些考虑基
本上还应用于使用两种以上试剂的实施方案中。试剂优选相互不同，使得它们处理不同的耙分子或者在文献中描述为 靶定不同的分子。在本发明内，试剂还包括两种或多种不同的试剂，它们 结合相同的靶分子。还在本发明内， 一种这样的试剂结合靶分子的第一个 位点，而第二种这样的试剂结合靶分子的第二个位点。还在本发明内，至少两种试剂的活性使用不同的作用方式。在优选实 施方案中有活性指化合物的细胞生长和/或细胞分裂抑制或者延缓作用通 过不同的作用方式介导。在尤其优选的实施方案中，术语有活性指病毒、 尤其根据本发明的病毒、本文描述的病毒和将根据本发明使用的病毒的复 制效率与其中不使用一种和/或两种试剂的情况相比增加。作为病毒复制效率的测量，优选使用细胞裂解所需的病毒数，优选表示为pfb/细胞。在尤其优选的实施方案中，至少两种试剂的至少一种是增加细胞的感 染力的试剂，所述细胞中，将发生病毒的复制，优选以选择性方式发生， 优选使用本文描述的病毒和/或将根据本发明使用的病毒。这可以例如通过 增加细胞对病毒的摄入来进行。病毒、尤其腺病毒的摄入例如通过柯萨奇病毒一腺病毒受体(CAR)介导(Mizuguchi禾n Hayakawa, GENE 285， 69-77， 2002)。 CAR病毒的增加的表达例如通过曲古抑菌素A引起(Vigushin等， Clinical Cancer Research, 7， 971-976， 2001)。在另一实施方案中，至少两种试剂的一种是增加细胞内组分的可用性 的试剂，其中该组分是增加病毒、优选本文描述的病毒和/或将根据本发明 使用的病毒的复制的组分。在另一实施方案中，至少两种试剂的一种是介导YB-1向细胞核转移 的试剂。这种试剂可以选自包含拓扑异构酶抑制剂、烷化剂、抗代谢物和 有丝分裂抑制剂的组。优选的拓扑异构酶抑制剂是喜树碱、伊立替康、依 托泊苷和它们各自的类似物。优选的有丝分裂抑制剂是柔红霉素、多柔比 星、紫杉醇和多西他赛。优选的烷化剂是顺铂和它们的类似物。优选的抗 代谢物是氟尿嘧啶和密都锭。在尤其优选的实施方案中，至少两种试剂的一种是增加细胞的感染 力，尤其CAR的表达的试剂，至少两种试剂的第二种是增加YB-1向细胞 核转运的试剂，其中优选作为化学化合物，使用显示出优选如上述的各自 的所需特征的化合物。在另一实施方案中，至少两种试剂的一种是组蛋白脱酰基酶抑制剂。优选的组蛋白脱酰基酶抑制剂选自包含曲古抑菌素A、 FR901228、 MS-27-275、NVP-LAQ824和PXDIOI的组。曲古抑菌素A例如在Vigushin等，Clinical Cancer Research, 7, 971-976, 2001中描述；F謂1228例如在 Kitazono等，Cancer Res., 61， 6328-6330， 2001中描述；MS-27-275在Jaboin 等，Cancer Res" 62， 6108-6115， 2002中描述；PXD101在Plumb等，Mol. Cancer Ther., 8， 721-728, 2003中描述；NVP-LAQ824在Atadja等，Cancer Res" 64, 689-695, 2004中描述。在一个实施方案中，至少一种试剂选自包含下列各项的组曲古抑菌素A(抗成胶质细胞瘤，Kim JH等，Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 2004, 59, 1174-1180)， FR 901228 (抗胰腺肿瘤，Sato N等，Int. J. Oncol. 2004， 24, 679-685; MS-27-275 (抗前列腺肿瘤；Camphausen K等，Clinical Canver Research 2004， 10, 6066-6071), NVP-LAQ824 (抗白血病；Nimmanapalli R 等，Cancer Res, 2003, 63， 5126-5135; PXD101 (抗卵巢肿瘤，Plumb JA等， Mol. Cancer Ther. 2003， 2， 721-728), scriptaid (抗乳腺癌，Keen JC等，Breast Cancer Res. Treat. 2003， 81， 177-186)， apicidin (抗黑素瘤，Kim SH等， Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004， 315, 964-970)和CI-994 (抗多种肿 瘤，N画naitisJJ等，Cancer J. 2003， 9， 58-66)。其中，组蛋白脱乙酰酶抑制 剂的作用方式在LindemannRK等，Cell Cycle 2004, 3， 77-86中描述。在本 发明内，本文描述的多种腺病毒和将根据本发明使用的腺病毒可以与前述 化合物一起使用，原则上，用于与其相关的每一种和任一种本文描述的适 应症。在尤其优选的实施方案中，适应症是已经关于每一种和任一种前述 药学活性化合物描述的适应症。在另一实施方案中，至少两种试剂的一种是拓扑异构酶抑制剂，优选 拓扑异构酶I抑制剂。优选的拓扑异构酶抑制剂选自包含下列各项的组 喜树碱、伊立替康、托泊替康、SN-38、 9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱， DX-895If和柔红霉素。伊立替康和SN-38例如在Gilbert等，Clinical Cancer Res., 9, 2940-2949, 2003中描述；DX-895IF在van Hattum等，British Journal of Cancer, 87, 665-672， 2002中描述；喜树碱在Avemann等，Mol.
Cell. Biol.， 8, 3026-3034， 1988中描述；9-氨基喜树碱、9一硝基喜树碱在 Rajendra等，Cancer Res., 63, 3228-3233, 2003中描述；柔红霉素在M. Binaschi等，Mol, Pharmacol" 51， 1053-1059中描述。在优选实施方案中，拓扑异构酶抑制剂选自包含下列各项的组喜树碱、伊立替康、托泊替康、DX-895If、 SN-38、 9-氨基喜树碱、9-硝基喜树 碱、依托泊苷和柔红霉素。这些可以用于抗多种肿瘤，例如，结肠直肠 肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢癌和前列腺癌。其中应用领域由RecchiaF等，British J. Cancer 2004， 91, 1442-1446; Cantore M等，Oncology 2004, 67， 93-97; Maurel J.等，Gynecol. Oncol 2004, 95， 114-119; Amin A.等，Urol. Oncol. 2004， 22, 398-403; Kindler HL等，Invest. New Drugs 2004， 22, 323-327, Ahmad T.等，Expert Opin. Pharmacother. 2004, 5， 2333-2340; Azzariti A.等， Biochem Pharmacol. 2004， 68， 135-144; Le QT等，Clinical Cancer Res. 2004, 10， 5418-5424描述。在本发明内，本文描述的多种腺病毒和将根据本发明 使用的腺病毒分别在原则上可以与前述化合物用于与其相关的本文描述 的每种和任一种适应症。在尤其优选的实施方案中，适应症为关于前述药学活性化合物的每一种描述。在一个实施方案中，至少一种试剂选自包含下列各项的组曲古抑菌 素A， FR 901228 (抗胰腺肿瘤，Sato N等，Int. J. Oncol. 2004， 24, 679-685; MS-27-275 (抗前列腺肿瘤；Camphausen K等，Clinical Canver Research 2004, 10, 6066-6071)， NVP-LAQ824 (抗白血病；Nimmanapalli R等，Cancer Res. 2003， 63， 5126-5135; PXD101 (抗卵巢肿瘤，Plumb JA等，Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 721-728) scriptaid (抗乳腺癌，Keen JC等，Breast Cancer Res. Treat. 2003, 81, 177-186), apicidin (抗黑素瘤，Kim SH等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004， 315， 964-970)禾Q CI-994 (抗多种肿瘤，Nemunaitis JJ 等，Cancer J. 2003, 9, 58-66)。其中，组蛋白脱乙酰酶抑制剂的作用方式在 LindemannRK等，Cell Cycle 2004, 3， 77-86中描述。在本发明内，本文描 述的多种腺病毒和将根据本发明使用的腺病毒可以与前述化合物一起使 用，原则上，用于与其相关的每一种和任一种本文描述的适应症。在尤其 优选的实施方案中，适应症是已经关于每一种和任一种前述药学活性化合 物描述的适应症。 在优选实施方案中，拓扑异构酶抑制剂选自包含下列各项的组喜树碱、伊立替康、托泊替康、DX-895If、 SN-38、 9-氨基喜树碱、9-硝基喜树 碱、柔红霉素和依托泊苷。这些可以用于抗多种肿瘤，例如，结肠直肠肿 瘤、胰腺肿瘤、卵巢癌、肺肿瘤和前列腺癌。其中，应用领域由RecchiaF 等，British J. Cancer 2004, 91, 1442-1446; Cantore M等，Oncology 2004， 67, 93-97; Maurel J.等,Gynecol. Oncol 2004, 95， 114-119; Amin A.等，Urol. Oncol. 2004, 22， 398-403; Kindler HL等，Invest. New Drugs 2004， 22, 323-327， Ahmad T.等，Expert Opin. Pha腿cother. 2004, 5, 2333-2340; Azzariti A.等，Biochem Pharmacol. 2004， 68， 135-144; Le QT等，Clinical Cancer Res. 2004, 10, 5418-5424描述。在本发明内，本文描述的多种腺病 毒和将根据本发明使用的腺病毒分别在原则上可以与前述化合物用于与 其相关的本文描述的每种和任一种适应症。在尤其优选的实施方案中，适 应症为关于前述药学活性化合物的每一种描述。在尤其优选的实施方案中，所述至少两种试剂的一种是组蛋白脱酰基 酶抑制剂并且至少两种试剂的另一种是拓扑异构酶抑制剂。在本发明的每一和任一方面的优选实施方案中，其他药学活性化合物 选自包含下列各项的组细胞因子、金属蛋白酶抑制剂、血管生成抑制剂、 细胞抑制剂，如针对结肠直肠癌的伊立替康和CPT-11和针对白血病的柔 红霉素、细胞周期抑制剂，如CYC202，其抑制CDK2/CydinE激酶活性 并且可以用于抗结肠直肠肿瘤(McClue SJ, Int. J. Cancer 2002, 102, 463-468) 和BAY 43-9006，其抑制Raf-1并且有效抗乳腺癌(Wilhelm SM等，Cancer Res. 2004， 64, 7099-7109)，蛋白酶体抑制剂，如PS-341，其抑制26S蛋白 酶体活性并且用于抗脑肿瘤(YinD.等，Oncogene 2004)，如抗EGF受体的 重组抗体(Herceptin用于乳腺癌和前列腺肿瘤；H.G. van der Poel, European Urology 2004, 1-17; Erbitux抗头颈肿瘤；Bauman M等，Radiother. Oncol" 2004, 72, 257-266)和信号转导级联的抑制剂，如STI571，其抑制c-kit并 且可以用于抗胃肠肿瘤(H.G. van der Poel, European Urology 2004， 45， 1-17)， ABT-627: —种内皮縮血管肽抑制剂，其可以用于抗前列腺肿瘤(H.G. van der Poel, European Urology 2004， 45, 1-17)， SU5416,其可以抑制VEGF酪 氨酸激酶受体的磷酸化并且可以用于抗头/颈肿瘤(Cooney等，Cancer Chemother. Pharmacol 2004)， ZD1839,其抑制EGFR赖氨酸活性并且可以 用于抗前列腺肿瘤(H.G. van der Poel， European Urology 2004， 45, 1-17);雷 帕霉素衍生物，如CCI-779和RAD001，其抑制mTOR并且可以用于抗前 列腺肿瘤(H.G. van der Poel, European Urology 2004， 45, 1-17)。本发明包括， 本文描述的多种腺病毒和本发明中使用的腺病毒分别可以在原则上与上 述化合物的每一种用于任一种和与之相关描述的每一种和任一种适应症。 在尤其优选的实施方案中，适应症是关于前述药学活性化合物的任一种描 述的适应症。在一个实施方案中，根据本发明的手段和/或将根据本发明制备的手段 含有病毒，该病毒与和根据本发明的病毒组合或给予的至少一种、优选至 少两种试剂组合的一种或几种分离。优选该病毒与和该病毒组合的任一种 试剂分离。优选地，该分离是空间分离。空间分离可以是使得病毒存在于 与该试剂不同的包装中。优选地，该包装是单剂量单位，即，病毒和试剂 包装为单一剂量。单一剂量单位又可以组合形成包装。然而，还在本发明 内，病毒的单一剂量与一种或几种试剂的一种或几种单一剂量组合或者与 其包装在一起。包装的类型取决于如本领域技术人员已知的施用方法。优选地，病毒 将以冻干形式或者以合适的液体相存在。优选地，试剂将以固体形式存在， 例如，作为片剂或者胶囊剂，然而，不限于此。备选地，试剂还以液体形式存在。在本发明内，全身或者局部施用病毒。还在本发明内，与病毒组合的 试剂全身或局部单独或者相互独立地或者一起施用。其他施用方式是本领 域技术人员已知的。在本发明内，病毒和与其组合的试剂以时间上分离的方式或者同时施 用。关于时间上分离的方式，优选在施用病毒前施用试剂。在病毒前多久 施用试剂取决于使用的试剂的类型并且本领域技术人员根据使用的试剂 的作用方式是显而易见的。而且，至少两种试剂的施用可以在相同或者不 同的时间点发生。关于时间上不同的施用，时间点再次来自试剂根本的作 用方式并且可以基于它由本领域技术人员确定。考虑到在本文中也称作药物组合物的根据本发明的药物，上面的考虑
基本上也可以应用于任一组合物，包括用于病毒复制，优选根据本发明的 病毒的体外复制的组合物。上面的考虑也可以分别应用于根据本发明的试 剂盒和将根据本发明使用的试剂盒，其可以除了本文中描述的病毒和将根 据本发明使用的病毒外，还包括如本文描述的试剂或者试剂的组合。此类 试剂盒包含病毒和/或可以使用形式的一种或几种试剂和优选地使用说明 书。此外，上述考虑还可以应用于如本文公开的核酸、和根据本发明使用 的核酸，和根据本发明的复制系统和其编码核酸，和根据本发明使用的复 制系统和其根据本发明使用的其编码核酸。与根据本发明使用的本文公开的腺病毒有关的或者用于其生产的药 物通常意在以全身的方式应用，尽管本发明还包括局部应用或者递送。该 应用意在用腺病毒感染尤其那些的细胞，并且预期腺病毒复制尤其在其中 发生，其涉及，优选以原因的方式涉及状况、典型地疾病的形成，本发明 的药物用于诊断和/或预防和/或治疗所述状况。这种药物优选用于治疗肿瘤疾病。这些肿瘤疾病尤其优选为这样的疾 病，其中由于该肿瘤疾病的潜在机理，尤其由于潜在的病理机理，YB-1 已经位于细胞核中，或者由于外源措施导致YB-1存在于细胞核中，其中此类外源措施适于将YB-1转移到细胞核或者在细胞核中诱导或表达 YB-1。术语肿瘤或者肿瘤疾病将在本文中包括恶性以及良性肿瘤，和各自 的疾病。在一个实施方案中，药物包含至少一种其他药学活性化合物。此 类其他药学活性化合物或药剂的性质和量将取决于该药物用于的适应症 的类型。对于药物用于治疗和/或预防肿瘤疾病的情况，通常使用细胞生长 抑制剂，如顺铂和紫杉酚、daunoblastin、柔红霉素、多柔比星和/或米托 蒽醌或者本文描述的其他细胞生长抑制剂或细胞生长抑制剂组。根据本发明的药物可以以多种剂型存在，优选以液体形式存在。此外， 药物将含有辅药，如稳定剂、缓冲剂、防腐剂等等，其是制剂领域技术人 员已知的。与根据本发明使用的本文描述的腺病毒有关或者与其生产有关的药 物通常意在以全身的方式应用，尽管本发明还包括局部应用或者递送。该 应用意在用腺病毒感染尤其那些的细胞，并且导致腺病毒复制在其中发 生，其涉及，优选以原因的方式涉及状况、典型地疾病的形成，本发明的 药物用于诊断和/或预防和/或治疗所述状况。这种药物优选用于治疗肿瘤疾病。这些肿瘤疾病尤其优选为这样的疾 病，其中由于该肿瘤疾病的潜在机理，尤其由于潜在的病理机理，YB-1 已经位于细胞核中，或者由于外源措施导致YB-1存在于细胞核中，其中此类外源措施适于将YB-1转移到细胞核或者在细胞核中诱导或表达 YB-1。术语肿瘤或者肿瘤疾病将在本文中包括恶性以及良性肿瘤，和各自 的疾病。在一个实施方案中，药物包含至少一种其他药学活性化合物。此 类其他药学活性化合物的性质和量将取决于该药物用于的适应症的类型。 对于药物用于治疗和/或预防肿瘤疾病的情况，通常使用细胞生长抑制剂， 如顺铂和紫杉酚、daunoblastin、柔红霉素、多柔比星和/或米托蒽醌或者 本文描述的其他细胞生长抑制剂或细胞生长抑制剂组。根据本发明的药物可以以多种剂型存在，优选以液体形式存在。此外， 药物将含有辅药，如稳定剂、缓冲剂、防腐剂等等，其是制剂领域技术人 员己知的。发明人已经令人惊奇地发现根据本发明的病毒可以以非常高的成功 率用于其中在独立于细胞周期的核中含有YB-1的那些肿瘤和含有去调节 的YB-1的肿瘤。通常，YB-1存在于细胞质中，尤其还存在于核周胞质中。 YB-1在细胞周期的S期存在于正常的以及肿瘤细胞的核中。然而，当使 用此类修饰的腺病毒时，不足以提供病毒溶瘤作用。如现有技术中报导的 此类减毒腺病毒的相对低的效率最终基于其错误的应用。换句话说，此类 腺病毒系统可以在这样的条件下使用，尤其也以增加的功效使用，在所述 条件下，使用本文描述的减毒的或者修饰的腺病毒，对病毒溶瘤作用的分 子生物学前提得到满足。此类前提在肿瘤疾病中给出，其细胞独立于细胞 周期在核中含有YB-1或者含有去调节的YB-1。该形式的核定位可以通过 肿瘤自身的性质引起，或者可以通过如本文描述的根据本发明的试剂引起 或者通过应用本文描述的措施引起。本发明从而分别定义了一组新的肿瘤 和肿瘤疾病，从而以及一组患者，它们可以用根据本发明的病毒尤其也可 以用现有技术中已经描述的减毒的或者经修饰的腺病毒治疗。可以用根据本发明的病毒治疗的另一组患者是当应用或者实现某些 条件(包括使用根据本发明的病毒)时，确保YB-1迁移到细胞核中或者
在细胞核中诱导或者转移到细胞核中的那些患者。与该组患者有关的根据 本发明的腺病毒的使用基于如下发现，即病毒应用的诱导基于YB-1的核定位与随后YB-1与E2-晚期启动子的结合。这还应用于YB-1核阳性的细 胞和/或YB-l以本发明意义中去调节的方式存在的那些细胞。根据本发明 的腺病毒可以用于本发明中治疗疾病和患者组，其包括具有这些特征的细 胞，尤其如果这些细胞参与将治疗的各自疾病的形成。使用根据本发明的 病毒、尤其腺病毒可以治疗的另一组患者是由于随后描述的治疗而是YB-1 核阳性的那些患者和/或经历本文描述的措施之一、优选治疗措施，或者已 经经历根据本发明的病毒施用或者经历它们以及根据本发明fe病毒施用 的那些患者。本发明包括，YB-1核阳性患者是独立于细胞周期在核中具 有YB-1，尤其在许多肿瘤形成细胞中具有YB-1的患者。这些措施包括施 用本文中一般描述和/或用于肿瘤治疗中的此类细胞生长抑制剂。此外，该 组措施包括放射，尤其用于肿瘤治疗中的放射。放射具体指用富含能量的 放射、优选放射性放射进行的放射，优选如用于肿瘤治疗中的放射。另一 措施是过热和过热的应用，优选用于肿瘤治疗中的过热。在尤其优选的实 施方案中，局部应用过热。最后，另一措施是激素治疗，尤其用于肿瘤治 疗中的激素治疗。抗雌激素类和/或抗雄激素类可用于此类激素治疗。与此 相关，抗雌激素类如他莫昔芬尤其用于治疗乳腺癌，和抗雄激素如氟利坦 和Cyproteronacetate用于治疗前列腺癌。本发明包括， 一些形成肿瘤的细胞本身在核中含有YB-1或这样做或 在诱导和活化导入核中以后含有YB-1，或包含本公开内容意义上的去调 节的YB-1。优选地，约5%或任何比其更大的百分比(即6 %, 7 %, 8 %等) 的肿瘤形成细胞是这种YB-1核-阳性的细胞，或其中存在去调节的YB-1 的细胞。对于其它肿瘤，例如乳腺瘤、骨肉瘤、卵巢癌、关节癌或肺癌， 含有去调节的YB-1或者表现出独立于细胞周期的YB-1核定位的肿瘤细 胞的百分比可以是约30 50 % [Kohno K.等，BioEssays 2003, 25， 691-698]。 这样的肿瘤可以优选地使用根据本发明的腺病毒治疗。分别通过外部胁迫 和通过局部施加胁迫可以诱导YB-1的核定位。这种诱导可以例如通过辐 照、特别是UV辐照，施用如尤其已经在本文中公开的细胞生长抑制剂， 和过热来发生。关于过热，重要的是现在可以以非常特定的方式、更具体
以局部的方式实现，因此还可以造成YB-1在核内的特定的核转运，因此， 提供了腺病毒复制和因此细胞和肿瘤裂解的先决条件，其优选地是局部限制的(Stein U， Jurchott K， Walther W， Bergmann S, Schlag PM， Royer HD. J Biol Chem. 2001，276(30):28562-9; Hu Z， Jin S, Scotto KW. J Biol Chem. 2000 Jan 28; 275(4):2979-85; Ohga T， Uchiumi T， Makino Y， Koike K， Wada M， Kuwano M, Kohno K. J Biol Chem. 1998， 273(11):5997-6000)。本发明的药物因此也可以施用于患者和患者组，或可以为他们设计， 其中通过适当的治疗前或伴随治疗分别实现YB-1的转运，特别地在各种 肿瘤细胞中的转运，并在细胞中生成去调节的YB-l。关于根据本发明使用的本文描述的腺病毒用于裂解的细胞的特征，设 想这些特征在一个实施方案中具有抗性，优选多种抗性或者多抗性。本文 使用的抗性优选指对本文描述的细胞生长抑制剂和或/辐射的抗性。该多种 抗性优选伴随着膜结合的转运蛋白P-糖蛋白的表达，优选过表达，P-糖蛋 白是用于确定各自细胞和由此还有显示出所述细胞的肿瘤和对应的患者 组的标记。本文使用的术语抗性包括在本文中也称作典型抗性并且通过P-糖蛋白介导的抗性，以及也称作非典型抗性并且由MRP介导的抗性或者 其他的、非P-糖蛋白介导的抗性。如这里提及的抗性是肿瘤和要治疗的患 者的特征，它们由下述基因介导，但是不限于它们MDR, MRP，拓扑异 构酶,BCL2，谷胱甘肽-S-转移酶(GST),蛋白激酶C(PKC)。由于细胞生长 抑制剂的作用是尤其以诱导程序性细胞死亡为基础，与程序性细胞死亡相 关的基因的表达在抗性的产生中起关键作用，使得下述因子也是与其相关 的，艮卩Fas, BCL2家族，HSP 70禾口 EGFR [Kim等，Cancer Chemther. Pharmacol. 2002， 50, 343-352]。另一个与YB-1表达相关的标记是拓扑异构 酶IIcu因此，为了确定患者是否可以使用腺病毒按照本发明治疗以获得 预期成功，可以在代替或除了确定在核内的YB-1夕卜，在筛选方法中可使 用拓扑异构酶II(X或任何本文所述的其它标记。原则上， 一种可以类似用 作P-糖蛋白的标记是MRP。至少就结直肠癌细胞或患结直肠癌的患者而 言，另一个标记是PCN(增殖细胞核抗原)(Hasan S.等，Nature, 15,387-391, 2001)，例如Shibao K.等所述(Shibao K等，Int. Cancer, 83， 732-737, 1999)。 最后，至少在乳腺癌细胞和骨肉瘤细胞领域中，MDR(多重药抗性)的表达 是在上述意义上的标记(Oda Y等，Clin. Cancer Res.， 4, 2273-2277)。可以根 据本发明使用的另一个可行的标记是p73 (Kamiya， M.， Nakazatp， Y.， J Neurooncology 59, 143-149 (2002); Stiewe等，J. Biol. Chem., 278， 14230-14236, 2003)。本发明的一个具体优点是，那些患者也可以使用根据本文描述的腺病 毒治疗，他们否则将不能再在医学临床意义上被治疗并且从而用现有技术 方法对肿瘤疾病的进一步治疗预期不再可能成功，尤其细胞生长抑制剂和 放射的使用不再是合理的可能的并且在影响或者缩小肿瘤的意义上不再 能成功的进行。这里，术语肿瘤一般还指任一肿瘤或者癌症疾病，其在细 胞核中、优选独立于细胞周期内在地含有YB-1，或者通过应用如本文公 开的外源措施而含有YB-1和/或含有去调节的YB-l。此外，本文描述的病毒原则上可以用于治疗肿瘤。通过本文描述的病毒可以具体治疗的肿瘤优选为选自包含如下各项 的组的那些肿瘤神经系统的肿瘤、眼睛肿瘤、皮肤肿瘤、软组织肿瘤、 胃肠肿瘤、呼吸系统的肿瘤、骨骼的肿瘤、内分泌系统的肿瘤、女性生殖 系统的肿瘤、乳腺肿瘤、雄性生殖系统肿瘤、排尿系统的肿瘤、造血系统 的肿瘤，包括混合型和胚胎肿瘤。本发明包括，这些肿瘤尤其如本文定义 的抗性肿瘤。神经系统的肿瘤的组优选包括1. 颅骨以及脑(颅内)的肿瘤，优选星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、 脑膜瘤、成神经细胞瘤、神经节瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维瘤、 成血管细胞瘤、脂肪瘤、颅咽管瘤、颅咽管瘤和脊索瘤，-2. 脊髓和椎管的肿瘤，优选成胶质细胞瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、 神经纤维瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤和多发性骨髓瘤； 禾口3. 外周神经的肿瘤，优选神经鞘瘤、神经纤维瘤、神经纤维肉瘤和神 经周成纤维细胞瘤。眼睛肿瘤的组优选包含1.眼睑和眼睑腺的肿瘤，优选腺瘤、腺癌、乳头状瘤、组织细胞瘤、 肥大细胞瘤、基底细胞瘤、黑素瘤、鳞状细胞癌、纤维瘤和纤维肉瘤；
2. 结膜和瞬膜的肿瘤，优选鳞状细胞癌、血管瘤、血管肉瘤、腺瘤、 腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤和乳头状瘤；禾口
3. 眼眶、视神经和眼球的肿瘤，优选视网膜成神经细胞瘤、骨肉瘤、 肥大细胞瘤、脑膜瘤、网状细胞瘤、神经胶质瘤、神经鞘瘤、软骨瘤、软骨瘤、鳞状细胞癌、浆细胞肿瘤(plasmacelltumor)、淋巴瘤、横纹肌肉瘤 和黑素瘤。皮肤肿瘤的组优选包括组织细胞瘤、脂肪瘤、纤维肉瘤、纤维瘤、肥大细胞瘤、恶性黑素瘤、 乳头状瘤、基底细胞瘤、角化棘皮瘤、血管外皮细胞瘤的肿瘤、毛囊的肿 瘤、汗腺的肿瘤、皮脂腺的肿瘤、血管瘤、血管肉瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、 恶性纤维组织细胞瘤、浆细胞瘤和淋巴管瘤。软组织的肿瘤组优选包含肺泡软组织肉瘤、上皮样细胞肉瘤、软组织的软骨肉瘤、软组织的骨肉瘤、软组织的Ewing肉瘤、原发性神经外胚层瘤(PNET)、纤维肉瘤、纤 维瘤、平滑肌肉瘤、平滑肌瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、恶性血 管外皮细胞瘤、血管瘤、血管肉瘤、恶性间叶瘤、恶性外周神经鞘瘤 (MPNST、恶性神经鞘瘤、恶性黑素细胞神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉 瘤、淋巴管瘤和淋巴管肉瘤。 胃肠肿瘤的组优选包含
1. 口腔和舌的肿瘤，优选鳞状细胞癌、纤维肉瘤、Merkel细胞 瘤、诱发性纤维成釉细胞瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、病毒乳头状瘤病、特发 性乳头状瘤病、鼻咽息肉、平滑肌肉瘤、成肌细胞瘤和肥大细胞瘤；
2. 唾液腺肿瘤，优选腺癌；
3. 食管的肿瘤，优选鳞状细胞癌、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、骨 肉瘤、食管癌和围食管肿瘤；
4. 外分泌胰腺的肿瘤，优选腺癌；和
5. 胃的肿瘤，优选腺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤和纤维肉瘤。 呼吸系统的肿瘤组优选包含
1.鼻和鼻腔、喉和气管的肿瘤，优选鳞状细胞癌、纤维肉瘤、纤维瘤、 淋巴肉瘤、淋巴瘤、血管瘤、血管肉瘤、黑素瘤、肥大细胞瘤、骨肉瘤、
软骨肉瘤、嗜酸细胞瘤(横纹肌瘤)、腺癌和成肌细胞瘤；和2.肺的肿瘤，优选鳞状细胞癌、纤维肉瘤、纤维瘤、淋巴肉瘤、淋 巴瘤、血管瘤、血管肉瘤、黑素瘤、肥大细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、嗜 酸细胞瘤(横纹肌瘤)、腺癌、成肌细胞瘤、小细胞癌、非小细胞癌、支 气管腺癌、支气管肺泡腺癌和肺泡腺癌。 骨骼肿瘤的组优选包含骨肉瘤、软骨肉瘤、骨膜外骨肉瘤、血管肉瘤、滑膜细胞肉瘤、 血管肉瘤、纤维肉瘤、恶性间叶瘤、巨细胞瘤、骨瘤和多小叶骨瘤。 内分泌系统的肿瘤的组优选包含1. 甲状腺/甲状旁腺的肿瘤，优选腺瘤和腺癌；2. 肾上腺的肿瘤，优选腺瘤、腺癌和嗜铬细胞瘤(肾上腺髓质瘤)；3. 下丘脑/脑垂体的肿瘤，优腺瘤和腺癌；4. 内分泌胰腺的肿瘤，优选胰岛瘤((3细胞肿瘤，APUDom)和 佐林格一埃利森综合征(胰腺卩细胞的分泌胃泌激素的肿瘤)；和5. 以及多发性内分泌瘤病(MEN)和化学感受器瘤。 雌性性系统肿瘤的组优选包括1. 卵巢的肿瘤，优选腺瘤、腺癌、囊腺瘤、和未分化癌；2. 子宫的肿瘤，优选平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、腺瘤、腺癌、纤 维瘤、纤维肉瘤和脂肪瘤；3. 宫颈的肿瘤，优选腺癌、腺瘤、平滑肌肉瘤和平滑肌瘤；4. 阴道和外阴的肿瘤，优选平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、 fibroleiomyoma、纤维瘤、纤维肉瘤、息肉和鳞状细胞癌。乳腺的肿瘤组优选包括纤维腺瘤、腺瘤、腺癌、间质肿瘤、癌、癌肉瘤。雄性性系统肿瘤的组优选包括1. 睾丸的肿瘤，优选精原细胞瘤、间质细胞瘤和睾丸支持细胞瘤；2. 前列腺肿瘤，优选腺癌、未分化癌、鳞状细胞癌、平滑肌肉 瘤和移行细胞癌；和3.阴茎和外生殖器的肿瘤，优选肥大细胞瘤和鳞状细胞癌。排尿系统肿瘤的组优选包括1. 肾的肿瘤，优选腺癌、移行细胞癌(上皮肿瘤)、纤维肉瘤、软骨肉瘤(间质肿瘤)、Wilm、s肿瘤、肾胚细胞瘤和胚胎肾瘤(胚胎 多能胚细胞瘤)；2. 输尿管的肿瘤，优选平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、纤维乳头状瘤、 移行细胞癌；3. 膀胱的肿瘤，优选地移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、botryoid (胚胎横纹肌肉瘤)、纤维瘤、纤维肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、 乳头状瘤和血管肉瘤；和4. 尿道的肿瘤,优选地移行细胞癌、鳞状细胞癌和平滑肌肉瘤。 造血系统的肿瘤的组优选包含1.淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、非淋巴细胞性白血病、骨髓增 生性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤。 混合型和胚胎肿瘤的组优选包含 血管肉瘤、胸腺瘤和间皮瘤。在尤其优选的实施方案中，这些肿瘤选自包含下列各项的组乳腺癌、 卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、成胶质细胞瘤、小细胞肺癌 和结肠直肠癌。其他肿瘤是如本文描述的抗性的肿瘤，优选多种抗性的肿瘤，尤其上述组的那些肿瘤。特别优选的肿瘤为选自包含下列各项的组乳腺肿瘤、骨肿瘤、胃肿瘤、肠肿瘤、胆囊肿瘤、胰腺肿瘤、肝脏肿瘤、 肾肿瘤、脑肿瘤、卵巢肿瘤、皮肤和皮肤附属器的肿瘤、头/颈肿瘤、子宫 肿瘤、滑膜肿瘤、喉肿瘤、食管肿瘤、舌瘤和前列腺肿瘤的那些肿瘤。优 选肿瘤为本文关于它们的表征公开的那些肿瘤。使用根据本发明的病毒可以治疗的其他肿瘤为白血病和转移性肿瘤， 尤其前述肿瘤的转移性肿瘤。可以根据本发明治疗的其他肿瘤选自包含原 发性肿瘤、继发性肿瘤、第三次发作的肿瘤和转移性肿瘤的组。优选肿瘤 包含至少一种下面的特征，即它们在独立于细胞周期的细胞核中具有YB-1，不管原因是什么，和/或它们包含去调节的YB-1。可以用根据本发 明的病毒治疗的的另一组肿瘤分别是所有前述提到的肿瘤和本文描述的 可以用本发明的病毒治疗的肿瘤，条件是它们具有一种或几种本文公开的 抗性。本发明还包括，这样的肿瘤也可以用根据本发明的病毒治疗，所述肿瘤优选独立于细胞周期在核中不含有YB-1，也不含有去调节的YB-1。如 果病毒自身编码YB-1，就可以特别实现治疗。由于YB-1的特异表达和从 而病毒的特异复制，病毒的表达处于控制下，在一个优选的实施方案中优 选处于高度调节的启动子的控制下。这种启动子可以是可以以特定方式激 活，从而病毒仅可以在目的的细胞中复制的任一种启动子。尤其优选的启 动子具体是肿瘤特异性启动子和组织特异性启动子，它们是本领域技术人 员已知的。YB-1属于一组高度保守的因子，它们结合倒置的CAAT序列，即所 谓的Y盒。它们可以在转录以及翻译水平上以调节的方式有活性(Wolffe,A. P. 7 ewfe /" Cell Biology 8, 318-323， 1998)。编码YB-1的核酸还可以包含介导YB-1转运到细胞核的核酸序列， 所述核酸在根据本发明使用的腺病毒的一个实施方案中是腺病毒的部分。 根据本发明的核酸、病毒和病毒系统以及现有技术中己知的腺病毒，如 Onyx-015、 AdA24、 dl922-947、 ElAd/01/07、 CB016、 dl 520和专利EPO 931 830中描述的腺病毒可以原样使用或者与根据本发明的作为腺病毒、腺病毒系统和从而作为对应的核酸的这些核酸组合使用。介导细胞核转运的合 适的核酸序列是本领域技术人员已知的并且例如在(Whittaker， G.R.等，Virology, 246, 1-23， 1998; Friedberg, E.C., TIBS 17, 347， 1992; Jans, D.A.等， Bioessays 2000 Jun; 22(6):' 532-44; Yoneda, Y., J. Biocehm. (Tokyo) 1997 May; 121(5): 811-7; Boulikas, T., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1993; 3(3): 193-227; Lyons RH， Mol. Cell Biol., 7, 2451-2456, 1987)中描述。关于介导核 转移的核酸序列，可以使用不同的原理。 一种原理可以例如是YB-1与信 号肽一起形成融合蛋白并导入细胞核中，从而发生本发明腺病毒的复制。 在根据本发明使用的腺病毒的设计中可以实现的另一原理是可以为 YB-1提供转运蛋白序列，其优选从细胞质中的合成开始，将YB-l导入细 胞核中或者将YB-1转运到细胞核中，并促进细胞核中的病毒复制。介导 核转运的尤其有效的核酸序列的一个实例是HIV的TAT序列，其尤其s
是描述在Efthymiadis， A" Briggs, U， Jans, DA,， JBC 273, 1623-1628, 1998中的该类型的其他合适的核酸序列。本发明包括，根据本发明使用的腺病 毒包含编码核转运肽的核酸序列。本发明包括，YB-1以全长存在，尤其以对应于YB-1的野生型的形式 存在。本发明包括，YB-1作为衍生物，如以縮短或者截短的形式使用或 存在。如本发明中使用或存在的YB-1衍生物是能够结合E2晚期启动子从 而激活腺病毒E2区的基因表达的YB-1。此类衍生物尤其包含本文公开的 YB-1衍生物。通过在N-末端、C-末端或者氨基酸序列内缺失单个或几个 氨基酸可以产生其他衍生物。本发明包括，YB-1片段还用作本发明意义 中的YB-1蛋白。多种YB-1片段公开在Jiirchott K等[JBC 2003, 278， 27988-27996]的文章中，这些片段的特征是在C-末端和N-末端的缺失。多 种YB-1片段的分布表明冷激结构域(CSD)以及C一末端对于细胞周期 调节的YB-1向核的转运是重要的。从而，本发明包括，与天然YB-l相 比，截短的YB-1 (其在本文中也称作YB-1蛋白)与根据本发明的ElB55k 和E4orf6的表达组合以更好的方式迁移到细胞核中，从而诱导更强的 CPE，而不必更好地结合E2晚期启动子，从而，不能排除截短的YB-1也 更好地迁移到细胞核中并显示出两种活性，即诱导CPE和结合E2晚期启 动子。最后，此类截短的YB-1片段还可以更好地迁移到细胞核和更好地 结合E2晚期启动子而不诱导更好的CPE。本发明还包括，截短的YB-1 蛋白或片段包含与全长YB-1有关的这里公开的其它序列，特别是细胞定 位信号序列(NLS)等。本发明包括用于制备的药物，其中按照本发明使用病毒，所述药物本 身在它的各种实施方案中表示本发明的另一方面。另一方面，本发明涉及筛选患者的方法，优选该患者患有或怀疑患有 肿瘤或肿瘤疾病，该患者可以使用根据本发明的病毒治疗，其中所述的方 法包含下列步骤-分析患者的样品，优选肿瘤组织的样品，和-在样品的一个或多个细胞中，确定YB-1是否定位在独立于细胞周 期的核内，或者该细胞是否含有去调节/过表达的YB-l。代替或除了 YB-1，还可以检测上述标记的存在，所述标记优选作为或
已知作为代理标记发挥作用。在肿瘤组织或其一部分在核内含有YB-1、优选独立于细胞周期，或含有去调节的YB-1或者细胞在本发明意义上是抗性的情形中，可以根据本发明使用本文公开的腺病毒。在根据本发明的方法的一个实施方案中，通过使用试剂完成肿瘤组织的分析，该试剂选自包含针对YB-1的抗体，YB-1特异性结合肽，针对 YB-1的适配体，和针对YB-1的spiegelmer以及针对YB-1的抗促成素 (anticaline)的组。原则上，还可以制备相同种类的试剂，并分别用于各 自的标记。抗体、特别是单克隆抗体的制备是本领域技术人员已知的。特 异性检测YB-1或标记的另一种试剂是与它们的靶结构以高亲和力结合的 肽，在本发明的情形中的靶结构为YB-1或所述标记。为了产生这样的肽， 在现有技术中已知其方法，例如噬菌体-展示。为此目的，从肽库开始，其 中单个肽具有约8-20个氨基酸的长度，库的大小约有102-1018、优选 108-1015种不同的肽。 一种结合多肽的特殊形式的靶分子是所谓的抗促成 素，其例如在德国专利申请DE 197 42 706中描述。用于特异性地结合YB-1或本文公开的相应备选标记、并因此检测独 立于细胞周期的YB-1在细胞核内的定位的另一种试剂是所谓的适配体， 即D-核酸，其以RNA或DNA为基础，作为单链或双链存在，并特异性 地与靶分子结合。适配体的产生例如在欧洲专利EP 0 533 838中描述。适 配体的一种具体实施方案是所谓的aptazyme，其例如在Piganeau, N.等 (2000), Angew. Chem. Int. Ed.， 39， no. 29,第4369 — 4373页中描述。它们是 适配体的具体实施方案，因为它们除了包含适配体部分外还包含核酶部 分，在结合或释放结合适配体部分的靶分子以后，核酶部分获得催化活性 并剪切核酸底物，这伴随着信号的产生。另一种形式的适配体是所谓的spiegelmer,即由L-核酸组成的靶分子 结合核酸。制备该spiegelmer的方法例如在WO 98/08856中描述。可以通过穿刺或通过外科手术获得肿瘤组织的样品。对YB-1是否定 位于独立于细胞周期的核内的评估经常通过使用显微镜技术和/或免疫组 织学分析进行，典型地使用抗体或任何其它的前述试剂来完成。本领域技 术人员已知其它方法来检测YB-1在核内的存在和它在其中的定位是独立
于细胞周期的。例如，当扫描针对YB-1染色的组织切片时，可以容易地检测YB-1的定位。YB-1在核内的存在频率己经成为在核中独立于细胞周 期地定位的指征。独立于细胞周期地检测核内的YB-1的另一可能性是， 针对YB-1进行染色并检测YB-1是否定位于核内和确定细胞的阶段。然 而，这以及YB-1的检测也可以通过使用前述针对YB-1的试剂实现。通 过本领域技术人员已知的方法进行试剂的检测。因为所述的试剂特异性地 针对YB-1、因此不结合要分析的样品中的其它结构、特别是细胞的其它 结构，借助于试剂的合适标记和由于它们的特异性地结合到YB-1，可以 检测和分析所述试剂的定位，还有可以相应地检测和分析YB-1的定位。 标记试剂的方法对本领域技术人员是已知的。本发明包括，本文描述的病毒，不管它们是根据本发明的病毒，还是 它们是将根据本发明使用的病毒，也可以用于疾病，尤其肿瘤疾病和更优 选地，其中肿瘤细胞的至少一部分显示出多种抗性，尤其多药物抗性的肿 瘤疾病，其中YB-1以去调节的形式存在。这也应用于本文关于细胞和肿 瘤描述的每一和任一其他方面，条件是它们指其中YB-1存在于细胞核， 优选独立于细胞周期存在于细胞核中的细胞和疾病。尽管根据本发明的和如本文公开的病毒优选为腺病毒，但是洞察力、 方法和用途、核酸、蛋白、复制系统等等不限于腺病毒，但应用于其它病 毒和病毒系统。前面的考虑，包括腺病毒和腺病毒系统的任何应用和产生，也适用于 编码它们的核酸，反之亦然。根据本发明可能的是，根据本发明使用的腺病毒和编码它们的核酸分 别可以是任何对应的腺病毒核酸，该腺病毒核酸本身或与其它核酸序列组 合导致复制事件。如本文所解释，可能通过辅助病毒提供复制所需的序列 和/或基因产物。在提及编码核酸序列方面和在该核酸序列是已知的核酸序 列的方面，本发明包括不仅使用相同的序列，而且使用其衍生的序列。衍 生序列特别是指仍产生基因产物(核酸或多肽)的那些序列，其具有相应 于一种非衍生序列能或非衍生序列的功能。这可以通过本领域技术人员己 知的常规试验确定。该衍生的核酸序列的实例是编码相同基因产物、特别 是相同氨基酸序列的那些核酸序列，然而，由于遗传密码的简并性而具有
不同的碱基序列。本发明包括，根据本发明的病毒作为复制系统存在，其有或者没有辅 助病毒。本发明还包括，对于根据本发明的这种腺病毒复制系统，腺病毒核酸 和/或核酸是作为可复制的载体存在。本发明还包括，编码根据本发明使用的腺病毒的核酸存在于表达载体 中，该表达载体根据本发明使用。在另一方面，本发明还涉及包含至少两个载体的载体组，其中载体组 总共包含如本文所述的腺病毒复制系统，载体组根据本发明使用。本发明 包括，腺病毒复制系统的每个组分存在于单独的载体、优选表达载体上。最后，本发明的另一方面还涉及细胞的应用，所述细胞含有一个或数 个核酸，所述核酸编码的根据本发明使用、和将要根据本发明使用的病毒， 和/或相应的病毒复制系统和/或相应的载体和/或根据本发明的载体组，用 于本文关于各种腺病毒所述的非常相同的目的。前述病毒构建体和特别是它们的核酸和编码它们的核酸，也可以以多 份的形式导入细胞、优选肿瘤细胞中，于是由于各种单独组分的存在，它 们可以这样一起作用，好像单个组分分别来源于单个核酸和单个或数个病根据本发明使用的编码病毒、其病毒系统或其部分的核酸也可以作为 载体存在。优选地，这些载体是病毒载体。当核酸包含病毒核酸时，优选 地病毒颗粒为载体。然而，本发明也包括，所述核酸以质粒载体存在。在 每个情形中，载体包含允许和控制插入的核酸的增殖(即复制)和插入的 核酸的任选表达的元件。适当的载体、优选表达载体和各自的元件是本领域技术人员已知的，例如在Grunhaus, A.， Horwitz， M.S., 1994， Adenoviruses as cloning vectors. In Rice, C., editor, Seminars in Virology, London: Saunders Scientific Publications中描述涉及载体组的方面考虑前述实施方案，既所述核酸的各种元件不一定 仅包含在一个载体中。因此，载体组由至少两个载体组成。另外，关于载 体进行任何论述也分别适用于载体和载体组。根据本发明使用的病毒，尤其是腺病毒的特征分别在于本文公开的各
种核酸和基因产物，并可以另外优选包含本领域技术人员已知的且是野生型腺病毒固有的所有那些元件(Shenk， T.: Adenoviridae: The virus and their replication. Fields Virology, vol. 3, editors Fields, B,N.， Knipe， D.M.， Howley, P.M.等，Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, chapter 67)。在另一方面，本发明涉及治疗肿瘤疾病的方法，其包括施用根据本发 明的病毒、此类核酸、载体、复制系统、药物或者药物组合物。肿瘤疾病 是如本文公开的一种。患者需要此类治疗并且优选为选自本文公开的患者 的患者。本发明包括，如果不相反指出，关于根据本发明的各自的病毒、核酸、 载体、复制系统、药物和药物组合物公开的特征和实施方案也应用于本发 明的每一和任一其他方面。本发明包括，可以将多种转基因克隆到病毒基 因组中合适的位点中。尤其优选El-、 E2A-、 E2B-、 E3-禾n E4-区。尤其 优选转运蛋白向El区的克隆。本领域技术人员认识到转基因向病毒基因 组的各自位点的克隆将部分或者完全失活或缺失这些位点编码的基因。然 而，本发明包括，特定位点编码的基因可以部分或者完全保留有松活性。根据本发明的病毒优选为腺病毒。术语疾病或病征的治疗在优选实施方案中还包括该疾病或病征的预防。现在，利用附图和实施例进一步说明本发明，从中将获得新特征、实 施方案和优势。 '图1显示了腺病毒载体的结构设计，该载体在本文中称为AdEl/E3-负型的腺病毒载体，为野生型腺病毒和腺病毒d1520的El/E3-缺失的腺病 毒；图2显示了 E1A蛋白关于结合p300、 p107和p105的结合域；图3显示了 U20S细胞，在用El/E3-缺失的腺病毒Ad5 (本文称为 El/E3-负型的Ad5)和dl520感染后，在其核内不含有YB-1;图4显示了 257RDB细胞，在用El/E3-缺失的腺病毒Ad5 (本文称为 El/E3-负型Ad5)和腺病毒dl520感染后，在其核内含有YB-1;图5显示了在用腺病毒d11119/1131感染后的257RDB细胞和U20S 细胞；
图6显示了 EMSA分析的结果，其证实了 YB-1分别存在于多药抗性 的细胞和细胞系257RDB， 181 RDB, MCF-7Ad中，而YB-1不存在于U20S 和HeLa细胞的核内；图7显示了野生型腺病毒、腺病毒d1520和腺病毒d11119/1131的E1A 蛋白的结构设计；图8是显示了在另外表达的病毒蛋白的存在下腺病毒复制效率的直方 图，为绝对数值；图9是显示了在另外表达的病毒蛋白的存在下腺病毒复制效率增加的 直方图；图10显示了在分别结晶紫染色和用10和30 pfu/细胞的d1520感染后 和对照(K)的U20S细胞生长的孔，分别未施用柔红霉素和施用40 ng 柔红霉素/ml;图11显示了在分别结晶紫染色和用10和30pfu/细胞的dl520感染后 和对照(K)的HeLa细胞生长的孔，分别未施用柔红霉素和施用40 ng柔 红霉素/ml;图12是不同来源(RDB257和HeLa)的肿瘤的肿瘤体积作为时间函 数的图，其分别为在用PBS和dl520处理以后；图13显示了杀死的小鼠的照片，在分别用PBS和5x 1()Spfudl520处 理后，基于RDB257细胞该小鼠发展了肿瘤；图14是感染了 d1520以后的RDB257细胞和HeLa细胞的细胞提取物 (皮下生长肿瘤)的DNA印迹分析的结果；图15是显示了 YB-1核-阳性的肿瘤细胞(257RDB和181RDB)和 YB-1核-阴性的肿瘤细胞(HeLa, U20S)中的d1520和野生型腺病毒的分别 地复制效率和颗粒形成的直方图；图16显示了野生型腺病毒和腺病毒载体AdXVir03的结构设计；图17显示了腺病毒载体AdXVir03/01的结构设计；图18A/B显示了在结晶紫染色和用Ad312 (20pfli/细胞)、Xvir03 (5 pfW 细胞)感染以后和对照(未感染)的18RDB细胞(图18A)和272RDB细 胞(图18B)生长的孔，其中在感染后5天进行结晶紫染色；图19是用伊立替康处理和不处理细胞的情况下，U373细胞中腺病毒dl 520的复制行为的DNA印迹分析的结果；图20是用曲古抑菌素A处理和不处理细胞的情况下，U373细胞中腺 病毒dl 520的复制行为的DNA印迹分析的结果；图21是与柯萨奇病毒腺病毒受体(CAR)的表达相关的曲古抑菌素 处理的U373细胞中FACS分析的结果，表示为CAR阳性细胞的百分数； 禾口图22显示了四个不同图的细胞层，用于显示复制的腺病毒d1520和伊 立替康和曲古抑菌素的效果；不同组合的图23显示了 E1B 55K的ORF与3'UTR片段和3532位的限制酶切割 位点BfrI的图示；图24显示了对应于野生型Ad 5的序列位置3507到4174位的 ElB55k-3TJTR区的序列；图25显示了 E2基因在感染了野生型腺病毒Ad5和腺病毒Ad312后 的A549细胞和U20S细胞中的表达的RNA印迹分析的结果；图26显示了 E2基因在感染了野生型腺病毒和腺病毒524后12和24 小时的U20S细胞中的表达的RNA印迹分析的结果；图27显示了腺病毒载体XvirPSJLl的结构设计；图28显示了腺病毒载体XvirPSJL2的结构设计；图29显示了在结晶紫染色和用不同pfW细胞的腺病毒d1520感染后 HeLa细胞生长的孔；图30显示了表示荧光素酶在使用腺病毒2-晚期启动子的不同启动子 片段的U20S细胞、HeLa细胞和257RDB细胞中的活性的直方图；图31显示了表示用表达YB-1的腺病毒和病毒Ad312感染U20S细 胞2天和5天后的病毒颗粒数量的直方图，其中在细胞内残留的病毒颗粒 (由黑色表示)和释放出的细胞外的病毒颗粒(水平条)间进行了区别。图32显示了通过E2晚期和E2早期启动子通过E2F和YB-1对腺病 毒E2区的调节的图示；图33显示了野生型腺病毒的图示设计；图34是根据本发明的腺病毒Xvir05/启动子的图示，所述腺病毒表达 处于E2晚期启动子控制下的蛋白IX;
图35是根据本发明的腺病毒Xvir 05/E1A12S的图示，所述腺病毒表 达处于E1A12S控制下的作为E1B55K读框的部分的蛋白IX;
图36是根据本发明的腺病毒Xvir 05E1B19K的图示，该腺病毒表达 处于E1B19K控制下的蛋白IX;图37是根据本发明的腺病毒Xvir 05/E3-IX启动子的图示，该腺病毒 表达处于E3启动子控制下的蛋白IX;图38是野生型腺病毒和根据本发明的腺病毒Xvir05的图示，腺病毒 Xvir 05是病毒Xvir 05/E1B19K的一个实施方案；
图39是野生型腺病毒和根据本发明的腺病毒Xvir 05/蛋白IX的图示， 腺病毒Xvir 05/蛋白IX是病毒Xvir 05/E1A12S的一个实施方案；图40是野生型腺病毒和根据本发明的腺病毒Xvir 05/01的图示，腺病 毒Xvir 05/01是病毒Xvir05/蛋白IX的一个实施方案；图41是野生型腺病毒和根据本发明的腺病毒Xvir 05/02的图示，腺病 毒Xvir 05/02是病毒Xvir 05/蛋白IX的一个实施方案；图42显示了用于检测蛋白IX的RNA印迹分析的结果；图43显示了 Xvir03-3'UTR的DNA印迹分析的结果；图44显示了用Xvir03-3'UTR感染后，使用RNA印迹分析的MRP表 达的结果；图45显示了用Xvir03-3'UTR感染后，使用RNA印迹分析的MDR表 达的结果；图46显示了用Xvir03-3'UTR感染后，使用RNA印迹分析的MRP表 达的结果；图47显示了用结晶紫染色和用腺病毒Xvir03以不同的pfo/细胞感染 后，生长DU145细胞的孔；图48显示了用结晶紫染色和用腺病毒Xvir03以不同的pfU/细胞感染 后，生长PC-3细胞的孔；图49显示了细胞层的四个图，用于图解复制的腺病毒Xvir03和柔红 霉素的效果；和图50显示了分别为腺病毒载体Xvir03和Xvir03-3UTR的结构设计。
实施例1:根据本发明使用的腺病毒可以包含的E1A修饰的类型图1显示了腺病毒载体AdEl/E3-负型(即El/E3-缺失的腺病毒)、野生 型腺病毒和腺病毒d1520的结构设计。腺病毒AdEl/E3-负型不含有编码功能性的El A或功能性的E1B或E3 的区域，在本实验中用作毒性对照。野生型El A基因编码总共5个蛋白，其是通过El A RNA的选择剪接 产生的。其中，产生2个不同的蛋白，即289个氨基酸的蛋白和243个氨 基酸的蛋白。dl520不编码289个氨基酸的蛋白，因为它在E1A基因的CR3 区域中存在缺失，导致缺乏13S的基因产物的缺失。根据本发明可以使用 的腺病毒dl520被本领域技术人员称为12S-E1A病毒。现有技术中已知的 腺病毒d1347 (Wong禾Q Ziff， J. Virol.， 68， 4910-4920， 1994)也是可以根据本 发明使用的12S-E1A病毒。在由DS-ElAmRNA编码的289个氨基酸的蛋白中，存在在各种腺病 毒亚类之间保守的3个区域。这些称为CR1、 CR2和CR3。尽管CR1和 CR2存在两种E1A蛋白(E1A12S和E1A13S)中，即在289个氨基酸和 243个氨基酸的蛋白中，CR3区域仅存在于前述两个蛋白中较大的一个中。病毒基因特别是E1B、 E2、 E3和E4的激活需要CR3区域。仅含有 较小(即243个氨基酸的)蛋白的病毒仅能极弱地反式激活病毒基因，并 且不促进在核内不含有YB-1的那些细胞中的腺病毒的复制。因为YB-1 仅存在于肿瘤细胞的核内和仅可以在那里检测到，该载体适合诱导肿瘤特 异性的复制。由于d1520中CR3的缺失，该腺病毒不能将细胞YB-1转移至细胞的 核内，其在本文中也称为移位，因此不是在YB-l核-阴性的细胞中进行复 制的位置，因此是可以根据本发明使用的病毒，其中所述的病毒包含根据 本发明所需的反式激活。实施例2:腺病毒的作用方式依赖于细胞的Rb状态图2显示了 E1A蛋白的与p300、 p107和p105的结合有关的结合域。 P300以及pl07是细胞结合蛋白。成视网膜细胞瘤蛋白(pRb)是一种肿瘤抑 制蛋白，其结合是通过CR1和CR2介导的。研究已经表明，pRb和
pl07/p300，结合细胞转录因子E2F，在调节转录中有效。野生型E1A蛋 白能干扰E2F与Rb的结合。如此释放的E2F能结合E2早期启动子，并 由此诱导腺病毒的复制。从现有技术中已知，E1A癌蛋白中的某些缺失可能会产生如下面提及 的那些的重组腺病毒载体，其能够在Rb-阴性的细胞中优势地复制且可以 根据本发明使用。例如，腺病毒载体dl922-947包含CR2区域中的缺失(氨 基酸位点122-129)，载体CB016在CR1区域(氨基酸位点27-80)和CR2 区域中具有缺失(氨基酸位点122-129)缺失。载体ElAdl01/07在CR2 区域中含有缺失(氨基酸位点111-123)。另外，因为在N-末端(氨基酸位 点4-25)处的其它缺失，另外，不与蛋白p300结合。腺病毒载体AdA24 在CR2区域中含有缺失(氨基酸位点120-127)。在专利EPO 931 830中描 述的腺病毒载体在CR1区域和CR2区域含有缺失。E2F/RB的结合机制和E1A介导的E2F的释放机制根本不同于构成本 发明基础的机制。不同于现有技术中假设的，不是E2F从Rb蛋白中的释 放，Rb蛋白即使不说对于病毒复制是关键性的也是必要的，而是人转录 因子YB-1的核定位。该转录因子在正常细胞中在大多数细胞周期中仅存 在于细胞质中。在用腺病毒感染以后，在某些情形下它被诱导入核内或者 在不同的细胞系统中已经存在核内，如不同的肿瘤病，其包括例如但不限 于乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，骨肉瘤癌，成胶质细胞瘤，黑素瘤，小细 胞肺癌和结直肠癌。实施例3: U20S细胞的感染每孔平铺100,000个U20S细胞。次日用如图3所示的不同腺病毒感 染细胞。在500 pl无血清的DMEM培养基中在37。C下感染1小时。随后， 去除感染培养基，并用2 ml完全培养基(IO % FCS/DMEM)替换。在3天 后使用结晶紫染色进行分析。如从图3中可以获得，在核内不含有YB-1的U20S细胞在用两种不 同腺病毒感染以后未显示如结晶紫染色所示的裂解，所述腺病毒即称为 El/E3-负型的EI/E3-缺失的腺病毒、和腺病毒d1520，其可以根据本发明 使用。与其相关，首先去除培养基。随后，用结晶紫(50y。ETOH, 3%甲
醛，5%乙酸，1%结晶紫)覆盖细胞，在室温下孵育5-10分钟。随后，用水 充分漂洗具有6个孔的平板，室温干燥。
这证实构成本发明基础的发现，即需要YB-1的存在以便诱导根据本发明使用的病毒来裂解感染的细胞。
实施例4: 257RDB细胞的感染每孔平铺100,000个257RDB细胞。次日用如图4所示的不同腺病毒 感染细胞。在500iLil无血清的DMEM培养基中在37。C下感染1小时。随 后，去除感染培养基，并用2 ml完全培养基(IO % FCS/DMEM)替换。在3 天后使用结晶紫染色进行分析。
本实验的结果在图4中描述。经感染核内含有YB-1的257RDB细胞 以后，称为El/E3-负型Ad5的、El/E3-缺失的腺病毒在低M0I(pfW细胞) 下未显示任何裂解。与此相反，如实施例3所示的d1520，在YB-l核-阴 性的细胞中不复制，同时编码根据本发明用于反式激活癌基因蛋白的 E1A，在40pfii/细胞的MO1 (感染复数)下导致实际上完全的裂解，和在 10pfo/细胞的MOI下仍导致显著裂解。可以从中得出结论，dl520和类似 的病毒如本文中通过d11119/1131或AdXvir 03所述，需要与El-缺失或 El/E3-缺失的腺病毒相比减小约l个数量级(十倍)的MOI，这证明了它 们的临床应用。
如图7所示，dl520的蛋白ElA的特征在于其缺失CR3区域，导致根 据本发明的应用所需的反式激活和YB-1核-阳性的细胞中的复制。
实施例5:用d11119/1131感染257RDB和U20S细胞如图5所示，在用腺病毒d11119/1131感染YB-1核-阴性U20S细胞以 后在20 pfli/细胞的MOI下没有裂解，所述腺病毒d11119/1131缺失E1A蛋 白的氨基酸4-138和编码它们的核酸，并在氨基酸218后另外包含终止密 码子，其中表达的截短的E1A蛋白包含完整的E1A蛋白的CR3区域。作 为阴性对照，使用未感染的细胞层。
与其相反，在如核内含有YB-1、即YB-1核-阳性的257RDB的细胞 系统中，在腺病毒dl1119/1131的影响下，细胞层在20pfW细胞的MOI下
实际上完全裂解。因此该实施例是另一证据，其证明了如图7所示的修饰的E1A癌基因蛋白仅包含例如CR3区域和缺少CR1区域和CR2区域，在 YB-1核-阳性的细胞中能提供所需的反式激活，这是根据本发明的腺病毒 的复制所需的，导致了病毒复制。腺病毒dU119/1131因此是根据本发明 可以使用的另一种腺病毒。本发明包括，也可以使用在CR3区域类似于 d11119/1131的设计但与其相反具有CR1区域和/或CR2区域的病毒。实施例6:检测多药抗性的细胞中的核YB-1本实施例是基于以下考虑，即核YB-l应当作为转录因子结合mdrl启 动子(多药抗性启动子)内的Y-盒(CAAT序列)。为了检测，进行所谓 的EMSA分析(电泳迁移率变动分析)。与其相关，分离核蛋白，随后将 l-10pg蛋白与短DNA片段(寡) 一起在37匸下孵育。为了测定核YB-1， 使用了下列寡核苷酸..与U203相对的mdrl启动子(位点-86至-67): TGAGGCTGATTGGCTGGGCA(SEQ. ID:No. 1) (X-盒加下划线)。在这之前，在5'末端用"P放射性标记该DNA片段。随后，在天然聚 丙烯酰胺凝胶中进行分离。在蛋白YB-1结合寡核苷酸中序列的情形中， 可以检测它，因为任何未结合的寡核苷酸在凝胶中的迁移比结合的寡核苷 酸迁移快(Holm， P. S.等，JBC 277， 10427-10434, 2002; Bargou, R. C.等, Nature Medicine 3， 447-450, 1997)。如图6所示，EMSA分析可以证实，与细胞系U20S和HeLa细胞形 成对比，多药抗性的细胞257RDB、 181RDB和MCF-7Ad细胞的核中存在 YB-1。实施例4和5的结果证实，与U205形成对比，腺病毒d1520和 d11119/1131在YB-1核-阳性的细胞例如257RDB中复制，并诱导其裂解。 这证实了关于根据本发明的腺病毒的应用的发现。另外，该结果已经证实， 与野生型腺病毒相比，在YB-1核-阳性的细胞中通过修饰或缺失的E1A 基因产物来微弱地反式激活病毒基因，在核内YB-1存在下导致成功的复 制和这些细胞的裂解，这些细胞包括例如多药抗性的细胞，本文所述的腺 病毒可以因此用于裂解这些肿瘤。
实施例7:提高El-负型腺病毒的复制效率本实施例证实，早期病毒基因E1B-55K禾B E4orf6可以通过用质粒 pE4orf6转染和El/E3-缺失的腺病毒Ad-55K感染来替代。Ad-55K是缺失 El/E3的病毒，由此将E1B-55K克隆到El中并在CMV的控制下 (Dobbelstein， M.等，EMBO Journal, 16,4276-4284, 1997)。根据以下事实该 替代是需要的，即AdYB-l (表达YB-1的腺病毒)不表达这些早期基因， 本发明的发明人已经认识到，在核内含有YB-1的复制系统中，这些早期 基因的替代能够分别提高复制效率和颗粒形成效率，其程度比得上一种类 型Ad5的野生型腺病毒。进行以下各项使用脂转染胺，用质粒pE4orf6转染各个105 U20S细胞。质粒pE4orf6 携带在CMV控制下的编码早期病毒基因E4orf6的DNA序列。用质粒pE4or伤转染后24小时，用表达YB-1的El/E3-缺失腺病毒 AdYB-l (50 pfo/细胞)和El/E3-缺失的E1B-55K腺病毒Ad-55K (50 pfU/细 胞)感染细胞。Ad-55K是El/E3-缺失的病毒，其携带在CMV控制下的作 为转基因的病毒基因E1B-55K。随后，在感染后5天(=感染后)从培养基(2ml)中去除细胞。通过交 替冷冻和解冻3次(融/冻)，从分离的细胞中释放病毒颗粒。随后，对293 细胞进行噬菌斑试验，以测定产生的感染性颗粒(噬菌斑形成单位/ml (pfo/ml))。结果在图8和9中表示。图8显示了噬菌斑试验的结果，以 绝对数值表示。通过用质粒pE4orf6转染和用两种病毒AdYB-l和Ad-55K 共感染来显示了与仅用AdYB-l感染相比的最显著的差别。图9显示了图 8的结果，其中复制效率的提高表示为对AdYB-l测定的复制倍数。用质 粒pE4orf6和随后用AdYB-l和E1B-55K (Ad-55K)感染的细胞产生高达25 倍多的pfu/ml。基于这些结果可以得出结论，E1B-55K和E4orf6的替代提高了用 El/E3-缺失的腺病毒AdYB-l感染后形成的病毒数量(pfb/ml)高达25倍。 与两种基因产物各自的效果相比，E1B-55K和E4orf6对生成噬菌斑形成 单位(pfu)的附加作用显著更高。使用表达EGFP的一个质粒的对照实验清楚地证实了，在所选实验方 法中，仅10%的细胞被质粒pE4orf6成功地转染。在均表达E1B-55K和 E4orf6的细胞中形成的颗粒数量比得上一种的人腺病毒类型5 (野生型)。 这证实了构成本发明基础的发现，即E4orf6和E1B-55K的表达、再结合 YB-1的核定位，能够提供腺病毒复制和颗粒形成，特别是ElA-缺失的腺 病毒，其比得上一种野生型Ad5。实施例8:在YB-1核-阳性的细胞中经施用细胞生长抑制剂后提高的腺病 毒复制，该腺病毒在YB-1核阴性的细胞中不复制现有技术中已知，加入不同的细胞生长抑制剂会诱导人转录因子YB-1 的核定位。如本发明的发明人已经发现，定位在核内的YB-1通过激活腺 病毒2-晚期启动子来控制腺病毒复制。为了提供特异性的肿瘤裂解，可以 组合使用两种作用。在肿瘤消解测定的实施中，依照下列步骤将200,000个细胞(分别 为HeLa和U20S)接种到6孔板的每孔中。次日，加入40 ng/ml (终浓度) 的柔红霉素。在孵育3小时后，分别用10和30pfbdl520/细胞感染细胞。 随后，将细胞在无细胞生长抑制剂的培养基中孵育。在3-5天后，使用结 晶紫将细胞染色。如从图10和11中可以获知，柔红霉素的加入会通过YB-1的核定位 诱导dl520的复制。因此，与只用柔红霉素相比，与细胞生长抑制剂柔红 霉素组合使用，dl520产生更大的肿瘤裂解效果。实施例9: dl520的体内肿瘤裂解在无菌细胞培养条件下，繁殖用于本体内研究的HeLa(YB-1核-阴性) 和257RDB (YB-1核阳性)细胞。在将细胞注射到小鼠(CDlNuNu品系) 中以便产生皮下肿瘤之前，通过胰蛋白酶处理收集细胞，放入DMEM培 养基(IO % FCS)中，计数并用PBS洗涤一次。随后，将细胞离心，吸出 PBS，以期望的细胞数目将细胞在新鲜PBS中分份。在本研究中，皮下注 射的细胞数是两个细胞系每个5 x 106个细胞。进行皮下注射至动物的一 侧，其中将HeLa细胞注射到右侧，将257RDB细胞注射到左侧，以更好 的区分。l周2次对比肿瘤的生长，其中使用游标卡尺测量肿瘤的长度和 宽度。基于此，基于下列数学公式计算肿瘤体积-3/4兀* a/2* (b/2)2 a =长度，b =宽度一旦肿瘤已经达到200- 520mm3的体积，分别在肿瘤内施用病毒和作 为阴性对照的PBS。注射的体积相等，每次50 )il。连续3天重复注射。 施用病毒的总剂量为5xl()Spft!。随后，继续1周2次记录肿瘤生长，计 算体积。在研究结束时杀死小鼠，取出肿瘤用于进一步分析。结果在图12和13中表示。图12显示了表示作为时间函数的肿瘤体积和不同治疗方案的图表。 在通过RDB257形成肿瘤的情形中，在注射PBS以后肿瘤显著生长至约 438 mm3 - 1466 mm3。在根据本发明使用的载体d1520的影响下，肿瘤的生 长显著减小。从344mm3的平均肿瘤大小开始，肿瘤大小仅增加了 21%， 达到共计543 mm3。在本实施例中，将由HeLa细胞组成的肿瘤用作对照，其在施用PBS 以后的行为类似于在施用PBS以后的基于RDB257的肿瘤。然而，基于 HeLa细胞和用d1520处理的肿瘤仍显示了肿瘤生长的显著增加，从311 mm3开始增加至1954 mm3。图13显示了杀死的裸鼠的照片，所述裸鼠具有使用RDB257生长的 肿瘤。可以清楚的看见，在根据本发明施用腺病毒d1520以后，出5见了肿 瘤的显著减少。在本情形中甚至还有肿瘤体积的减小(施用病毒dl520后 第1天515 mm3;在施用病毒d1520后第30天350 mm3)。实施例10:肿瘤DNA的DNA印迹从肿瘤样品中提取DNA，该肿瘤样品取自实施例9中繁殖的肿瘤中 间。为了分离，使用Qiagen的Dneasy Tissue Kit。按照制造商的使用说明 完成DNA分离。按照其，通过碱裂解从细胞中释放出DNA。随后，经柱 纯化分离的DNA。随后，通过光度测定法在260 nm测定分离的DNA的 浓度。使用2叱DNA样品进行分析，该DNA样品用10个单位的限制酶 Kpnl处理过。随后，在0.8%的琼脂糖凝胶中进行样品的电泳分离。随后， 将DNA印迹在尼龙膜上(按照Schleicher & Schuell系统进行)。将印迹在
膜上的DNA对特异性的1501bp的DNA探针杂交。1501bp的DNA探针 特异性地结合编码E2A的Ad5序列内的3369bp的Kpn I片段。之前通过 PCR(弓l物5'- GTC GGAGAT CAG ATC CGC GT (SEQ.ID.No. 2), 5'- GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT (SEQ.ID.No.3))制备探针，并使用32P放射性 地标记。随后，洗涤膜并曝光于胶片。
肿瘤DNA的DNA印迹结果在图14中表示。分析证实了，仅dl520 在抗性细胞RDB257中体外复制，如泳道3、 4和5所示。泳道1显示了 阳性对照Ad-5d，泳道6、 7和8显示了来自感染了dl520的HeLa细胞的 DNA。因为HeLa细胞不是YB-1核阳性的，病毒d1520不复制，因此据 此检测不到E2A序列。
d1520的其它结果在图15中表示。基于噬菌斑试验，在用dl520和野 生型腺病毒感染以后研究颗粒形成(pfo/ml)。用d1520和野生型腺病毒感染 了各种YB-1核-阳性(257RDB和181RDB)的肿瘤细胞和YB-1核-阴性的 肿瘤细胞。
实施下列步骤将100,000-200，000个细胞各自接种到所谓的具有6个孔的平板(即 6孔平板)中的L 15培养基(抗性的细胞)和含有10% FCS的DMEM (非 抗性的细胞)。24小时后，用d1520和野生型腺病毒进行感染(IO pfo/细胞)。 感染后(感染之后)3天，通过交替冷冻和解冻3次从细胞悬浮液(3 ml) 中释放病毒颗粒。随后，对293细胞进行噬菌斑试验，以测定形成的感染 性颗粒(噬菌斑形成单位/ml(pfu/m1))。结果在图15中显示。噬菌斑试验 的结果表明，类似于野生型腺病毒，d1520在YB-1核-阳性的细胞(257RDB 和181RDB)中复制。因此，当根据本发明使用本文所述的腺病毒时，可 以观察到类似于一种野生型腺病毒的复制效率。
实施例ll:腺病毒载体Xvir03的结构设计
图16显示了腺病毒载体Xvir03的结构设计。腺病毒Xvir03是一种所 谓的El/E3-缺失的腺病毒。这意味着不能制备在腺病毒复制中起作用的 E1A、 E1B (ElB55k禾BElB19K)禾口E3蛋白。El区域的缺失从342扩展 至3528;碱基位点27865-30995的E3区域缺失。如本文所示，术语"El-
缺失的病毒"是指E1不再有功能活性的病毒。这可以通过失活另外大部分 完整的核酸和氨基酸序列而实现，然而这也可以意指具有不同大小的编码El区域蛋白的缺失。因为缺乏E1A和EIB蛋白和编码它们的核酸，E4 区域(如E4orf6)仅微弱表达(与野生型腺病毒相比约1 - 5 %)或根本 不表达。病毒基因ElB55k和E4orf6通过引入Xvir03的异源CMV启动子 (Ckmtech:PlasmidpShuttle)在El区域中表达。代替CMV启动子，可以使 用与E1A表达相关的本文公开的各种和任何启动子。两个基因的可读框通 过所谓的IRES序列(内部核糖体进入位点)(Pelletier, J.和Sonenberg， N. Nature, 1988， 334, 320 - 325)彼此连接。该元件(Novagen: pCITE)提供了来 自1个mRNA的2个蛋白的表达。如下制备载体Clontech公司的System Adeno-X通过将来自M. Dobelstein (University of Marburg)的pCGNElB的 ElB55k可读框用Xbal和Bfrl克隆到Clontech的pShuttle载体中来产生质 粒ElB55k-pShuttle，其中在该情况中，将末端补平并克隆到平末端化的 pShuttle。随后，用Apal将pShuttle中的ElB55k线性化，末端补平并用 Nhel剪切。在第二个载体pcDNA3.1(+) (Invitrogen)中，彼此连续地，使用Novagen 公司的pCITE-4a(+)作为模板，通过TA克隆将作为PCR产物的IRES元件 克隆到EcoRV剪切位点，借助BamHI克隆来自质粒pCMV-E化rf6 (M. Dobelstein, University of Marburg)的E4orf6 = IRES-E4orf6-pcDNA3.1(+)。 用Notl线性化pcDNA3.1(+)中的IRES-E4orf6，末端补平，随后用Nhel 切掉片段IRES-E4orf6。用开放的载体ElB55k-pShuttle (平端,Nhel)连接片 段IRES-E4orf6。随后用I-Ceu I和PI-SceI，从ElB55k-IRES-E4orf6-pShuttle 和CMV启动子以及牛生长激素(BGH)-PolyA中将盒克隆到AE1、 AE3 Adeno-X-质粒(Clontech)中，其称为AdcmvElB/IRES/E4orf6。随后，按照 制造商的使用说明(Ckmtech)制备腺病毒。将用Pacl线性化的含有表达元 件CMV-ElB55k-IRES-E4orf6-BGH polyA的腺质粒转染至HEK293细胞 中，转染后11天，与培养基一起去除脱离的细胞，以便通过反复冻融循 环释放腺病毒。本发明包括并且参考本文提供的技术教导对于本领域技术人员可行的是，其他系统，如QBIOGENE和Microbix的系统AdEasy也可以用于 生产根据本发明的腺病毒，优选重组腺病毒，尤其单独和/或一起含有盒 E4orf6-IRES-ElB55k和YB-1-IRES-E1A12S的那些腺病毒。此外，在盒之 间可以交换个别转基因。本发明还包括，可以生产此类腺病毒并且根据本 发明使用，其中所述盒具有下面的设计ElB55k-IRES-E4orf6和 E1A12S-IRES-YB1。关于本发明，使用所谓的El/E3缺失的重组腺病毒，其含有盒 E4orf6-IRES-ElB55k。然而，在一个实施方案中，腺病毒包含仅E1缺失， 其意味着E3区保持完整。任选地，E4区可以部分和/或完全缺失。在使用不同的系统生产载体中，如下进行。用根据Gmham (Microbix公司)的载体系统，生产具有完整E3区的 腺病毒Ad-Xvir 3'UTR。用pDelta ElsplA克隆载体CMV-E40RF6-IRES-ElB55k 3'UTR-polyA 对于质粒ElB55k 3，UTR-pShuttle (Clontech)，通过从5型腺病毒的 DNA扩增(ElB55k正向引物=5'-ATGGAGCGAAGAAACCC-3'和 ElB55k 3'UTR反向引物二 5'- CACGTCCTGGAAAAAATACAC-3')制备具 有3'-UTR的可读框并导入平末端化的A%el限制性位点，其提供T一末端 (TA-克隆)，并克隆到Clontech公司的pShuttle质粒中。从而为转基因在 5'末端提供hCMV启动子和在3'末端提供牛生长激素多聚腺苷酸化信号。 然而，本发明还包括，分别通过Bam HI和平末端化和TA克隆，使用来 自Dobbelstein (Dobbelstein, M.等，EMBO Journal, 16， 4276-4284, 1997)的 质粒pCGNElB的ElB55k。已经克隆的ElB55k-3，UTR在图23和24中 更详细地描述。载体E40RF6-IRES-pcDNA3.1(+)的克隆将使用5型腺病毒DNA作为模板(E4orf6正向引物 5'-CTTCAGGATCCATGACTACGTCCGGCG-3'禾Q E4orf6反向引物 5'-GAAGTGAATTCCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCGT-3')和来自用 Bam HI切割的质粒pCMVE4-34kD (Dobbelstein等，EMBO, 16， 4276-4284,1997)和具有Novagen公司的pCITE-4a(+)的IRES元件作为模板 (IRES正向引物二 5'-TCCGGTTATTTTCCACCATATTGC-3'和IRES反向 引物=5'-TTATCATCGTGTTTTTCAAAGG-3')的扩增产物E4orf6随后克隆 到pcDNA3.1(+)-载体的多个克隆位点。对于这种目的，对E4orf6转基因 使用引物，其在可读框的5，末端产生^wHI切割位点和在3'末端产生 ￡"RI切割位点。将扩增产物用各自的限制酶消化并使其末端对于定向导 入用^W2HI和五coRI打开的载体相容。随后，将pcDNA3.1(+)中的质粒 E4orf6用五coRV线性化，加入T末端并将扩增产物克隆到IRES元件中。 检查IRES元件的正确定向后，载体用于进一步克隆。将E4orf6-IRES盒克隆到以前产生的用WM线性化、平末端化并随后 用力al切割的质粒CMV-ElB55k 3，UTR-polyA-pShuttle (Clontech)中导致 两个转基因与IRES元件的连接。将pcDNA3.1 (+)中的E4orf6-IRES用M)d 线性化，平末端化，并用A^el进一步消化。通过连接E4orf6-IRES插入片 段与CMV-ElB55k 3，UTR-polyA-pShuttle (Clontech)，在pShuttle (Clontech) 中产生了 XVIR-3'UTR。使用的腺病毒穿梭载体的产生作为现在用于Microbix公司的腺病毒产生系统的穿梭载体pAElsplA 不含有CMV启动子也不含有牛生长激素多聚腺苷酸化信号，将这些元件 克隆到pAElsplA中。为此目的，将pAElsplA用C/fll线性化，平末端化， 并用五coRI切割。用Mfel从pShuttle (Clontech)线性化元件CMV-MCS (多 克隆位点)-poly-A，平末端化，并用&oRI进一步切割。随后，用Pmel 将盒(Clontech的Xvir-3，UTRpShuttle)克隆到已经用Pmel切割并随后去磷 酸化的CMV-MCS-poly-A pAElsplA载体中。克隆产物Xvir-3，UTR-pAElsplA用于病毒产生。病毒产生将Xvir-3'UTR-pAElsplA和pBHGE3 (来自Microbix，含有对应于5 型野生型腺病毒的E3区)共转移到HEK 293细胞中，其中由于两种载体的
同源序列的重组，产生了病毒Ad-Xvir-3，UTRE3。使用 AdEASY-系统 (Obiogene 公司)产生腺病毒 Ad-Xvir3，UTR-AdEASY E3使用的腺病毒穿梭载体的产生如对于当前使用的系统，载体pShuttle-AdEASY不含有CMV启动子， 也不含有牛生长激素多聚腺苷酸化信号，将这些元件克隆到 pShuttle-AdEASY中。为此目的，将质粒用￡coRI消化，用T4聚合酶和 dNTPs使得它们平末端化，将骨架去磷酸化并再次连接产生的两种消化产 物。这样消除了 &oRI的限制酶识别位点。从而将所得的质粒称作 pShuttle(-五coRI)-AdEASY。随后，来自Clontech的pShuttle的盒CMV-MCS-polyA用M/el和 &0RI切割，平末端化并克隆到为了这种目的用al线性化并平末端化并 去磷酸的载体pShuttle (-五coRI)-AdEASY中。从而产生质粒 CMV-MCS-polyA-pShuttle-AdEASY 。 使用 Mwl禾B EcoRI 将盒 E40rf6-IRES-ElB55k-3'UTR克隆到该质粒中。这样，用pShuttle AdEASY 产生了质粒Xvir-3'UTR。将其用fiwl1071禾n TkTroI线性化并通过电穿孔 将其与拯救质粒pAdEASY —起导入BJ5183 (EC)细菌中。通过同源重组， 产生了腺病毒质粒Ad-Xvir-3'UTR-pAdEASY，其在HEK293细胞中转染 后导致病毒产生。将wtE3区导入。AdEASY中由于E3区在质粒pAdEASY中实质缺失，所以用^el禾B Pad从质 粒pAdEASY将E3区克隆到质粒CMV-MCS-polyA pShuttle (AdEASY)中 用于重建并从而产生质粒E3E4-pShuttle-AdEASY。通过用M/el限制性消化和再连接，缺失了两个iV&I限制性位点中的 一个，对于来自质粒的多个克隆位点也是这样。通过该步骤，产生了质粒 E3E4-pShuttle(陽敲I)-AdEASY。随后，通过&el禾B A^/el从5型野生型腺病毒切割4007 bp wtE3-区
片段并克隆到通过SpeI和Ndel打开的E3E4-pShuttle (-7VtM)-AdEASY 中。将这样产生的载体称作wtE3E4-pShuttle (iV&I)-AdEASY。随后，用&el禾B i^cI从E3E4-pShuttle(-MM)-AdEASY切割野生型 E3E4区域并克隆到pAdEASY，并用Spel和户ac切割，其中在质粒 pAdEASY中重建E3区(pAdEASY-E3)。当用pShuttle AdEASY和 pAdEASY-E3中的质粒Xvir-3，UTR转化BJ5183 (EC)细菌时，通过同源重 组产生了 XVir-3，UTR-pAdEASY-E3。对所有提及的系统操作E4为了为治疗性的转基因提供空间和为了避免不希望的同源重组，可以 特异缺失质粒E3E4-pShuttle (-M/el)-AdEASY中的E4区。为了这种目的， 通过用Pstl切割并再连接，将E4orf6区縮短约0.6 kB，优选629或634 bp。 这可以如图17中所述，关于Xvir03/01进行。本领域技术人员也可以在用 于产生重组腺病毒的不同系统中进行各自的缺失。尤其(也可以应用于其他系统)在Ad-Xvir 3'UTR-AdEASY E3中克 隆RGD-基序为了增强感染性，按照Dmitriev等1998 (An Adenovirus Vector with Genetically Modified Fibers Demonstrates Expanded Tropism via Utilization of a Coxsackievirus and Adenovirus Receptor-Independent Cell Entry Mechanism)的方法修饰纤维节结构域的HI环将各自的区域用引物 RGD-Hpa fw (5'-GAGgttaacCTAAGCACTGCCAAG-3'), RGD-EcoRV rev (5' -C ATAGAGTATGCAGATATCGTTAGTGTTAC AGGTTTAGTTTTG-3') 禾口 RGD-EcoRV fW(5' -GTAAC ACTAACGATATCTGC ATACTCTATGTCATTTTC ATGG-3') and RGD-Bfr rev (5'-CAGCGACATGAActtaagTGAGCTGC-3')扩增并因此产生 EcoRV限制性位点。在该限制性位点中，克隆配对的寡核苷酸，其编码TTCCTGTGTACCGTTTAGTGTG-3')。从而，RGD基序存在于纤维节结构 域的HI环中。上述载体原则上适于用于根据本发明使用的本文描述的其他病毒。具 体地，前述载体适于在YB-1核阳性细胞以及在YB-1去调节的细胞，即 与正常细胞和非肿瘤细胞相比过表达的细胞中复制和引起裂解。该载体的 使用尤其应用于公开的那些疾病和患者组或者患者群体，它们与本文描述 的将根据本发明使用的其他腺病毒和本文公开的本发明的其他腺病毒相实施例12:腺病毒载体Xvir03/01的结构设计如从图17中可以获得，Xvir03/01是Xvir03的进一步的发展。治疗基 因(例如本文所述的基因)和转基因可以克隆到E3区域。另外，将缺失 引入E4区域，以便避免与来自Xvir03表达盒的E4or伤发生同源重组。这 使较大的转基因可以克隆到该构建体中。缺失的E3区域包含用于引入盒 的SacI,NdeI和NheI限制位点，例如其中可以克隆治疗的转基因。然而， E3还可以保持完整并且将治疗基因克隆到E4区域中。这样，提供了腺病 毒死亡蛋白的表达。制备质粒，它用于将治疗基因克隆到E3区域中以及用于在E4区域中 产生缺失Clontech的pAdenoX-Plasmid在野生型腺病毒中缺乏的3， ITR区之后 具有S化I的限制位点。使用Spel(位点23644)和Sful从pAdenoX (Clontech) 中获得E3-E4 区域，并转移至pcDNA3.1(+) (Invitrogen)= pcDNA3.1-E3A27865-30995-E4。通过Pstl去除E40RF6的大部分，即 33241-33875= pcDNA3.1-E3A27865-30995, E4A33241-33875。为了进一步 开发 Xvir03 , 用 Sful禾Q Spel 从 pcDNA3.1-E3A27865-30995， E4A33241-33875中将缺失的E3/E4区域克隆到质粒pAdenoX中二pAdenoX E3A27865-30995, E4A33241-33875。如关于 Xvir03 所述，随后用 I-Ceu I禾n PI-SceI 从
ElB55k-IRES-E4orf6-pShuttle中将表达盒连同CMV启动子和牛生长激素 (BGH)-PoIyA克隆到pAdenoX E3A27865-30995， E4A33241-33875中，其 称为AdcmvElB/IRES/E4orf6-AE4。随后，按照制造商的使用说明(Clontech)制备腺病毒。本发明包括并且本领域技术人员参考本内容可行的是，其他系统可以 用于生产根据本发明的腺病毒，尤其重组病毒，如QBIOGENE和Nicrobix公司的系统。上述载体原则上与本文所述根据本发明使用的其它病毒一样有用。特 别是上述载体适合在细胞中复制和导致裂解，所述细胞为YB-1核-阳性的 细胞以及其中YB-1被去调节(即与正常细胞和非肿瘤细胞相比过量表达) 的细胞。该载体还可以用于那些疾病和患者组和患者集体，其关于根据本 发明使用的其它腺病毒和根据本发明的腺病毒在本文中公开。实施例13: Xvir 03在257 RDB和181 RDB细胞中的肿瘤消解作用在具有6个孔的平板(6孔平板)的每孔中接种100,000个细胞(257RDB 和181RDB)。次日，如图18所示，用Ad312 (20 pfo/细胞)和Xvir03 (5 pfW 细胞)感染细胞。在500 pl无血清DMEM培养基中在37。C下感染1小时。 随后，去除感染培养基，并用2ml完全培养基(10。/。FCS/DMEM)替代。5 天后通过结晶紫染色完成分析。结果在图18A和18B中表示。如可以从图18A和18B中获得，在感染Ad312和Xvir03以后，仅在 Xvir03的情形中，在核内含有YB-1的多药抗性的细胞显示了裂解，如细 胞的结晶紫染色所示。与其相关，首先去除培养基。随后，用结晶紫(50% ETOH， 3 %甲醛，5 %乙酸，1 %结晶紫)覆盖细胞，在室温下孵育5-10分钟。 随后，用水充分漂洗6孔平板并在室温下干燥。本发明的发明人已知ElA-缺失的病毒(例如Ad312)，然而其在本发明 的意义上不是反式激活腺病毒，可能在较高MOI下非常有效地复制 (NevinsJ.R., Cell 26， 213-220, 1981)，但是不能在临床应用中实现。该现象 在文献中称为"类E1A活性"。本文所用的腺病毒Ad312是ElA-缺失的病 毒。在所用效价(20 pfu/细胞)下，该效价仍高于临床理想效价，早期腺病 毒基因如ElB55k和E4or伤不表达或只能极少量地表达(Nevins J. R., Cell26,213-220,1981)。如本文已经描述，这些基因和蛋白在病毒复制中起重 要作用。与其相反，这些基因和蛋白分别由腺病毒Xvir03表达(图16)。 如从图18A和18B中可以获得，在伴随所需的较低的感染效价下(表示 为pfo/细胞)基因ElB55k和E4orf6的表达将导致有效的病毒复制和细胞 裂解。这证实了构成本发明基础的发现，即E4orf6和E1B-55K (和缺少 E1A)的表达结合YB-1的核定位能够诱导非常有效的腺病毒复制。其所 需仅1-5 pfli/细胞的效价现在能临床应用。这证实了构成本发明基础的发现，即为了使根据本发明使用的病毒裂 解感染的细胞，YB-1在核内的存在，特别是独立于细胞周期的存在，是 必需的。实施例14:加入伊立替康后腺病毒在细胞中的复制为了确定伊立替康对腺病毒复制的影响，在10cn^培养皿中平板接种 106个U373肿瘤细胞。在第一次反应中，24小时后加入5pM伊立替康。 再过24小时后，将细胞用10 pfti/细胞d1520感染。不用伊立替康温育3 天后，根据实施例10中描述的步骤分离DNA。在平行反应中，将制备的U373细胞不与伊立替康预培养。不用伊立 替康培养细胞48小时后，将它们用10 pfo/细胞dl520感染，随后不用伊 立替康另外培养3天。如上述分离DNA。随后，将2 ^ DNA用限制酶Kpn I消化并进行DNA印迹分析。通过 PCR产生的腺病毒基因组的部分(位置22734-24235)用作探针。结果在图19中描绘。图19显示用伊立替康温育后，与不进行伊立替 康温育的未处理的对照相比(泳道l)，用伊立替康处理后，U373细胞中 腺病毒复制显著增加(泳道2)。这表明在伊立替康的影响下，腺病毒复 制增加。实施例15:施用曲古抑菌素A后腺病毒在细胞中的复制 为了测试曲古抑菌素A对腺病毒复制的影响，在10 cn^培养皿中接 种106个U373肿瘤细胞。24小时后，加入0.25、 0.5禾n 0.75 曲古抑 菌素A。另外24小时后，用10pfW细胞dl520感染细胞。 在没有曲古抑菌素的培养基中培养3天后，分离DNA。随后，用限制酶Kpn I消化2昭DNA并进行DNA印迹分析。通过PCR产生的腺病 毒基因组的部分(位置22734-24235)用作探针。结果在图20中描绘。图20显示了用增加浓度的曲古抑菌素A温育后， 与不迸行曲古抑菌素A温育的未处理的对照(泳道1)相比，U373细胞 中的病毒复制(泳道2、 3和4)显著增加。这意味着，在曲古抑菌素A 的影响下，病毒复制增加。实施例16:响应曲古抑菌素A的加入，柯萨奇腺病毒受体(CAR) 的表达对U373细胞的影响将200,000个U373细胞接种在6孔板中。24小时后，将细胞用1 曲古抑菌素培养24小时。另外24小时后，分离细胞。随后，根据标准方 案，使用Facs分析和来自Upstate公司的一级抗体抗一CAR克隆RmcB， 和作为二级抗体的兔抗小鼠FITC (DAKO公司)，迸行CAR表达的分析。结果在图21中描绘。不用曲古抑菌素处理，11.3M的细胞是CAR阳 性的，其中用l(iM曲古抑菌素温育细胞后，56.2。/。的细胞是CAR阳性的。 数字是用于试验中的总体细胞的百分比。从图21 ，可以得出在组蛋白脱酰基酶抑制剂曲古抑菌素A的影响下， 腺病毒的结合的重要因子CAR分别在较高水平表达并且更可以得到，其 增加了如此处理细胞的转染功效。实施例17:伊立替康和曲古抑菌素A组合处理细胞后，通过腺病毒 对U373细胞的溶瘤作用将200,000个U373细胞接种在6孔板中。24小时后，向培养基中加 入2 伊立替康或者仅1 曲古抑菌素A或者1 (iM伊立替康+ 0.5 [iM 曲古抑菌素。培养24小时后，用10、 20和30pfli/celldl520感染细胞。3 一5天后，使用结晶紫染色进行分析。以一式两份进行测定。结果在图22中描绘。在小图1中表示的6个平板显示了完整细胞层， 其不受伊立替康和曲古抑菌素A的组合温育的影响，如通过结晶紫染色所 示。小图1的下两个孔显示了分别用10禾口 20pfU/细胞dl520感染后的细
胞层。在此类条件下，由于不存在dl520的复制，也没有细胞的裂解。从而，显示10或20pfiV细胞的d1520和仅1 伊立替康+0.5jiM曲古抑菌素A单独都不适于诱导细胞裂解。图22中描绘了另外的6孔板2、 3和4，在本文中分别称作小图2、 3 和4，它们基本上根据该方案处理。如以前描述的将各孔接种U373细胞 和在其中培养细胞。将孔一式两份接种IO、 20或30pfb/细胞d1520，其中 三个6孔板之间的差异在于使用的细胞生长抑制剂的种类。在小图2中， 向小图2加入2 ^M伊立替康，在小图3中加入lpM曲古抑菌素A，在 小图4中加入1 pM伊立替康并向各平板0.5 曲古抑菌素A。具有2pM伊立替康的在6孔板2(小图2)中，用30pfo/细胞d1520 裂解细胞。在具有l)aM曲古抑菌素A的6孔板3 (小图3)中，以20和 30pfu/细胞dl520裂解细胞。在具有lpM伊立替康+0.5pM曲古抑菌素 A的6孔板4 (小图4)中，与其相反，细胞已经以10pfU/细胞dl 520裂 解。该试验(结果在图19到23中描绘)显示由伊立替康+曲古抑菌素A + d1520组成的组合诱导比任一种单独化合物更有效的肿瘤细胞的细胞裂 解。 一方面，来自曲古抑菌素A的结果增加了 CAR表达从而显著提高的 细胞的感染力。另一方面，伊立替康将YB-1转移到细胞核中并从而诱导 提高的腺病毒复制。此外，细胞YB-l在用d1520感染后辅助腺病毒复制 并不再用于DNA修复过程。取决于观点，这一方面导致d1520的提高的 功效，另一方面导致细胞生长抑制剂的增加的功效。实施例18:腺病毒Ad312的E2基因表达的RNA印迹分析在每种情况下，将100万A549和U20S细胞接种到10 cm Petri盘中。 次日，用Ad312(50pfu/细胞)和Adwt(作为对照，5pfW细胞)感染细胞。使 用的Ad312的高病毒效价导致肿瘤细胞中的独立于E1的复制。在1-2 ml 无血清的DMEM培养基中在37。C感染1小时。随后，去除感染培养基， 替换为10ml完全培养基(10。/。FCS/DMEM)。 3天后，分离RNA。随后， 在光度计中在260 nm检测分离的RNA的浓度。然后，在0.8%甲醛琼脂 糖凝胶中电泳分离RNA样品。随后，将RNA印迹在尼龙膜上(根据Schleicher & Schuell的系统进行)。将印迹在膜上的RNA对"早期探针"E2 和"晚期探针"E2杂交。1501bp的"晚期探针"能特异性地结合E2晚期启 动子。之前通过PCR (引物5，- GTC GGA GAT CAG ATC CGC GT (SEQ. ID. NO. 4)， 5,- GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT (SEQ. ID. NO. 5))制备探 针，并使用32P放射性地标记。相反地，早期探针能结合在E2-早期启动 子和E2-晚期启动子之间(位置226791-227002)，且也是借助于PCR (引物: 5，- AGCTGATCTTCGCTTTTG (SEQ. ID. NO. 6)， 5，-GGATAGCAAGACTCTGAC AAAG (SEQ. ID. NO. 7))产生。随后，洗涤膜 并曝光于胶片。结果在图25中表示。早期和晚期探针都提供了野生型腺病毒对照感 染的特异性信号，而感染了 Ad312的肿瘤细胞仅仅提供了当使用晚期探针 时的特异性信号。这证实了构成本发明基础的发现，即E4orf6和E1B55K 的表达以及E1A的缺失分别将过量表达的和去调节的YB-1转运至核中， 并由此诱导作为有效的腺病毒复制的先决条件的E2基因的表达。实施例19:腺病毒AdS 24的E2基因表达的RNA印迹分析在每种情况下，将100万U2OS细胞接种到10cmPetri盘中。次日， 用腺病毒5 24 (Ad524) (10 pfu/细胞)和野生型腺病毒(Adwt)(作为对照，10 pfu/细胞)感染细胞。使用的重组腺病毒AdS24 (Fueyo, J.等，Oncogene 19, 2-12， 2000)具有在E1A蛋白的CR2区的特异性缺失，因而仅能在Rb-阴 性的肿瘤中复制。另外，该病毒能表达比得上野生型腺病毒的基因ElB55k 和E4orf6。在1-2 ml无血清的DMEM培养基中在37。C感染1小时。随后， 去除感染培养基，替换为10 ml完全培养基(10 % FCS/DMEM)。 12和24 小时后，分离RNA。随后，在光度计中在260 nm检测分离的RNA的浓 度。然后，在0.8。/。甲醛琼脂糖凝胶中电泳分离RNA样品。随后，将RNA 印迹在尼龙膜上(根据Schleicher & Schudl的系统进行)。将印迹在膜上的 RNA对"早期探针"和"晚期探针"杂交。包含1501 bp的"晚期探针"能特异 性地结合E2晚期启动子。之前通过PCR(引物5，-GTCGGAGATCAG ATC CGC GT (SEQ. ID. NO. 4)， 5，- GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT (SEQ. ID. NO. 5))制备探针，并使用"P放射性地标记。但是，早期探针
能结合在E2-早期启动子和E2-晚期启动子之间，且也是借助于PCR (引 物5，- AGCTGATCTTCGCTTTTG (SEQ. ID. NO. 6)， 5，-GGATAGCAAGACTCTGACAAAG (SEQ. ID. NO. 7))产生。随后，洗涤膜 并曝光于胶片。结果在图26中表示。12小时后，仅有晚期探针提供了特异性信号。24小时后，仅有早期 探针在感染了 AdS24的细胞中提供了信号。但是，与野生型腺病毒相比， 信号显著减弱。该结果还证实了构成本发明基础的发现，即E4orf6和 E1B-55K的表达分别将过表达的和去调节的YB-1转运至核中，其随后结 合到E2-晚期启动子并诱导E2基因表达。实施例20:腺病毒载体XvirPSJLl和XvirPSJL2的结构设计载体描述XvirPSJL组载体是本文中称作I组腺病毒的病毒的实施方 案，并分别通过载体和腺病毒XvirPSJLl和XvirPSJL2示例，它们不但能 象腺病毒dl520那样在YB-1核-阳性的细胞、特别是肿瘤细胞中复制，而 且能在YB-1分别是过表达的和去调节的肿瘤细胞中复制。尽管病毒基因 ElB55k和E4orf6仅仅分别在E1B启动子和E4启动子影响下在d1520感 染的YB-1核-阳性的细胞中表达，XvirPSJL中的ElB55k和E4or伤借助于 巨细胞病毒(cmw)启动子进行表达。但是，不只是cmw启动子，还可以 使用其它的启动子、特别是肿瘤特异性的、组织特异性的和器官特异性的 启动子和天然E1A启动子，即特别是如在野生型腺病毒(特别是Ad5)中 存在的E1A启动子。由于ElB55k和E4orf6的表达，过表达的YB-1和去 调节的YB-1被分别转送到核内，并启动腺病毒的复制。如本文所述的 XvirPSJL组的腺病毒载体从而结合在同一个载体中的腺病毒载体d1520、 Xvir03和AdYB-l的各种元件和因此它们的功能。与载体d1520类似， XvirPSJL病毒含有ElA12S基因。该基因和相应的基因产物分别负责诱导 感染的细胞的S期，并促进病毒的复制、化疗和辐照的作用。象Xvir03 一样，XvirPSJL病毒含有表达盒CMV-E4orf6/IRES/ElB55k，它为有效的 复制所需，并间接地或直接地将去调节的YB-1转送到核中，该核优选地 包含在肿瘤细胞中。因而，复制仅能在YB-1是过表达的或去调节的细胞、 特别是肿瘤细胞中。另外，用ElB55k/E4orf6复合体降解P53。编码人转 录因子YB-1的序列取自病毒AdYB-l。内源的，即已经存在细胞中的YB-1 扩大了病毒的复制。E1A12S和YB-1的表达由依赖于YB-1的腺病毒E2-晚期启动子控制。还相关地，可以在实施方案中使用特异性的启动子，特 别是肿瘤特异性的、组织特异性的或器官特异性的启动子。这些病毒的另 一个特征是缺失E4区。载体含有限制位点，在腺病毒载体XvirPSJLl和 XvirPSJL2的情况下，通过这些位点可以表达说明书中公开的各种转基因， 例如核酶、反义分子、siRNA、程序性细胞死亡诱导基因、细胞因子和前 药基因。它们的表达还可以通过说明书中公开的肿瘤特异性的、组织特异 性的或器官特异性的启动子控制。表达盒的定位不是固定的，特别是不关 于或在E1、 E3和E4区内，但是可以以任何方式排列。载体的复制独立于 肿瘤细胞的p53或Rb状况。重组腺病毒XvirPSJLl和XvirPSJL2的结构设计如图27和28所示。根据Clontech公司的系统产生载体XvirPSJL用作本文的原材料的来自Clontech/BD Biosciences公司的pAdenoX质 粒包含腺病毒Ad5的基因组核酸并且在3' ITR区后具有SfUI限制性位点， 3， ITR区在野生型腺病毒中缺失。通过来自pAdenoX (Clontech)的Spel (位 置23644)禾口 Sfbl将E3-E4区转移到pcDNA3.1(+) (Invitrogen)中并称作 pcDNA3.1-E3A27865-30995-E4。通过Pstl除去E40RF6的大部分，即碱基 33241-33875 。 得到的片S称作 pcDNA3,l-E3A27865-30995, E4A33241-33875。用Sacl禾n Nhel从pGL3-EGFP (Holm等，JBC 2002, 277, 10427-10434)切割E2晚期启动子并克隆到pcDNA3.1-E3A27865-30995， E4A33241-33875中。为此，在碱基A27593-31509的区域中进一步缺失E3 区域。得至U的片段称作 E2-late-pcDNA3.1-E3A27593-31509, E4A33241-33875。通过RT-PCR产生E1A-243AA产物的cDNA，分离并检查序列，并使 用BamHI禾卩EcoRI克隆至U pcDNA3.1(+)载体(Irwitrogen)中。将
ElA-12S-pcDNA3.1+用Nhel禾口 BamHI线性化，通过T4聚合酶平末端化 并通过Taq聚合酶和dTTPs提供T突出端。将IRES元件作为PCR产物(模 板=pCITE, Novagen)克隆到ElA-12S-pcDNA 3.1(+)载体中(TA克隆策 略)。
从载体pHVad2c (Holm等，JBC 2002， 277, 10427-10434)分离 YB-l-五coRI片段并将其平末端化。将载体pShuttle (可从BD Biosciences 购买)用Xbal线性化，平末端化并去磷酸，并用以前产生的YB-1编码核 酸连接。将得到的载体称作YB-l-pShuttle。克隆到pShuttle载体提供了具 有框内STOP密码子的YB-1片段编码核酸。通过A^el和从 YB-l-pShuttle克隆YB-1编码核酸并克隆到pcDNA3.1 (+)中的载体 IRES-E1A-12S中。得到的片段称作YB-1 (五coRHcoRI，具有终止密码 子)-IRES-E 1 A-12S-pcDNA3.1 (+)。
随后，将盒YB-1-IRES-E1A12S用Pmel切除并克隆到A7 el线性化的、 平末端化和去磷酸化的载体E21ate-pcDNA3.1 E3A27593-31509， E4A33241-33875中。从而，第二个盒在E3区的缺失的区域中。
通过S/mI和SpeI，将包含核酸构建体E21ate-YB-1-IRES-E1A12S的 转基因盒与剩余的腺病毒序列E3A27593-31509， E4A33241-33875 —起克 隆 至剩余Clontech 的 载 体pAdenoX 中(=AdenoX/E21ate-YB-l-IRJES-ElA12S/E3A27593-31509， E4A33241-33875)。
通过I-Ceul禾P PI-SceI从上面关于Xvir03描述的pShuttle切除盒 CMV-ElB55k/IRES/E4orf6 并 插 入 至U 载 体 AdenoX/E21ate-YB-l-IRES-ElA12S/E3A27593-31509, E4A33241-33875中。
然后，将载体用PacI线性化，转染到293细胞中，并根据生产商的 使用说明分别分离重组腺病毒XvirPSJL 1和XvhPSJL2，在图中没有指 示转基因。
本发明包括并且本领域技术人员参考本内容可行的是，可以使用其他 其他系统，如QBIOGENE禾卩MICROBIX公司的系统用来产生根据本发 明的腺病毒，优选重组腺病毒，尤其单独和/或一起分别含有盒 E4or伤-IRES-ElB55k和ElA12S-IRES-YB-1的重组腺病毒。此外，各转 基因可以在各盒内交换，尤其在各自的盒内交换。此外，盒E1A12S-IRES-YB-1可以仅由E1A12S组成和/或E1A12S可以通过IRES 连接到其他相关的基因。用AdEASY系统(Microbix公司)产生在缺失的E3区中具有E1A12S 的腺病毒AdPSJL-E2-晚期启动子12S-AdEASYPSJL 12S的克隆首先，将E2晚期启动子克隆到pGL3-增强子质粒(pGL3-E2-late)的 /^2^11和5g/II切割位点中作为成对寡核苷酸(上游引物5，-TCTCGTGGGCGTGGTAGTCCTCAGGTACAAAT-3'和下游引物TACGAAGACCAATCCCGCCCGCCAAATGCGGAGC-3')。之后，使用iV"I和1"I切除萤光素酶基因，平末端化并加入T末 端。将通过引物E1A 12S正向引物5'-ATGGCCGCCAGTCTTTTG-3'和 E1A 12S反向引物5'-TTATGGCCTGGGGCGTTTAC-3'扩增的转基因 E1A 12S通过TA克隆导入所打开的位点中。使用尸vwl禾P C/"I切除该盒，平末端化并克隆到E3E4-pShuttle (-AWeI)-AdEASY的E3区域中平末端化并脱磷酸的满el-切割位点中。从 而该盒含有E2晚期启动子、可读框Ela-12S和SV-40晚期多聚腺苷酸化 信号。得到的构建体为E2-late-Ela-12S-E3E4-pShuttle(-MM)-AdEASY。然后，使用^el禾Q从E2-late-Ela 12S-E3E4-pShuttle (-A^el)-AdEAS切除E2-late-Ela 12S-E3E4并克隆到5^1禾B Pacl切割的 pAdEASY中。所得的构建体称作E2-late-Ela 12S-E3E4-pAdEASY。当用pShutte AdEASY和E2-late-Ela 12S-E3E4-pAdEASY中的质粒 Xvir-3，UTR转化BJ5183 (EC)细菌时，通过同源重组产生 AdPSJL-12S-AdEASY。使用AdEASY系统(Microbix公司〗产生在缺失的E3区中具有 E1A12S和YB-1的腺病毒AdPSJL-E2-晚期启动子-12S-YB-l-AdEASY 载体E40RF6-IRES-pcDNA3.1(+)的克隆随后将扩增产物Ela 12S (见上文)和IRES元件(见上文)克隆到 pcDNA3.1(+)-载体的多个克隆位点中。为此目的，通过TA克隆将Ela-12S 扩增产物导入平末端化的万"加HI-切割位点中。随后，将pcDNA3.1(+)中的 质粒Ela-12S用￡coRV线性化，加入T-末端并将扩增产物克隆到IRES元 件中。随后所得到的质粒用屈ol线性化，平末端化，并且YB-1的 五coRI-EcoRI-切割产物没有终止密码子。所产生的构建体ElA-12S-IRES-pcDNA3.1(+)用线性化并将末端 平末端化。而且，将YB-HcoRI-切割产物平末端化并导入去磷酸化的载 体ElA-12S-IRES-pcDNA3.1(+)中。使用除去盒E1A扁12S画IRES-YB-1 并克隆到用A^ol和^&"I除去萤光素酶基因和平末端化和去磷酸化的上述 质粒pGL3-E2-late中。使用尸vwl和C/al切除盒E2-late-ElA-12S-IRES-YB-l并使得末端平末 端化并克隆到E3E4-pShuttle (-iWel)-AdEASY的E3区中的平末端化和去 磷酸化的A^d-切割位点中。所得到的构建体为E2-晚期启动子 -E1 A-12S-IRES陽YB-1 -E3E4-pShuttle (-A^el)陽AdEASY。然后，将E2-晚期启动子-ElA-12S-IRES-YB-l-E3E4用和I和尸acl 从E2-晚期启动子-ElA-12S-IRES-YB-l-E3E4-pShuttle (-iWM)-AdEASY切 除并克隆到^el和户wl切割的pAdEASY中。将所得的构建体称作 E1 a-12S-IRES-YB-1 -E3E4-pAdEASY 。当用pShuttle AdEASY和Ela-12S-IRES-YB-l-E3E4-pAdEASY中的质 粒Xvir-3'UTR转化BJ5183 (EC)细菌时，通过同源重组产生 AdPS JL-12S-Yb-1 -AdEAS Y 。在E4区中克隆盒E2-晚期启动子-ElA-12S禾P/或E2-晚期启动子 -E1A-12S-IRES-YB-1使用Pstl分别操作和缺失E4区后，除去634 bp。可以将盒E2-晚期 启动子-ElA-12S禾卩/或E2-晚期启动子-ElA-12S-IRES-YB-l导入E4区中。备选地，E2区可以在此类条件下保持完整。 RGD-基序的克隆为了提高感染性，根据Dmitriev等1998 (An Adenovirus Vector with Genetically Modified Fibers Demonstrates Expanded Tropism via Utilization of a Coxsackievirus 禾卩 Adenovirus Receptor-Independent Cell Entry Mechanism)修饰纤维节结构域的HI环使用引物RGD-Hpa f\v (5'-GAGgttaacCTAAGCACTGCCAAG-3'), RGD-EcoRV rev(5 '-CATAGAGTATGCAGATATCGTTAGTGTTACAGGTTTAGTTTTG-3 ')， 以 及 RGD-EcoRV fSv(5 '-GTAACACTAACGATATCTGCATACTCTATGTCATTTTCATGG-3')禾口 RGD-Bfr rev (5'-CAGCGACATGAActtaagTGAGCTGC-3')扩增各自的区域 并因此产生EcoRV切割位点。将配对的寡核苷酸克隆到该切割位点中， 其编码 Arg-Gly-Asp (RGD)- 肽与 RGD oligo 1TGCCGCGGAGACTGTTTCTGCCC-3') 禾卩 RGD oligo 2 (5'-GGGCAGAAACAGAGTGTG-3')。从而在纤维节结构域的HI环中含有RGD基序。实施例21:用腺病毒dl520感染HeLa细胞每盘涂布100,000个HeLa细胞。次日，用不同效价(pfU/ml)的腺病毒 d1520感染细胞。在500 pi无血清的DMEM培养基中在37。C感染1小时。 随后，去除感染培养基，并用2 ml完全培养基(10 % FCS/DMEM)替换。 在3-5天后，使用结晶紫染色进行分析。实验结果如图23所示。腺病毒d1520在低MOI(5-10 pfW细胞)感染核 中没有YB-1的HeLa细胞时未显示出任何裂解，与此相反，d1520在MOI (感染复数)为100-200 pfu/细胞时表现出实际上完全的裂解，并且在MOI 为50 pfo/细胞时仍然表现出显著裂解。从中可以看出，dl520和类似的能 开启腺病毒基因ElB55k和E4orf6的病毒，在较高MOI时适合于直接地 或间接地将过表达的或去调节的YB-1转送到核中，并因此诱导细胞裂解。
实施例22:用于检测E2-晚期启动子活性的荧光素酶试验
已知YB-1能结合核中的腺病毒2-晚期启动子(Holm等，JBC 2002, 277: 10427-20434)，且该启动子还较好地适用于核酸的表达。腺病毒2-晚期启 动子的应用特别地由下述事实推动，即其可以由YB-1调节，其中YB-1 作为正效应物起作用，即该启动子只有在核中存在YB-1的情况下才是有 活性的。因此当核中不存在分别作为效应物和调节物的YB-1时，可以以 高度选择性的方式调节所述的腺病毒E2-晚期启动子，并因此应用于核中 存在YB-1的系统中，实际上避免在腺病毒2-晚期启动子控制下的核酸的 任何表达。E2-晚期启动子包含3 Y-盒(CCAAT)，其与E2基因的激活有关。 已经制备了不同的E2-晚期启动子构建体，并检测了它们的特异性和活性。 如下进行分析。
使用3种不同的细胞浓度，将核中含有YB-1的细胞系EPG-257RDB (上皮胃癌)、HeLa (上皮子宫颈癌)和U2OS (骨肉瘤)接种到6孔平板中。 用次日表现出70%汇合的孔进行转染。对于每个孔，将500 ng SpinMiniprep (Qiagen)纯化的在荧光素酶载体(市场上购自Promega,开始质粒pGL3-增强子)中的不同E2-晚期启动子构建体的质粒DNA加入到在1.5 ml带固 定帽的反应导管中的500 |il OptiMEM,将5 pl DOTAP加入到500 pl在另 一个带固定帽的反应导管中。合并2份溶液，并混合。在室温孵育混合物 30分钟，以形成复合体。用PBS洗涤细胞3次，用转染混合物层覆盖。 将平板在37"C孵育5小时，随后再用PBS洗涤细胞3次，并提供完全培 养基。
感染后48小时，用Promega的荧光素酶分析系统试剂盒(Cat. No. E1500)处理细胞给每个孔提供一层500 pl的裂解缓冲液，在室温10分 钟后，用lml吸管将细胞从平板孔中冲洗出，并转移到1,5 ml带固定帽 的反应导管中。随后在4°C、 14.000 rpm离心细胞裂解物15分钟。向每 50 (il上清液中加入100 pl荧光素酶底物，用TopCount (Canberra-Packard GmbH， 63303 Dreieich)微板闪烁&荧光计数器在96孔黑平板中在945 nm 波长检测。
用目录号为23227 (PIERCE， Rockford， Illinois, USA)的BCA蛋白分析
试剂盒在570 nm、在生物光度计(Biolumin TM 960)动力荧光/吸收平板读数 器中检测蛋白的分子动力学。样品的相对光信号被转换成蛋白量(RLU/ng 蛋白)。
使用下述质粒用pGL3-增强子(Promega)作为空白读值，用BamHI (2250 bp)和BsaBI (2003 bp)从该pGL3-增强子中去除增强子。借助于限制 位点Apa I和Sac I，将各种E2启动子构建体克隆迸缺失增强子的pGL3载 体的MCS中。用Bgl II和Hind III将hCMV启动子克隆进pGL3增强子中， 并作为阳性对照。该阳性对照可以评价转染效率，还用作荧光素酶活性的 参考值。对于每种细胞系，将CMV对照设定为100%，将E2启动子构建 体生成的酶活性与其关联，作出的直方图如图24所示。
提及的各构建体如下
1. 包含Y-boxI,II和m，对应于碱基25932-26179 bp(关于野生型腺 病毒序列，还参见随后提供的腺病毒E2区部分)
2. 包含Y-box II和III，对应于碱基25932-26127 bp(关于野生型腺病 毒序列，还参见随后提供的腺病毒E2区部分)
3. 包含Y-boxIII，对应于碱基25932-26004 bp(关于野生型腺病毒序 列，还参见随后提供的腺病毒E2区部分)
4. 不含有Y-盒，作为空白读数
腺病毒E2区部分(取自Virology 1992, 186， 280-285) (YB-1结合位点打印为粗体)
25561 aggaaotttatcctagagcgotcagg祖tottg咖gccacctgot跑ciacttcctagc 25621 gadtt跑cccattaagtaccgcgaa1gccctccgccgctttggggcjcaGtgctacctt 25681 ctgcagGtagco咖taccttgcGtaccactctgacataatggaa哲acgtgagcggtgac; 25741 ggtetactggagtgtoactgtcgcjtgcaacot站gcaccccgcaccgcitocctggtflgc 25柳aattogcagctgcttaacgaaagtcaaattateggtaGcttfg^ctgcagggtccctcg 25啦octgacgaaaagteegcggctecggggttgasactcactocggggG敏ggacgtcggct
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显示在图30中的结果有力地证实了，含有不同E2-晚期/Y-盒的各启 动子片段适用于在YB-1核-阳性的肿瘤细胞中表达治疗性的转基因，因而 可以用作本发明意义上的启动子。
实施例23:腺病毒表达的YB-1对颗粒释放的影响
用缺失El/E3的腺病毒载体AdYB-l和仅缺失E1A的Ad312感染人 骨肉瘤细胞(U20S)， MOI为50pfo/细胞。AdYB-l在其基因组中含有编码 细胞转录因子YB-1的序列，因而表达Y-盒结合蛋白1 (YB-1)。为了评价
(SBQ, ED. No. S)
感染后的作为"噬菌斑形成单位"(pfll)的病毒颗粒的释放，在感染后2和5 天分别分离培养基上清液或残余的细胞层。通过3个融/冻循环，释放细胞
内的颗粒。使用293细胞上的噬菌斑试验分析颗粒数目。
结果如图31所示，其中实心条表示细胞内残余的病毒颗粒，而交叉 线条表示释放出的细胞外的病毒颗粒。
图31所示的结果证实了， AdYB-l作为整体会生成比Ad312更多的 pfu，并释放出更多的颗粒。5天后，感染了 AdYB-l的细胞清楚地表现出 与感染了 Ad312的细胞相反的细胞病理效应(CPE)。
图32显示了 E2-晚期和E2早期启动子通过E2F和YB-1对腺病毒的 E2区的调节的图示。在图1中，相关的启动子E2-早期和E2-晚期启动子 分别关于被2F和YB-1的结合和活化描绘。野生型E1A蛋白干扰E2F与 成视网膜母细胞瘤蛋白Rb的结合。从而释放的E2F结合E2早期启动子 并从而诱导腺病毒复制。8 - 12 h后，发生所谓的向E2-晚期启动子的转变。 这仅当YB-1从细胞质转移到细胞核中时才可能。细胞核定位后，YB-1通 过结合E2-晚期启动子激活E2基因表达。
E2F/RB的结合机理和E1A介导的E2F释放与本发明潜在的机理根本 不同。如现有技术中认为的E2F从Rb蛋白的释放不是重要的，虽说不上 不是腺病毒复制的关键过程，但是人转录因子YB-1的核定位是关键因素。 该转录因子仅在较大部分的细胞周期内仅存在于正常细胞的细胞质中。用 腺病毒感染后，它将被引导到细胞核中处于不同条件下或者已经存在于特 定细胞系统的细胞核中，所述特定细胞系统为诸如不同的肿瘤疾病，如包 括但不限于乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、 小细胞肺癌和结肠直肠癌。
实施例24:构建表达不同蛋白IX的腺病毒
从如图33中描绘的野生型腺病毒的病毒核酸的设计开始，实现了如 本文公开的多种设计原理用于在以依赖于YB-1的方式复制的腺病毒中表 达蛋白IX，并且在图34， 35, 36和37中描绘。所有设计的共同之处是它们 为ElA13S-负型的和ElA12S-负型的，即它们分别不受天然存在的和野生 型中存在的E1A启动子的控制。
关于如图34中描绘的腺病毒Xvir05/启动子，该启动子还是E1B19K-负型和蛋白IX-负型的，即蛋白IX不包含在如野生型中存在的调节背景中 并且蛋白IX不表达。相反，表达受到E2-晚期启动子的控制。已经将蛋白 IX克隆到E3区中，然而，其原则上也可以克隆到E4区中。E2A，E2B,E4 和MLP的基因仍然存在并且也可以表达。由E4orf6和E1B55K组成的转 运蛋白由盒E4orf6-IRES-ElB55K形成，其处于CMV启动子的控制下。 已经将各自的盒克隆到E1区中，然而其也可以克隆到其他区，如E3和 E4区中。
在如图35中描绘的腺病毒Xvir05/ElA12S中，腺病毒额外为E1B19K-负型和蛋白IX-负型的，即蛋白IX不包含在如野生型中的调节背景中并且 蛋白IX不表达。相反表达由受到E2-晚期启动子控制的E1A12S引起，E2-晚期启动子导致存在于编码E1B55K的区域中蛋白质IX的可读框激活。 将蛋白E1A12S克隆到E3区，然而原则上也可以克隆到E4区中。E2A， E2B， E4和MLP的基因仍然存在并且也可以表达。由E4orf6和E1B55K组成的 转运蛋白由盒E4orf6-IRES-ElB55K形成，其处于CMV启动子的控制下。 已经将各自的盒克隆到El区中，然而其也可以克隆到不同区，如E3或 E4区中。
在如图36中描绘的腺病毒Xvir 05/E1B19K中，腺病毒额外为E1B19K-负型和蛋白IX-负型的，即蛋白IX不存在于如野生型中的调节背景中。相 反，表达由受到CMV启动子影响的蛋白E1B19K的控制，并且允许包含 在E1B55K读框中的蛋白IX的读框表达。E2A, E2B, E3, E4和MLP的基 因仍然存在并且也可以表达。由E4orf6和E1B55K组成的转运蛋白由盒 E4orf6-RSV启动子E1B区形成，其处于CMV启动子的控制下。已经将 各自的盒克隆到E1区中，然而其也可以克隆到不同区，如E3或E4区中。
在如图37中描绘的腺病毒Xvir05/E3-IX中，腺病毒额外为E1B19K-负型和蛋白IX-负型的，即蛋白E1B19K不存在于如野生型腺病毒中存在 的调节背景中并且蛋白IX不表达。然而，表达受到天然E3启动子的控制。 E2A， E2B, E4和MLP的基因仍然存在并且也可以表达。由E4orf6和 E1B55K组成的转运蛋白由盒E4orf6-IRES-ElB55K形成，其处于CMV启 动子的控制下。已经将各自的盒克隆到E1区中，然而其也可以克隆到不 同区，如E3或E4区中。图38—41代表根据本发明的腺病毒的其他实施方案。 图38中描绘的病毒是如图36中描绘的腺病毒Xvir 05/E1B19K的进 一步发展。除了 Xvir05/E1B19K外，该病毒还显示出处于E2-晚期启动子 控制下的盒，其分别包含E1A12S和YB-1和其编码核酸，其中两个读框 通过IRES分离。在一个实施方案中，可以设想编码YB-1的核酸不包含 在盒中。病毒表达的YB-1的核酸导致在具有去调节的YB-1的细胞中甚 至更显著的复制。图40中描绘的腺病毒是图35中描绘的腺病毒的进一步发展，其中处 于E2-晚期启动子控制下的盒分别包含E1A12S和YB-1和其编码核酸，并 且克隆到E4区中，并将几个转基因克隆到E3区中处于E3启动子的控制 下，所述转基因如程序性细胞死亡诱导基因、前体药物基因、siRNA、肿 瘤抑制基因或者细胞因子。备选地，可以将本文公开的多种转基因克隆到 该区域中。图41中描绘的根据本发明的腺病毒最后是图40中描绘的腺病毒的进 一步发展，其中与其相关，己经通过克隆引入了 RGD基序，其对于病毒 的定向是有益的。它存在于腺病毒基因组中在纤维蛋白中约32576-32685 位的范围内。该精确定位的改变由如下事实引起野生型腺病毒的序列分 别在多种数据库和数据库条目中不同并且具有不同的长度。根据本发明和在图39中描绘的腺病毒是基于图36中给出的腺病毒。 然而，与之相比，该腺病毒不包含由E4orf6和ElB55K组成的盒，而是它 们都受到不同启动子，即CMV启动子和RSV启动子的控制。在E1区中 进行克隆。此外，该腺病毒除了包含编码处于E2-晚期启动子控制下的 E1A12S的核酸外，还包含编码蛋白IX的核酸，其通过IRES以一个编码 E1A12S的核酸分离。而且该盒原则上还可以缺少编码蛋白IX的核酸。一 个可能的实施方案可以是将该盒克隆到E4区中。最后，该病毒仍然可以 在如关于图8中描绘的病毒所述的E3或E4区中含有转基因。在这些病毒 的另外实施方案中，含有RGD基序。实施例25:蛋白IX表达的检测
进行该实验以证实蛋白IX的表达对于YB-1介导的复制中有效颗粒形成的重要性。因此，已经使用了肿瘤消解性依赖YB-1复制的腺病毒Xvir 03-3'UTR，其在现有技术中描述并在图50中描绘。如下进行该实验对于每各10 cm培养皿接种106个293和257 RDB 细胞。如图IO中描绘的，第二天细胞不受感染(K)、受到野生型腺病毒 或者Xvir03的感染。感染在1.5ml无血清的DMEM培养基中在37。C进行 lh。随后，除去感染培养基并用10ml完全培养基(10MFKS/DMEM)更换。 24-48 h后，分离RNA。随后，进行RNA印迹分析。为此目的，在含有 3%甲醛的琼脂糖凝胶上电泳分离每种10 pg RNA，随后印迹到尼龙膜上 并对特异386 bp探针杂交。针对蛋白IX的P32标记的探针用作探针并使 用PCR产生。下面的引物用于PCR : 5，-TATTTGACAACGCG; 5'-TTTTAAACCGCATTGGG。野生型腺病毒基因组中探针的位置在3648 和4033位之间。使用的病毒是不表达蛋白IX的Xvir03。实验的结果在图42中描绘。如可以从图42看到的，病毒Xvir03-3'UTR与野生型腺病毒相比显示 出肿瘤细胞257RDB中表达的减少。在表达E1A和E1B以及E1B19K蛋 白的293细胞中，表达的足够的蛋白IX。实施例26:载体Xvir03-3'UTR的重组分析每个10cm培养皿接种106个293细胞。第二天，用不同的腺病毒感 染细胞，如图43所示。感染在1.5ml无血清的DMEM培养基中在37。C进 行lh。随后，除去感染培养基并用lOml完全培养基(lO % FKS/DMEM) 更换。48h后，通过碱裂解释放DNA并在柱子上纯化。随后，用Hind III 切割2pgDNA。样品在1-2%琼脂糖凝胶中电泳分离并随后印迹到尼龙 膜上。印迹到膜上的DNA与特异386 bp探针杂交。靶定蛋白IX的P32 标记的探针用作探针并使用PCR产生。下面的引物用于PCR: 5'-TATTTGACAACGCG; 5'-TTTTAAACCGCATTGGG。野生型腺病毒基 因组中探针的位置在3468和4033位之间。结果显示在293细胞中感染后， 腺病毒Xvir03不重组。切割产物的大小在图中表示。
实施例27: 257RDB细胞中的MRP表达分析每个10cm培养皿接种106个257RDB细胞。第二天，用不同的腺病 毒感染细胞，如图44所示。感染在1.5ml无血清的DMEM培养基中在37。C 进行lh。随后，除去感染培养基并用10ml完全培养基(10G/()FKS/DMEM) 更换。3-4天后分离RNA。随后，进行RNA印迹分析。为此目的，在含 有3%甲醛的琼脂糖凝胶上电泳分离每种10 )ig RNA，随后印迹到尼龙膜 上并对特异P32标记的MRP探针杂交。通过从质粒pCRII-MRP的限制 性EcoRI产生探针。结果表明腺病毒Xvir03能够抑制ABC转运蛋白MRP 的表达。实施例28: 257RDB细胞中MDR表达分析每个10cm培养皿接种106个257RDB细胞。第二天，用不同的腺病 毒感染细胞，如图45所示。感染在1.5ml无血清的DMEM培养基中在37°C 进行m。随后，除去感染培养基并用]Om完全培养基(10。/。FKS/DMEM) 更换。3-4天后分离RNA。随后，进行RNA印迹分析。为此目的，在含 有3%甲醛的琼脂糖凝胶上电泳分离每种10 pg RNA，随后印迹到尼龙膜 上并对特异P32标记的MDR探针杂交((Holm等，British J. Cancer, 1994, 70, 239-243)。结果表明腺病毒Xvir03能够抑制ABC转运蛋白MDR1的表 达。实施例29: DU145细胞中MRP表达分析每个10cm培养皿接种106个DU145细胞。第二天，用不同的腺病毒 感染细胞，如图46所示。感染在1.5ml无血清的DMEM培养基中在37°C 进行lh。随后，除去感染培养基并用10ml完全培养基(10。/oFKS/DMEM) 更换。3-4天后分离RNA。随后，进行RNA印迹分析。为此目的，在含 有3%甲醛的琼脂糖凝胶上电泳分离每种10 MgRNA，随后印迹到尼龙膜 上并对特异P32标记的MRP探针杂交。结果表明腺病毒Xvir03能够抑制 ABC转运蛋白MRP的表达。从所给出的实施例可以看出，重组腺病毒Xvir03能够抑制抗性相关基 因MRP和MDR1的表达。这通过由E4orf6和ElB55k组成的复合体完善，
该复合体募集用于腺病毒复制的人细胞转录因子YB-1。从而，该涉及基因MDR1和MRP表达的转录因子不再用于它们的表达。所以，用Xvir03 感染后，MRP和MDR1蛋白的表达降低。这导致肿瘤细胞对多种细胞生 长抑制剂如柔红霉素的敏感性(图9)。实施例30:前列腺癌细胞DU145细胞和PC3细胞中Xvir03的裂解效果的表示每个培养皿接种100,000个DU145和PC3细胞。第二天，用不同浓 度的Xvir03 (PFU/细胞)感染细胞，如图47和48中所示。感染在500 pl 无血清的DMEM培养基中在37。C进行lh。随后，除去感染培养基并用2 ml完全培养基(IO % FKS/DMEM)更换。5 - 7天后使用结晶紫染色进行评 估。为此目的，首先除去培养基。随后，将细胞用结晶紫(50。/。ETOH，3W 甲醛，5%乙酸，1%结晶紫)覆盖并在室温温育5 — 15分钟。随后，用水 充分冲洗平板并在室温干燥。实验的结果在图47和48中描绘。腺病毒Xvir03能够以约30 — 50的 MOI裂解肿瘤细胞。实施例31:通过用Xvir03感染增强细胞生长抑制剂柔红霉素的效果 现有技术中己知多种细胞生长抑制剂的加入诱导人转录因子YB-1的 核定位。还已知YB-1分别参与MDR1和MRP表达的激活和调节。如本 发明人已经发现的，通过复合体E4orf6/ElB55k对YB-1的募集导致抑制 ABC转运蛋白MRP禾BMDR1的表达。这导致细胞生长抑制剂的增强的 效果。为了进行肿瘤消解测定，如下进行将100，000个细胞(DU145)接种 在6孔板的每个孔中。第二天，用15 PFU/细胞感染细胞。24h后，加入 如所示的柔红霉素。培养15-25 h后，通过无细胞生长抑制剂的培养基替 换包括柔红霉素的培养基。再过4一6天后，用结晶紫对细胞染色。如可以从图49看出，Xvir03对肿瘤细胞的感染导致与仅柔红霉素相 比，柔红霉素与Xvir03组合对肿瘤细胞生长的更有效的抑制效果。
实施例32:重组病毒Xvir05， Xvir05/蛋白IX, Xvir05/01和Xvir05/02的结构通过表达盒CMV-E4orf6和RSV-E1B区确保载体Xvir05中病毒蛋白 E4orf6和ElB55k的表达。这导致YB-1转移到细胞核中。E1A12S基因产 物以及E2-晚期启动子控制的YB-1基因产物额外促进病毒复制。此外， 该病毒能够抑制ABC转运蛋白MRP和MDR1的表达。此夕卜，蛋白E1B19K 和蛋白IX作为盒RSV-E1B区的组分表达。载体Xvir05蛋白IX是载体的进一步发展。确保腺病毒蛋白IX的表 达，其存在于表达盒E21ate-ElA12S-IRES-蛋白IX中。该载体不包含完整 E1B区，而仅包含ElB55k的可读框。在载体Xvir05/01中，完整E1B区，即ElB19k, ElB55k和蛋白IX受 到非腺病毒的病毒启动子如RSV启动子的控制。表达盒 E21ate-E1A12S-IRES-YB-1存在于E4区域中。从而，可以将特定治疗性转 基因克隆到E3区中。E3缺失使得腺病毒ADP蛋白"腺病毒死亡蛋白"仍 然表达。此外，ElA12S和ElB19k的表达实现了蛋白IX的表达。载体Xvir05/02在纤维节的H环中额外包含RGD基序，以便增加更 好的感染率。如下进行病毒的产生拯救质粒pAdEASY (Company Qbiogene)的修饰使用穿梭载体pShuttle-AdEASY产生AE3E4穿梭载体 首先，将CMV启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号克隆到载体 pShuttle-AdEASY中。为此目的，将质粒用五coRI消化，通过用T4聚合 酶和dNTPs填充平末端化，将骨架去磷酸化并再次连接产生的两种切割产 物。通过这破坏&oRI的限制酶识别位点。得到的质粒称作 pShuttle(-Eco叫AdEAS Y 。随后，使用A^el禾Q ￡coRI从Clontech的pShuttle切割盒 CMV-MCS-polyA，平末端化并克隆到载体pShuttle (-五coRJ)-AdEASY，该 载体已经为此目的用1"I线性化、平末端化并去磷酸化。从中产生质粒
CMV-MCS-PolyA-pShuttle-AdEASY 。为了操作E3和E4区，将质粒pAdEASY的AE3E4区用和 克隆到质粒CMV-MCS-PolyA-pShuttle-AdEASY 中并产生质粒 AE3E4-pShuttle-AdEASY。通过用AWeI限制性消化和再连接，缺失了两个 A^el限制性位点中的一个和该质粒的多个克隆位点。通过该步骤，产生了 质粒AE3E4-pShuttle (-iVtM)-AdEASY。E4操作为了为潜在的治疗性转基因提供空间和为了避免不希望的同源重组， 特别缺失质粒AE3E4-pShuttle (-AWeI)-A犯ASY中的E4区。这样，通过用 尸WI切除并重新连接将E4orf6区縮短约634 bp= AE3E4AORF6-pShuttle (-7WM)-AdEASY。本领域技术人员可以在不同系统中进行各自的缺失以产生重组腺病毒。AE3E4AORF6-pShuttle (-iVtM)-AdEASYz中RGD基序的克隆 为了提高的感染性，根据Dmitriev等1998 (An Adenovirus Vector with Genetically Modified Fibers Demonstrates Expanded Tropism via Utilization of a Coxsackievirus andAdenovirus Receptor-Independent Cell Entry Mechanism)修饰纤维节结构域中的HI环各自的区域使用引物RGD-Hpa f\v (5'-GAGgttaacCTAAGCACTGCCAAG陽3')， RGD-￡coRV rev (5 '-CATAGAGTATGCAGATATCGTTAGTGTTACAGGTTTAGTTTTG-3') 以 及 RGD-￡coRV(5'-GTAACACTAACGATATCTGCATACTCTATGTCATTTTCATGG隱3')和 RGD-S戶I rev (5'-CAGCGACATGAActtaagTGAGCTGC-3')扩增，从而产生 EcoRV-切割位点。将配对的寡核苷酸克隆到该克隆位点中，其编码 Arg-Gly-Asp(RGD) 肽 RGD-OligolGCCGCGGAGACTGTTTCTGCCC-3') 禾口 RGD-01igo2TTCCTGTGTACCGTTTAGTGTG-3')。通过使用AE3E4AORF6-pShuttle
(-7WM)-AdEASY中的Hpal禾P Bfrl切割位点克隆，产生了 AE3-RGD-E4AORF6-pShuttle AdEASY。 RGD基序存在于纤维节结构域的HI环中。AE3RGD-E4AORF6-pShuttle (-AWd)-AdEASY的AE3区中E3a区的克隆为此目的，将Invitrogen公司的载体pcDNA3.1(+)用Bg/H和BawHI 切割，从而除去CMV启动子并将载体重新连接(pcDNA3.1(+)无CMV = oCMV)。使用pcDNA3.1(+) oCMV载体的这些和屈ol限制性位点， 克隆了 2709 bp片段，其用S; el (27083 bp)和Iol (29792 bp)从野生型病毒 DNA(pcDNA3.1(+) oCMV/E3a^oI)切除。备选地，可以用//p"I (30570 bp) 代替A 2oI在3'末端切割。为此目的，将载体pcDNA3.1(+) oCMV用<S^I 和EcoRV切割并在其中克隆腺病毒^el-Hpal片段(pcDNA3.1 (+) oCMV/E3a/7戸I)。另一选择是腺病毒野生型DNA的2718 bp ￡coRI片段 (27332 bp禾fl 30050 bp位)，其克隆到用EcoRI (pcDNA3.1(+) oCMV/E3a五coi /)打开的pcDNA3.1(+) oCMV中。使用von pcDNA3.1(+) oCMV/E3a，可以将E3a区克隆到载体 AE3RGD-E4AORF6-pShuttle (-iVcM)-AdEASY中为此目的用切割穿 梭载体AE3RGD-E4AORF6-pShuttle (Uel)-AdEASY，使得末端平末端化 并用^el进一步切割。将来自pcDNA3.1(+) oCMV/E3aA72oI的插入片段克 隆到该位点中。为此目的，将质粒用屈ol切割，使得末端平末端化并用 ^el进 一 步切割。将切出的片段克隆到以前切割的质粒 AE3RGD-E4AORF6隱pShuttle (-AWeI)-AdEASY中。可以以相同的方式从各自的pcDNA3.1(+) oCMV/E3a构建体切除片段— T/; al (27083 bp到30570 bp位)和￡coRI (27332 bp到30050 bp位) 并通过克隆转移。备选地，使用引物E3a正场f5^e/」5'-CTTAAGGACTAGTTTCGCGC -3'禾卩E3a ^/^7 (A72oI， vV7zel) 5'-CAAGCTAGC丁CGAGGAATCATG -3'，以5型腺病毒野生型DNA作为模板，可以通过PCR扩增E3a区。使用E3a 反向引物，产生了W&I切割位点。将扩增产物用和A^el限制性消化
并克隆到禾卩类似切割的载体AE3RGD-E4AORF6-pShuttle (-她I)-AdEASY中。对于片段备选地， 使用 引 物 E3a f 烤 ^ e" 5'-CTTAAGGACTAGTTTCGCGC-3'禾口E3a f (//; fl/, M7el)5'-CACGCTAGCAAGTTAACCATGTCTTGG-3'，使用5型腺病毒野生型 DNA作为模板，可以通过PCR扩增E3a区。使用E3a反向引物，产生vWzel 切割位点。将扩增产物用§^1和A7zel限制性消化并克隆到也通过^el和 Mzel切割的载体AE3RGD-E4AORF6-pShuttle (-iVcfel)-AdEASY中。对于EcoRI片段备选地，使用引物E3a 正(Eco/ /J5'-GAAACCGAATTCTCTTGGAAC -3'禾Q E3a ^ 五coRI) 5'-GAATTCTAGCTAGCTCAGCTATAG -3'，使用5型腺病毒野生型DNA 作为模板，可以通过PCR扩增E3a区。使用E3a反向引物，产生了 7V&I 切割位点。将扩增产物用EcoRI和Mel限制性消化并克隆到也用EcoRI 和切割的载体AE3RGD-E4AORF6-pShuttle (-A^M)-AdEASY中。通过克隆，将E3a区从pcDNA3.1(+) oCMV/E3a转移到 AE3RGD-E4AORF6-pShuttle (-AWeI)-AdEASY 中， 产生 了 E3aAE3RGD-E4AO訓-pShuttle (-滅I)-AdEASY。这样克隆的区域包含E3a区直到E3ADP的可读框(29772 bp位)，从 而E3启动子、具有多腺苷酸化信号的完整E3A区，转录起始和12.5 K， E3 6.7 K, E3 gpl9 K和E3 ADP的可读框。与5型腺病毒DNA序列相比，对于S/ eKY/wI克隆，从29796到31509 bp1713 bp)位缺失了 E3区。此外，在E3启动子和质粒pcDNA3,l(+) oCMV/E3a中ADP的可读框 之间缺失是可能的通过例如用五coRII, ^AVI， 进一步在27596bp和29355 bp位之间限制性消化，可以除去其中的6.7 K和gpl9 K的可 读框，从而为其他转基因的掺入提供1.8kb更多的空间。上面提到的E3a
扩增产物还可以通过对应的限制性消化截短并如前面描述的通过克隆转 移。处于E2晚期启动子控制下的第二个表达盒Ela 12S的克隆首先，将E2晚期启动子作为配对寡核苷酸(上游引物ATCTCGTGGGCGTGGTAGTCCTCAGGTACAAAT-3'和下游引物ACGAAGACCAATCCCGCCCGCCAAATGCGGAGC-3'克隆到Promega公 司的pGL3增强子质粒的i^'m/in和Sg/II切割位点中(pGL3-E2Late)。然后，用A^ I和lal切除萤光素酶基因，平末端化并加入T末端。 在该打开的位点通过TA克隆克隆了转基因E1A12S，该转基因通过使用 引物Ela 12S iF/^7 5'-ATGGCCGCCAGTCTTTTG-3'禾卩Ela 12S 5'-TTATGGCCTGGGGCGTTTAC-3'通过RT-PCR进行了扩增。从而，该盒含有E2晚期启动子，可读框Ela-12S和来自载体pGL3 的SV-40晚期多聚腺苷酸化信号。将该盒用Pwl和C7dt切割，平末端化，并且现在可以任选克隆到 ￡coRII， Dral， Mml缺失的E3a区中(除去E3 6.7 K和gpl9 K的可读框后，见上文)或者在克隆的E40RF6的缺失中，例如，克隆到平末端化的和去磷酸化的S/rl切割位点中。所得的构建体为E3a/E2Late-Ela-12S/AE3RGD-E4AORF6-pShuttle (-AWeI)-AdEASY 或 E3aAE3RGD-E4AORF6/E2Late-Ela-12S -pShuttle (-姬I)隱AdEASY。具有处于E2晚期启动子控制下的YB-1的第二个表达盒Ela 12S的克隆使用Novagen公司的扩增产物Ela 12S (见上文)和IRES元件 (pCITE-4a(+) 作 为 模 板， 将 IRES f 场 = 5'-TCCGGTTATTTTCCACCATATTGC-3' 禾卩 IRES 反 向 = 5'-TTATCATCGTGTTTTTCAAAGG-3')随后克隆至(j pcDNA3.1(+)载体 (Invitrogen)的多个克隆位点中。为此目的，通过TA克隆将Ela-12S扩增
产物导入平末端化的万amHI限制性位点中。随后，将pcDNA3.1(+)中的质 粒Ela-12S用EcoRV线性化，加入T末端，并克隆IRES元件的扩增产物。 所产生的构建体Ela-12S-IRES-pcDNA3.1(+)用7Vort线性化，并平末端化， 还将质粒pHVad2c CMV/S40 + Yb-l s (Stephan Bergmann)的YB-1五coRI切 割产物平末端化并导入去磷酸化的载体ElA-12S-IRES-pcDNA3.1(+)中。 备选地，在加入T末端，特别用引物IX正 5'-ATGAGCACCAACTCGTTTG-3' 禾口 IX 反 向5'-GTTTTAAACCGCATTGGGAGG-3'加入T末端后，可以向载体 Ela-12S-IRES-pcDNA3.1(+)的平末端化的Wo/I切割位点中导入蛋白IX的 可读框的PCR扩增产物。将盒E1A-12S-IRES-YB-1或E1A-12S-IRES蛋白IX用户mel切除并 克隆到用和屈d除去萤光素酶并平末端化和去磷酸化的上述质粒 pGL3-E2Late中。该盒E21ate-ElA-12S-IRES-YB-l用户vwl和C7al切害ij，平末端化并且 现在可以任选克隆到EcoRII, foAVI, 缺失的E3a区(除去E3 6.7K和gpl9K的可读框后，见上文)或者在E40RP6的缺失中，例如，在平 末端化和去磷酸化的S/H[切割位点中。得 到 的 构 建 体 为E3 a/E2Late-E 1 a-12S-IRES-YB-1 /AE3RGD-E4AORF6陽pShuttle (-AWeI)-AdEASY 或 E3aAE3RGD-E4AORF6/E2Late隱Ela-12S-IRES-YB-l -pShuttle (-A^el)-AdEASY。分 别 产 生 拯 救 质 粒E3a/E2Late-E 1 a-12S/AE3RGD-E4 AORF6-p AdEAS Y 或E3aAE3RGD-E4AORF6/E2Late-Ela-12S-pAdEASY 和E3a/E2Late-E 1 a-12S-IRES-YB陽1/AE3RGD-E4AORF6-pAdEAS Y 或 E3aAE3RGD-E4AORF6/E2Late-E 1 a-12S-IRES-YB-1 -pAdEASY使用 Spel和户acl从对应的 pShuttle 质粒E3aAE3RGD-E4AORF6-pShuttle(-7WM)-AdEASY 切 除 E3aAE3RGD-E4AORF6区与E3a或E4AORF6中的第二个表达盒E2Late-Ela-12S或E2Late-Ela-12S-IRES-YB-l并克隆到对应的打开的载 体 pAdEASY 中，从而分别产生新的拯救载体 E3 a/E2Late-E 1 a-12S/AE3RGD-E4AORF6國p AdEAS Y 或 E3aAE3RGD-E4AORF6/E2Late-Ela-12S-pAdEASY 和 E3a/E2Late-E 1 a-12S-IRES-YB- 1/AE3RGD-E4AORF6-pAdEASY, 或 E3aAE3RGD-E4AORF6/E2Late-E 1 a-12S-IRES-YB-1 —pAdEAS Y 。E3aAE3RGD-E4AORF6-pAdEASY含有E3a区、RGD基序和缺失的 E40RF6 ， 作为第二个表达盒，E2Late-Ela-12S 或 E2Late-Ela-12S-IRES-YB-l存在于E3a或E4AORF6中。该构建体是拯救 质粒，用于通过穿梭质粒向E1区中导入其他转基因。产生E1区的转基因盒 E1B区的克隆将腺病毒基因组用(1340 bp位)和MM (3925 bp位)限制性消化， 以将E1B区和2585 bp片段克隆到AdEASY的pShuttle中H和Mml 切割位点中，其从而含有完整的E1B区(pShuttle/ElB)。备 选 地， 使 用 引 物 E1B f 5'-GTGTCTAGAGAATGCAATAGTAG-3' 禾口E1B反 向 5'-GTCAAAGAATCCAATTGTGC-3'，用5型腺病毒野生型DNA作为模 板，可以扩增E1B区，可以将其用lal和限制性消化并克隆到 AdEASY的pShuttle的力al和Mw"I限制性位点中。从而，pShuttle/ElB包含E1B启动子、E1B19K， E1B55K和蛋白IX的 可读框和天然Poly-A部分。使用Wal和/7;^I除去ElB启动子，将载体 末端平末端化，并用来自Invitrogen公司的pcDNA3.1(+)的CMV启动子替 换，该启动子也用MwI和^wI切割并且其末端已经平末端化。备选地， 代替CMV启动子或者肿瘤特异性和病毒启动子，使用RSV启动子可以控 制E1B区的表达，例如，本专利中引用的启动子。制备RSV启动子用于制备盒RSV-E40RF6-polyA将Invitrogen公司的质粒pRc/RSV用羞ol, S，1和為al切割。将产生
的2810 bp和278 bp片段再次连接，从而除去Fl原点和新霉素抗性基因 (oNeo)。所产生的载体pRc/RSV (oNeo)含有一个^wzHI切割位点，仅向其中 克隆来自Dobbelstein的质粒CGN的E40RF6的可读框。备选地，使用引 物E40RF6-iE7^ 5'—ATGACTACGTCCGGCGTTCC-3'和E40RF6-rew^e 5'-CTACATGGGGGTAGAGTC-3'的PCR扩增产物可以导入载体pRc/RSV (oNeo)的加入T末端(T克隆)后的EcoRV切割位点中。备选地，代替 RSV启动子(通过用M"I和历'm/in除去)或者肿瘤特异性和病毒启动子， 用CMV启动子(用Mwl和//z'wffll从pcDNA3.1(+)得到)指导E4orf6的 表达，例如本专利中引用的启动子。将盒RSV-E40RF6-polyA (来自质粒pRC/RSV的牛生长激素多聚腺 苷酸化信号)用M，I切割，将末端平末端化并用lol进一步从该质粒得 到。随后将表达盒克隆到已经用A^I切割的载体pShuttle/ElB中，平末端 化，并随后用屈ol切割。这样，产生了载体 RS V-E40RF6-polyA/E 1 B-pShuttle-AdEAS Y 。向拯救载体中导入转基因盒将El区的载体RSV-E40RF6-polyA/ElB-pShuttle-AdEASY用1071 和AfraI线性化并通过电穿孔与拯救载体(见上文) 一起导入BJ5183 (EC) 细菌中。通过同源重组(或者对应地用其他上文引用的拯救载体)产生腺病 毒质粒RSV-E40RF6-polyA/ElB-E3a/E2Late-Ela-12S/AE3RGD-E4AORF6 -pAdEASY，导致转染后在HEK293细胞中产生病毒。本发明包括并且本领域技术人员参考本发明可行的是，根据本发明的 腺病毒，优选重组腺病毒，尤其单独和/或一起含有上述表达盒的那些腺病 毒的产生也可以使用其他系统，如Clontech/BD Biosciences公司的 pAdenoX系统或者Microbix公司的系统。前面说明书、权利要求书和附图中公开的本发明的特征可以单独或者 以任一组合与本发明的实施和其多种实施方案相关。
权利要求
1.病毒、优选腺病毒用于逆转细胞中抗性的用途。
2. 病毒、优选腺病毒用于生产用于逆转细胞中抗性的药物的用途。
3. 病毒、优选腺病毒用于恢复细胞的药物敏感性的用途。
4. 病毒、优选腺病毒用于生产用于恢复细胞的药物敏感性的药物的用途。
5. 根据权利要求1到4任一项的用途，其中细胞是动物细胞，优选哺 乳动物细胞，更优选人细胞。
6. 根据权利要求5的用途，其中细胞是肿瘤细胞。
7. 根据权利要求5或6任一项的用途，其中细胞对一种或几种药学活 性剂和/或辐射具有抗性或不敏感。
8. 根据权利要求7的用途，其中所述药学活性剂是细胞生长抑制剂。
9. 病毒、优选腺病毒用于抑制ABC转运蛋白，尤其ABC转运蛋白的 表达的用途。
10. 根据权利要求1到8的用途，其特征是所述抗性由ABC转运蛋 白介导。
11. 根据权利要求1到10的用途，其特征是所述抗性是多种抗性或 多抗性，尤其针对细胞生长抑制剂和/或辐射的多种抗性或多抗性。
12. 病毒、优选腺病毒用于生产药物的用途，所述药物用于治疗疾 病，尤其肿瘤疾病，其中涉及该疾病的细胞或者其部分是抗性的，尤其具 有ABC转运蛋白介导的抗性和/或多种抗性或多抗性，优选针对细胞生长 抑制剂和/或辐射的多种抗性或多抗性。
13. 根据权利要求12的用途，其特征是治疗包括对治疗的细胞或者 生物施用腺病毒和另一药学活性剂，或者施用腺病毒和辐射，其中腺病毒 的施用引起或者增加其他药学活性剂和/或辐射的功效。
14. 根据权利要求12的用途，其特征是治疗包括对治疗的细胞或者 生物施用腺病毒和另一药学活性剂，或者施用腺病毒和辐射，其中所述其 他药学活性剂和/或辐射的施用引起或者增加腺病毒的功效。
15. 根据权利要求9到14任一项的用途，其中ABC转运蛋白选自 包含MRP和MDR，尤其MDR-1的组。
16. 根据权利要求13的用途，其特征是在施用其他药学活性剂前， 至少在治疗开始时施用腺病毒。
17. 根据权利要求13的用途，其特征是在治疗开始时，至少在辐射 前施用腺病毒。
18. 根据权利要求16或17的用途，其特征是在施用其他药学活性 剂前或者辐射前约1到3天，优选约1到2天施用腺病毒。
19. 根据权利要求1到18任一项的用途，其特征是抗性是针对细胞 生长抑制剂和/或辐射的抗性。
20. 根据权利要求12到19任一项的用途，其特征是所述其他药学 活性剂选自包含细胞生长抑制剂的组。
21. 根据权利要求12到19任一项的用途，其特征是辐射是用于肿 瘤疾病的辐射中的辐射。
22. 根据权利要求12到21任一项的用途，其特征是辐射以剂量或 者使用辐射方案进行和/或其他药学活性剂以剂量或者根据患者的治疗方 案施用，其中患者选自包含免疫抑制患者、具有坏的或者病理性血像的患 者和具有坏的或者病理性肾脏值的患者的组。
23. 根据权利要求12到22任一项的用途，其特征是辐射以剂量或者按照辐射方案迸行和/或其他药学活性剂以剂量或者根据患有疾病的患 者的治疗方案施用，其中与这种疾病有关的细胞或者其部分不是抗性的。
24. 根据权利要求14到23任一项的用途，其特征是腺病毒的施用 产生施用其他药学活性剂或者辐射的前提条件。
25. 根据权利要求1到24任一项的用途，其特征是腺病毒作为病毒、 核酸、载体、复制系统、药物或者药物组合物存在。
26. 根据权利要求1到25任一项的用途，其特征是腺病毒以依赖 YB-1的方式复制。
27. 根据权利要求1到26任一项的用途，其特征是腺病毒是E1A负 型的。
28. 根据权利要求1到27任一项的用途，其特征是腺病毒是肿瘤消 解性腺病毒。
29. 根据权利要求1到28任一项的用途，其中病毒、优选腺病毒在 细胞核中缺少YB-1的细胞中是复制缺陷的，并且其中该病毒编码癌基因 或癌基因产物，尤其癌基因蛋白，其反式激活至少一种病毒疾病，优选腺 病毒基因，其中该基因选自包含ElB55kDa、 E4orf6、 E4orf3禾Q E3ADP的组。
30. 根据权利要求29的用途，其特征是病毒、优选腺病毒在细胞核 中具有YB-1的细胞中复制。
31. 根据权利要求29到30任一项的用途，其特征是病毒癌基因蛋 白是E1A和/或癌基因是编码E1A和/或癌基因蛋白E1A的基因。
32. 根据权利要求31的用途，其特征是病毒癌基因蛋白E1A能够 结合功能性Rb肿瘤抑制基因产物。
33. 根据权利要求31的用途，其特征是病毒癌基因蛋白E1A不能 结合功能性Rb肿瘤抑制基因产物。
34. 根据权利要求31到33任一项的用途，其特征是病毒癌蛋白E1A 不诱导YB-1向细胞核中的定位。
35. 根据权利要求29到34任一项的用途，其特征是药物用于细胞 为Rb阳性或者Rb阴性的患者。
36. 根据权利要求29到35任一项的用途，其特征是细胞是Rb阴性 的并且细胞核是YB-1阳性的，优选独立于细胞周期在细胞核中YB-1阳 性的。
37. 根据权利要求29到36任一项的用途，其特征是细胞是p53阳 性或p53阴性的。
38. 根据权利要求29到37任一项的用途，其特征是癌基因蛋白与 野生型癌基因蛋白E1A相比显示出一种或几种突变或缺失，其中缺失优选 为选自包含CR3序列的缺失和N-末端缺失和C-末端缺失的组的缺失。
39. 权利要求38的用途，其特征是ElA癌基因蛋白能够结合Rb。
40. 根据权利要求29到37任一项的用途，其特征是癌基因蛋白与 野生型癌基因蛋白相比包含一个或几个突变或者缺失，其中该缺失优选是 CR1区和/或CR2区中的缺失。
41. 权利要求40的用途，其特征是癌基因蛋白ElA不能结合Rb。
42. 根据权利要求29到41任一项的用途，其特征是病毒癌基因蛋 白、优选ElA处于组织和/或肿瘤特异性启动子的控制下。
43. 根据权利要求29到42任一项的用途，其特征是病毒、优选腺 病毒编码YB-1。
44. 根据权利要求43的用途，其特征是YB-1处于组织特异性和/ 或肿瘤特异性启动子的控制下。
45. 根据权利要求29到44任一项的用途，其特征是病毒、优选腺 病毒编码至少一种蛋白，其中该蛋白选自包含E4orf6 、 E4orf3、 ElB55k 和腺病毒E3ADP蛋白的组。
46. 根据权利要求29到45任一项的用途，其特征是细胞在核中包 含YB-1，优选形成肿瘤的细胞或者其部分在核中具有YB-1。
47. 根据权利要求29到46任一项的用途，其特征是诱导YB-1转运 到细胞核中后，肿瘤在核中包含YB-i。
48. 根据权利要求47的用途，其特征是通过选自包含辐射、施用细 胞生长抑制剂和过热的组的至少一种措施引起YB-1向细胞核的转运。
49. 根据权利要求48的用途，其特征是将所述措施施加于细胞、器 官或者生物，优选需要其的生物，更优选患有所述疾病的生物。
50. 根据权利要求29到49任一项的用途，其特征是所述病毒、优 选腺病毒选自包含AdA24、 dl922-947、 El Ad/01/07 、 dll 119/1131、 CB 016、 d152和缺少能够结合功能性Rb肿瘤抑制基因产物的表达的病毒癌基因的 病毒的组。
51. 根据权利要求29到50任一项的用途，其中所述病毒、优选腺 病毒被设计成通过YB-1通过E2-晚期启动子的激活控制复制，优选地， 激活主要通过E2-晚期启动子的激活控制。
52. 根据权利要求29到51任一项的用途，其中病毒包含编码转基 因的核酸。
53. 根据权利要求29到51任一项的用途，其中病毒包含转基因的 翻译和/或转录产物。
54. 根据权利要求52到53任一项的用途，其中核酸包含转基因或 者编码转基因的核酸。
55. 根据权利要求52到54任一项的用途，其中转基因选自包含前 体药物基因、细胞因子和细胞因子的基因、程序性细胞死亡诱导基因、肿 瘤抑制基因、金属蛋白酶抑制剂基因和血管生成抑制剂基因的组。
56. 根据权利要求52到54任一项的用途，其中转基因选自包含 siRNA、适配体、反义分子和核酶的核酸的组，其中该siRNA、适配体、 反义分子和/或核酶靶定靶分子。
57. 根据权利要求56的用途，其中靶分子选自包含抗性相关因子、 抗程序性细胞死亡因子、癌基因、血管生成因子、DNA合成酶、DNA修 复酶、生长因子、生长因子的受体、转录因子、金属蛋白酶，优选基质金 属蛋白酶和尿激酶类型的纤溶酶原激活剂的组。
58. 前面权利要求任一项的用途，其中药物还包含至少一种药学活 性剂。
59. 根据权利要求58的用途，其中所述药学活性剂选自包含细胞因 子、金属蛋白酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞生长抑制剂、细胞周期抑 制剂、蛋白酶体抑制剂、重组抗体、信号转导途径的抑制剂和蛋白质激酶 抑制剂的组。
60. 前面权利要求任一项的用途，其特征是所述药物包含至少两种 活性剂的组合，其中所述活性剂的每一种单独和独立地选自包含细胞生长 抑制剂的组。
61. 根据权利要求60的用途，其特征是所述活性剂的至少两种靶定 不同的靶分子。
62. 根据权利要求61的用途，其特征是所述活性剂的至少两种通过 不同的作用方式发挥活性。
63. 根据权利要求60到62任一项的用途，其特征是至少一种活性剂增加病毒在其中进行复制的细胞的感染力。
64. 根据权利要求60到63任一项的用途，其特征是至少一种活性 剂影响细胞的组分的可用性，优选增加该组分的可用性，其中该组分调节 病毒的摄入。
65. 根据权利要求60到64任一项的用途，其特征是至少一种活性 剂介导YB-1向细胞核的转移，优选增加YB-1向细胞核的转移。
66. 根据权利要求60到65任一项的用途，其特征是至少一种活性 剂是组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
67. 根据权利要求66的用途，其特征是组蛋白脱乙酰酶抑制剂选自 包含曲古抑菌素A、 FR901228、 MS-27-275、 NVP-LAQ824、 PXD101、 apicidine禾卩striptaid的组。
68. 根据权利要求60到66任一项的用途，其特征是至少一种活性 剂选自包含曲古抑菌素A、 FR901228 、 MS-27-275 、 NVP-LAQ824、 PXD101、 apicidine禾口 striptaid的组。
69. 根据权利要求60到68任一项的用途，其特征是至少一种活性 剂是拓扑异构酶抑制剂。
70. 根据权利要求69的用途，其特征是拓扑异构酶抑制剂选自包含 喜树碱、伊立替康、托泊替康、DX-895If、 SN-38、 9-氨基喜树碱、9-硝基 喜树碱、柔红霉素和依托泊苷的组。
71. 前面权利要求任一项的用途，其特征是所述药物包含曲古抑菌 素A和伊立替康。
72. 前面权利要求任一项的用途，其特征是病毒、尤其根据前面权 利要求任一项的病毒与所述药物中的至少两种活性剂分离。
73. 根据权利要求72的用途，其特征是至少一单位剂量的病毒与一 种或至少两种活性剂的至少一单位剂量分离。
74. 根据权利要求1到28任一项的用途，其中病毒、优选腺病毒表 达选自包含E1B蛋白和E4蛋白的组的第一种蛋白，然后表达选自包含E1A蛋白的组的第二种蛋白。
75. 根据权利要求74的用途，其特征是第一种蛋白是E1B蛋白，优 选ElB55kd蛋白。
76. 根据权利要求74的用途，其特征是第一种蛋白是E4蛋白，优 选E4orf6蛋白。
77. 根据权利要求74到76任一项的用途，其特征是第一种蛋白是 E1B蛋白和E4蛋白的组合，优选ElB55kD蛋白和E4orf6蛋白的组合。
78. 根据权利要求74到77任一项的用途，其特征是E1A蛋白是 E1A12S蛋白。
79. 根据权利要求1到28任一项的用途和减优选如权利要求74到 78任一项中定义的腺病毒，其特征是病毒包含编码蛋白质的至少一种核 酸，所述蛋白质选自包含E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白的组，其中所述 至少一种蛋白处于启动子的控制下，该启动子不同于控制野生型腺病毒中 蛋白质的表达的启动子。
80. 根据权利要求79的用途，其特征是至少一种蛋白是E1B蛋白、 优选ElB55kD蛋白。
81. 根据权利要求79或80的用途，其特征是至少一种蛋白是E4蛋 白，优选E4orf6蛋白。
82. 根据权利要求79到81任一项的用途，其特征是至少一种蛋白是 E1A蛋白，优选E1A12S蛋白。
83. 根据权利要求79到82任一项的用途，其特征是至少一种蛋白 是E1B蛋白和E4蛋白的组合，优选ElB55kD蛋白和E4orf6蛋白的组合。
84. 根据权利要求79到82任一项的用途，其特征是至少一种蛋白 是E1B蛋白和E1A蛋白的组合，优选ElB55kD蛋白和E1A12S蛋白的组 合。
85. 根据权利要求79到82任一项的用途，其特征是至少一种蛋白 是E4蛋白和E1A蛋白的组合，优选E4or伤蛋白和E1A12S蛋白的组合。
86. 根据权利要求79到82任一项的用途，其特征是至少一种蛋白 是E1B蛋白、E4蛋白和E1A蛋白的组合，优选ElB55kD蛋白、E4orf6 蛋白和E1A12S蛋白的组合。
87. 根据权利要求79到86任一项的用途，其特征是E1B蛋白的表 达受到启动子的控制，其中该启动子选自包含肿瘤特异性启动子、器官特 异性启动子、组织特异性启动子、异源启动子和腺病毒启动子的组，其中 腺病毒启动子不同于E1B启动子。
88. 根据权利要求79到87任一项的用途，其特征是E4蛋白的表达 受到启动子的控制，其中该启动子选自包含肿瘤特异性启动子、器官特异 性启动子、组织特异性启动子、异源启动子和腺病毒启动子的组，其中腺 病毒启动子不同于E4启动子。
89. 根据权利要求87和88的用途，其中腺病毒启动子是E1A启动子。
90. 根据权利要求79到89任一项的用途，其特征是E1A蛋白的表 达受到启动子的控制，其中该启动子选自包含肿瘤特异性启动子、器官特 异性启动子、组织特异性启动子、异源启动子和腺病毒启动子的组，其中 腺病毒启动子不同于E1A启动子。
91. 根据权利要求87到90任一项的用途，其特征是E1A蛋白的表 达受到YB-1控制或者可以通过YB-1调节。
92. 根据权利要求87到91任一项的用途，其特征是控制E1A蛋白 的表达的启动子是腺病毒E2晚期启动子。
93. 根据权利要求74到92任一项的用途，其特征是E4蛋白，优选 E4orf6蛋白和E1B蛋白优选ElB55kd蛋白处于相同或者共同的启动子控 制下。
94. 根据权利要求1到2S任一项和/或优选根据权利要求74到93 任一项的用途，其特征是该病毒通过至少一种腺病毒蛋白在细胞核中提供 YB-1或者通过至少一种腺病毒蛋白介导细胞核中YB-1的提供，其中优选 地，腺病毒蛋白不同于E1A。
95. 根据权利要求1到28任一项和/或优选如权利要求74到94任一 项的用途，其特征是该病毒通过至少一种腺病毒蛋白提供用于腺病毒复制 的YB-1或者通过至少一种腺病毒蛋白介导用于腺病毒复制的YB-1的提 供，其中优选地，腺病毒蛋白不同于E1A。
96. 根据权利要求94或95的用途，其特征是所述腺病毒蛋白是 E4orf6和ElB55kd的复合体。
97. 根据权利要求1到28和/或优选如权利要求74到96任一项的用 途，其特征是腺病毒的核酸包含至少一种功能上失活的腺病毒区域，其中 该区域选自包含E1区、E3区、E4区和其组合的组。
98. 根据权利要求97的用途，其特征是所述区域是El区。
99. 根据权利要求97或98的用途，其特征是所述区域是E3区。
100. 根据权利要求97到100任一项的用途，其特征是所述区域是 E4区。
101. 根据权利要求97到100任一项的用途，其特征是所述区域包含 El区、E3区禾口E4区。
102. 根据权利要求1到28和/或优选如权利要求74到100任一项的 用途，其特征是所述病毒包含至少一个表达盒，其中该表达盒包含至少一 个启动子和编码腺病毒蛋白的核酸，其中腺病毒蛋白是E1B蛋白，优选 ElB55kD蛋白。
103. 根据权利要求102的用途，其特征是该启动子不同于EB启动子。
104. 根据权利要求103的用途，其特征是该启动子选自包含肿瘤特 异性启动子、器官特异性启动子、组织特异性启动子、异源启动子和腺病 毒启动子的组，其中该启动子不同于E1B启动子。
105. 根据权利要求1到28任一项和/或优选如权利要求74到104任 --项的腺病毒，其特征是该病毒包含至少一个表达盒，其中该表达盒包含 至少一个启动子和编码腺病毒蛋白的核酸，其中腺病毒蛋白是E4蛋白， 优选E4orf6蛋白。
106. 根据权利要求105的用途，其特征是所述启动子不同于E4启动子。
107. 根据权利要求106的用途，其特征是该启动子选自包含肿瘤特 异性启动子、器官特异性启动子、组织特异性启动子、异源启动子和腺病 毒启动子的组，其中腺病毒启动子不同于E4启动子。
108. 根据权利要求102到107任一项的用途，其特征是该启动子是 E1A启动子。
109. 根据权利要求1到28任一项和/或优选如权利要求74到108任 一项的用途，其特征是该病毒包含至少一个表达盒，其中该表达盒包含至 少一个启动子和编码腺病毒蛋白的核酸，其中腺病毒蛋白是E1A蛋白，优 选E1A12S蛋白。
110. 根据权利要求109的用途，其特征是所述启动子不同于E1A启 动子。
111. 根据权利要求110的用途，其特征是该启动子选自包含肿瘤特 异性启动子、器官特异性启动子、组织特异性启动子、异源启动子和腺病毒启动子的组。
112. 根据权利要求74到111任一项的用途，其特征是腺病毒包含核 酸，其中该核酸编码YB-1。
113. 根据权利要求112的用途，其特征是编码YB-1的核酸处于启动 子控制下，其中该启动子优选为E2晚期启动子。
114. 根据权利要求112或113的用途，其特征是编码YB-1的核酸处 于启动子控制下，其中该启动子分别是YB-1依赖性的和受YB-1控制的。
115. 根据权利要求108到114任一项的用途，其特征是编码YB-1 的核酸是表达盒的部分，该表达盒包含编码E1A蛋白的核酸，优选编码 E1A12S蛋白的核酸。
116. 根据权利要求115的用途，其特征是编码E1A蛋白的核酸与编 码YB-1的核酸通过IRES序列分开。
117. 根据权利要求102到116任一项的用途，其特征是编码E4蛋白、 优选E4orf6蛋白的核酸和编码E1B蛋白、优选ElB55kD蛋白的核酸包含 在表达盒中，其中优选这两个编码序列通过IRES序列分开。
118. 根据权利要求117的用途，其特征是表达盒的启动子是选自包 含肿瘤特异性启动子、器官特异性启动子、组织特异性启动子、异源启动 子和腺病毒启动子的组，其中腺病毒启动子不同于E4启动子并且不同于 E1B启动子，优选不同于野生型E4启动子并且不同于野生型E1B启动子。
119. 根据权利要求74到118任一项的用途，其特征是病毒包含表达 盒，该表达盒包含启动子和核酸序列，其中该核酸序列选自包含适配体、 核酶、aptazymes 、反义分子和siRNA的组。
120. 根据权利要求74到118任一项的用途，其特征是病毒包含表达 盒，该表达盒包含启动子和核酸序列，其中该核酸序列是编码核酸，其中 该核酸编码分子，该分子选自包含肽、多肽、蛋白质、anticalines、抗体和 抗体片段的组。
121. 根据权利要求74到118任一项的用途，其特征是病毒包含表达 盒，该表达盒包含启动子和核酸序列，其中该核酸序列选自包含程序性细 胞死亡诱导基因、前体药物基因、蛋白酶抑制剂、肿瘤抑制基因、细胞因 子和血管生成抑制剂的组。
122. 根据权利要求74到121任一项的用途，其特征是病毒是重组腺 病毒。
123. 根据权利要求74到122任一项的用途，其特征是病毒是腺病毒 突变体。
124. 根据权利要求74到123任一项的用途，其特征是病毒是复制缺 陷的。
125. 根据权利要求124的用途，其特征是病毒能够在包含去调节的 YB-1或在细胞核中具有YB-1的细胞中复制。
126. 根据权利要求125的用途，其特征是细胞独立于细胞周期在细 胞核中含有YB-1。
127. 根据权利要求74到126任一项的用途，其特征是所述药物包含 至少一种其他药学活性剂。
128. 根据权利要求74到126任一项的用途，其特征是所述药物与其 他药学活性剂一起施用或预期一起施用。
129. 根据权利要求74到128任一项的用途，其特征是所述其他药学 活性剂选自包含细胞因子、金属蛋白酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞生 长抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、蛋白酶体抑制剂、信号 转导级联的抑制剂和蛋白质激酶抑制剂和重组抗体的组。
130. 根据权利要求74到129任一项的用途，其特征是所述药物包含 至少两种活性剂的组合，其中每一种活性剂单独和独立地选自包含细胞生 长抑制剂的组。
131. 根据权利要求130的用途，其特征是所述活性剂的至少两种耙 定不同的靶分子。
132. 根据权利要求131的用途，其特征是所述活性剂的至少两种通 过不同的作用方式发挥活性。
133. 根据权利要求130到132任一项的用途，其特征是至少一种活 性剂增加病毒在其中进行复制的细胞的感染力。
134. 根据权利要求130到133任一项的用途，其特征是所述活性剂 影响细胞的组分的可用性，优选增加该组分的可用性，其中该组分介导病 毒的摄入。
135. 根据权利要求130到134任一项的用途，其特征是该活性剂介 导YB-1向细胞核的转移，优选增加YB-1向细胞核的转移。
136. 根据权利要求130到135任一项的用途，其特征是该活性剂是 组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
137. 根据权利要求136的用途，其特征是组蛋白脱乙酰酶抑制剂选 自包含曲古抑菌素A、 FR卯1228、 MS-27-275、 NVP-LAQ824、 PXD101、 apicidine禾卩striptaid的组。
138. 根据权利要求128到136任一项的用途，其特征是至少一种活 性剂选自包含曲古抑菌素A、 F謂1228、 MS-27-275、 NVP-LAQ824、 PXD101、 apicidine和striptaid的组。
139. 根据权利要求128到138任一项的用途，其特征是至少一种活 性剂是拓扑异构酶抑制剂。
140. 根据权利要求139的用途，其特征是拓扑异构酶抑制剂选自包 含喜树碱、SN-38、托泊替康、DX-895If、伊立替康、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、依托泊苷和柔红霉素的组。
141. 根据权利要求66到132任一项的用途，其特征是所述活性剂包 含曲古抑菌素A和伊立替康。
142. 根据权利要求1到28任一项的用途，其特征是病毒包含 -缺少功能的野生型E1区,禾口-转运蛋白，其用于将YB-1转运到受到该病毒感染的细胞的细胞核中。
143. 根据权利要求142的用途，其特征是所述病毒表达编码蛋白IX 的核酸并表达蛋白IX 。
144. 根据权利要求142或143的用途，其特征是所述缺少功能的野 生型ElA区是ElA-负型的。
145. 根据权利要求142到144任一项的用途，其特征是所述缺少功 能的野生型E1A区是ElB-负型的。
146. 根据权利要求145的用途，其特征是所述缺少的野生型El区是 ElB55k-负型和/或ElB19k-负型和/或蛋白IX-负型的。
147. 根据权利要求142到146任一项的用途，其特征是所述转运蛋白是如所述病毒提供的转运蛋白，优选异源转运蛋白。
148. 根据权利要求147的用途，其特征是所述转运蛋白是病毒转运蛋白。
149. 根据权利要求142到148任一项的用途，其特征是所述转运蛋 白包含蛋白E4orf6。
150. 根据权利要求142到149任一项的用途，其特征是所述转运蛋 白包含蛋白ElB55k。
151. 根据权利要求147到149任一项的用途，其特征是所述转运蛋 白包含由E4orf4和ElB55k组成的复合体。
152. 根据权利要求147到151任一项的用途，其特征是所述转运蛋 白由核酸编码，其中该核酸处于启动子控制下。
153. 根据权利要求152的用途，其特征是转运蛋白是由至少两种因 子组成的复合体，其中每种因子由一种核酸编码，其中两种核酸受到共同 的启动子的控制。
154. 根据权利要求153的用途，其特征是两种编码核酸通过调节表 达水平的元件连接并且其中该元件优选选自包含IRES的组。
155. 根据权利要求152的用途，其特征是转运蛋白是由至少两种因 子组成的复合体，并且每种因子由一种核酸编码，其中两种核酸各自受到 自己的启动子的控制。
156. 根据权利要求152到155任一项的用途，其特征是所述启动子 不同于E4启动子，尤其不同于腺病毒E4启动子并且不同于E1B启动子， 尤其不同于腺病毒E1B启动子。
157. 根据权利要求152到156任一项的用途，其特征是启动子是选 自包含组织特异性启动子、肿瘤特异性启动子、病毒启动子、CMV启动 子，尤其腺病毒启动子的组，条件是它们不同于E4启动子、E1B启动子 并且优选还不同于E2-晚期启动子。
158. 根据权利要求142到157任一项的用途，其特征是编码转运蛋 白的核酸在ElB55k的3'包含ElB55k的3'-UTR。
159. 根据权利要求142到158任一项的用途，其特征是如果缺失的 野生型El区是ElB55k阳性的，那么编码转运蛋白的核酸不包含编码ElB55k的核酸。
160. 根据权利要求142到158任一项的用途，其特征是编码转运蛋 白的核酸编码ElB55k和ElB19k。
161. 根据权利要求160的用途，其特征是编码转运蛋白的核酸编码 蛋白IX。
162. 根据权利要求160或161的用途，其特征是编码ElB55k和 ElB19k的核酸处于启动子控制下。
163. 根据权利要求160或161的用途，其特征是编码ElB55k和/或 ElB19k和/或蛋白IX的核酸处于启动子控制下，其中该启动子优选不同 于E1A依赖性的启动子，其中更优选地，该核酸编码ElB55k、 ElB19k 和蛋白IX。
164. 根据权利要求142到163任一项的用途，其特征是缺少功能的 野生型El区是ElA13S-负型禾口/或ElA12S-负型的。
165. 根据权利要求142到164任一项的用途，其特征是缺少功能的野 生型E1区ElA13S-负型。
166. 根据权利要求142到165任一项的用途，其特征是优选缺少功 能的野生型E1区是ElA13S-负型和ElA12-负型的，其中该病毒包含编码 E1A12S蛋白的核酸，其中该核酸优选是异源核酸。
167. 根据权利要求166的用途，其特征是编码E1A12S蛋白的核酸 处于启动子控制下，其中该启动子优选是YB-l-依赖性的启动子，并且更 优选选自包含E2-晚期启动子、肿瘤特异性启动子和组织特异性启动子的 组。
168. 根据权利要求167的用途，其特征是编码转运蛋白的一种或多 种核酸编码E4orf6和ElB55k。
169. 根据权利要求167或168的用途，其特征是编码E1A12S的核 酸和编码蛋白IX的核酸处于共同的启动子控制下，其中优选地，两种编 码核酸通过调节表达的元件相互连接，其中该元件更优选地选自包含IRES 的组。
170. 根据权利要求166到169任一项的用途，其特征是编码E1A12S 区的核酸和编码蛋白IX的核酸每种处于一个启动子控制下，其中该启动 子优选为相同的启动子。
171. 根据权利要求166或170任一项的用途，其特征是所述启动子 是YB-l-依赖性的启动子，其优选选自包含E2-晚期启动子、MDR启动子 和DNA聚合酶a启动子的组。
172. 根据权利要求142到171、尤其权利要求165到172任一项的用 途，其特征是所述病毒包含编码YB-1的核酸。
173. 根据权利要求172的用途，其特征是编码E1A12S的核酸和编 码YB-1的核酸处于共同的启动子控制下，其中两种编码核酸通过调节表 达的元件相互连接，其中该元件优选地选自包含IRES的组。
174. 根据权利要求172的用途，其特征是编码YB-1的核酸和编码 E1A12S蛋白的核酸每种处于一个启动子控制下，其中该启动子优选是相 同的启动子。
175. 根据权利要求172到174任一项的用途，其特征是所述启动子 是YB-l-依赖性的启动子，其优选选自包含E2-晚期启动子、MDR启动子 和DNA聚合酶a启动子的组。
176. 根据权利要求165到175任一项的用途，其特征是将编码 E1A12S的核酸克隆到E3区或者E4区中。
177. 根据权利要求175到176任一项的用途，其特征是将编码 E1A12S的核酸和编码蛋白IX的核酸或编码YB-1的核酸克隆到E3区或 者E4区中。
178. 根据权利要求142至U77任一项的用途，其特征是编码蛋白IX 的核酸的表达受到不同于E1B的启动子、ElB19k或E1A12S的控制。
179. 根据权利要求142到178任一项的用途，其特征是所述病毒包 含至少一种转基因，其优选克隆到E3区中。
180. 根据权利要求179的用途，其特征是所述病毒包含至少一种转 基因，其优选克隆到E4区中。
181. 根据权利要求142到180任一项的用途，其特征是所述病毒包 含编码RGD基序的核酸。
182. 根据权利要求142到181任一项的用途，其还包含MLP基因和 /或E2A基因和E1B基因和/或E3基因和/或E4基因。
183. 根据权利要求142到182任一项的用途，其特征是所述病毒是 在细胞核中不含有YB-1的细胞中复制缺陷的。
184. 根据权利要求142到183任一项的用途，其特征是所述病毒能 够在细胞核中具有YB-1的细胞中复制，尤其在独立于细胞周期在细胞核 中具有YB-1的细胞中复制。
185. 根据权利要求142到183任一项的用途，其特征是所述病毒能 够在YB-1以去调节的方式存在的细胞中复制。
186. 根据权利要求142到185任一项的用途，其中所述药物还包含 至少一种药学活性剂。
187. 根据权利要求186的用途，其中所述药学活性剂选自包含细胞 因子、金属蛋白酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞生长抑制剂、细胞周期 抑制剂、蛋白酶体抑制剂、重组抗体、信号转导级联的抑制剂和蛋白质激 酶抑制剂的组。
188. 根据权利要求186或187任一项的用途，其特征是所述药物包 含至少两种活性剂的组合，其中每种活性剂各自和独立地选自包含细胞生 长抑制剂的组。
189. 根据权利要求188的用途，其特征是所述至少两种活性剂靶定 不同的靶分子。
190. 根据权利要求189的用途，其特征是所述活性剂的至少两种通 过不同的作用方式发挥活性。
191. 根据权利要求188到190任一项的用途，其特征是至少一种活 性剂增加病毒在其中进行复制的细胞的感染力。
192. 根据权利要求187到190任一项的用途，其特征是至少一种活 性剂影响细胞中化合物的可用性，优选增加该化合物的可用性，其中该化 合物调节病毒的摄入。
193. 根据权利要求187到191任一项的用途，其特征是所述活性剂 介导YB-1向细胞核的转移，优选增加YB-1向细胞核的转移。
194. 根据权利要求188到193任一项的用途，其特征是至少一种活 性剂是组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
195. 根据权利要求192到194任一项的用途，其特征是组蛋白脱乙 酰酶抑制剂选自包含曲古抑菌素A、 FR901228、 MS-27-275 、 NVP-LAQ824、 PXDIOI 、 Apicidin和Scriptaid的组。
196. 根据权利要求188到194任一项的用途，其特征是所述活性剂 选自包含曲古抑菌素A、 FR卯1228、 MS-27-275、 NVP-LAQ824、 PXD101、 Apicidin禾口 Scriptaid的组。
197. 根据权利要求188到196任一项的用途，其特征是至少一种活 性剂是拓扑异构酶抑制剂。
198. 根据权利要求197的用途，其特征是拓扑异构酶抑制剂选自包 含喜树碱、伊立替康、托泊替康、DX-895If、 SN-38、 9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、柔红霉素和依托泊苷的组。
199. 根据权利要求186到188任一项的用途，其特征是所述活性剂 包含曲古抑菌素A和伊立替康。
200. 根据权利要求188到199任一项的用途，其特征是病毒、尤其 根据前面权利要求任一项的病毒与所述至少两种活性剂分离。
201. 根据权利要求192的用途，其特征是至少一单位剂量的病毒与 一种或至少两种活性剂的至少一单位剂量分离。
全文摘要
本发明涉及病毒、尤其腺病毒在逆转细胞中抗性的用途。
文档编号C07K14/005GK101128593SQ200680006399
公开日2008年2月20日 申请日期2006年1月2日 优先权日2004年12月31日
发明者佩尔·松内·霍尔姆 申请人:佩尔·松内·霍尔姆