一种口腔黏膜细胞的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及尿道支架的制备领域，尤其涉及一种口腔黏膜细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002]口腔粘膜上皮细胞体外培养具有重要的生物学及临床意义。它不仅为研宄口腔粘膜分化、口腔病理生理、毒理学及癌发生机理等提供良好的实验体系，也对人类组织工程化口腔粘膜构建和口腔粘膜组织缺损修复具有重要意义，同时对于眼睑、喉、气管及尿道等粘膜缺损的修复重建有重要临床意义。构建组织工程化尿道需要足够数量的种子细胞，人们尝试利用口腔黏膜细胞作为种子细胞，而种子细胞的增殖能力和纯度与细胞分离的效果密切相关，现有技术中的口腔黏膜培养方法，细胞容易出现老化，细胞贴壁及增殖能力均明显减弱，无法达到组织工程的需要。
【发明内容】
[0003]本发明提供一种口腔黏膜细胞的培养方法，解决现有技术中的口腔黏膜培养方法，细胞容易出现老化，细胞贴壁及增殖能力均明显减弱，无法达到组织工程的需要的技术冋题。
[0004]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0005]一种口腔黏膜细胞的培养方法，包括:
[0006]用消化酶将兔口腔黏膜上皮与结缔组织进行分离；
[0007]用胰酶消化，以除去结缔组织，以获取口腔黏膜细胞；
[0008]将所述口腔黏膜细胞接种于已被丝裂霉素灭活的小鼠成纤维细胞3T3细胞上；
[0009]将角化细胞无血清培养液KSFM和DMEM混合，形成混合液；
[0010]采用所述混合液，培养接种于3T3上的口腔黏膜细胞。
[0011]本发明提供一种口腔黏膜细胞的培养方法，用消化酶将兔口腔黏膜上皮与结缔组织进行分离，用胰酶消化，以除去结缔组织，以获取口腔黏膜细胞，将所述口腔黏膜细胞接种于已被丝裂霉素灭活的小鼠成纤维细胞3T3细胞上，将角化细胞无血清培养液KSFM和DMEM混合，形成混合液，采用所述混合液，培养接种于3T3上的口腔黏膜细胞。本发明提高率口腔黏膜细胞的分离纯度，提高了种子细胞的贴壁及增殖能力。
【附图说明】
[0012]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。
[0013]图1为本发明实施例一种口腔黏膜细胞的培养方法的流程图。
【具体实施方式】
[0014]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0015]本发明实施例提供了一种口腔黏膜细胞的培养方法，如图1所示，包括:
[0016]步骤101、用消化酶将兔口腔黏膜上皮与结缔组织进行分离；
[0017]其中，所述消化酶为Dispase II消化酶。Dispase II消化酶是从多粘芽胞杆菌培养液中提取出来的一种快速、有效、作用温和的中性蛋白酶，它能有选择性地分离基底膜上的纤维连接素和I型胶原，从而分离上皮与真皮，但对上皮细胞及细胞连接没有影响。使用Dispase II消化酶进行消化后，位于基底层的具有增殖能力的细胞(即粘膜干细胞)能被完整地保留在分离下来的上皮层中。所以，用Dispase II消化酶进行口腔粘膜细胞的分离就意味着比用胰酶分离所获得的具有增殖能力的细胞数量要多，而且可以最大程度的去除黏膜下结缔组织和其它混杂成分，得到纯化的口腔黏膜细胞，防止成纤维细胞及其它细胞的污染。
[0018]步骤102、用胰酶消化，以除去结缔组织，以获取口腔黏膜细胞；
[0019]步骤103、将所述口腔黏膜细胞接种于已被丝裂霉素灭活的小鼠成纤维细胞3T3细胞上；
[0020]其中，3T3滋养层细胞的存在可明显促进兔口腔黏膜细胞的贴壁、生长和扩增，细胞可传代培养至7?8代，且各代细胞均可保持均一良好的形态，说明细胞功能一直维持良好；传至第3代时细胞数量即可达到20X 106本研宄表明，通过滋养层培养法，即将口腔黏膜细胞与已灭活的3T3成纤维滋养层细胞在体外共培养，是一种理想的选择。
[0021 ] 步骤104、将角化细胞无血清培养液KSFM和DMEM混合，形成混合液；
[0022]其中，KSFM(Kerat1nocyteSerum-Free Medium，角化细胞无血清培养液)和含10% FBS的DMEM以1:1的比例混合。
[0023]步骤105、采用所述混合液，培养接种于3T3上的口腔黏膜细胞。
[0024]为了去除残存的极少量3T3细胞，从而得到纯化的口腔黏膜细胞，所述方法还可以包括:
[0025]利用dispase酶将口腔黏膜细胞浮起，以使口腔黏膜细胞与3T3细胞分离；
[0026]采样用胰酶将口腔黏膜上皮细胞消化传代。
[0027]上述步骤应用Dispase II消化酶首先使已灭活的3T3成纤维细胞浮起，可成功将其从培养皿中去除，然后再用胰酶将口腔黏膜上皮细胞消化传代，流式检测结果显示口腔黏膜细胞占细胞总数的95%以上。
[0028]本发明提供一种口腔黏膜细胞的培养方法，用消化酶将兔口腔黏膜上皮与结缔组织进行分离，用胰酶消化，以除去结缔组织，以获取口腔黏膜细胞，将所述口腔黏膜细胞接种于已被丝裂霉素灭活的小鼠成纤维细胞3T3细胞上，将角化细胞无血清培养液KSFM和DMEM混合，形成混合液，采用所述混合液，培养接种于3T3上的口腔黏膜细胞。本发明提高率口腔黏膜细胞的分离纯度，提高了种子细胞的贴壁及增殖能力。
[0029]实验发现，本发明实施例利用3T3滋养细胞层培养的口腔黏膜细胞，形态良好均一，呈现典型的“铺路石”状，有较强的增殖能力，可传代至7?8代。体外扩增获得的细胞数量完全可满足组织工程的需要。
[0030]以上对本发明进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
【主权项】
1.一种口腔黏膜细胞的培养方法，其特征在于，包括: 用消化酶将兔口腔黏膜上皮与结缔组织进行分离； 用胰酶消化，以除去结缔组织，以获取口腔黏膜细胞； 将所述口腔黏膜细胞接种于已被丝裂霉素灭活的小鼠成纤维细胞3T3细胞上； 将角化细胞无血清培养液KSFM和DMEM混合，形成混合液； 采用所述混合液，培养接种于3T3上的口腔黏膜细胞。
2.根据权利要求1所述的口腔黏膜细胞的培养方法，其特征在于，将角化细胞无血清培养液KSFM和DMEM混合，形成混合液，包括: 将角化细胞无血清培养液KSFM和含10% FBS的DMEM以1:1的比例混合，形成混合液。
3.根据权利要求1所述的口腔黏膜细胞的培养方法，其特征在于，所述消化酶为Dispase II 消化酶。
4.根据权利要求1所述的口腔黏膜细胞的培养方法，其特征在于，所述方法还包括: 使用dispase酶是将口腔黏膜细胞浮起，以使口腔黏膜细胞与3T3细胞分离； 采样用胰酶将口腔黏膜上皮细胞消化传代。
【专利摘要】本发明涉及尿道支架的制备领域，公开了一种口腔黏膜细胞的培养方法，用消化酶将兔口腔黏膜上皮与结缔组织进行分离，用胰酶消化，以除去结缔组织，以获取口腔黏膜细胞，将所述口腔黏膜细胞接种于已被丝裂霉素灭活的小鼠成纤维细胞3T3细胞上，将角化细胞无血清培养液KSFM和DMEM混合，形成混合液，采用所述混合液，培养接种于3T3上的口腔黏膜细胞。本发明提高率口腔黏膜细胞的分离纯度，提高了种子细胞的贴壁及增殖能力。
【IPC分类】C12N5-071
【公开号】CN104862269
【申请号】CN201510319335
【发明人】李超, 吴登龙, 徐月敏, 乐威
【申请人】李超
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月12日