细胞体外培养装置及培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞体外培养领域，尤其涉及一种细胞体外培养装置及培养方法。
【背景技术】
[0002]细胞或组织的增殖、分化及生理功能的实现，与其所处的环境密切相关，这些环境因素可以是营养物质、压力、温度、PH等中的一种或多种。人体内有很多组织和细胞生存于动态载荷环境下，如软骨细胞和肺细胞等，这些组织和细胞只有在适当压力条件下培养，才能正常增殖、分化，产生与体内相同的生理功能。现有体外研宄表明:未在适当压力条件下体外培养的关节软骨细胞，细胞排列不规则，基质产生少，且胶原纤维较细；同时动物研宄发现，关节制动会使关节软骨发生变性，特别对蛋白多糖的合成有影响。相反，一定的机械应力刺激是维持软骨细胞正常新陈代谢机能所必需的生长环境。
[0003]加压培养技术是细胞培养的方法之一，通过不同手段对培养的组织或细胞施加一定的压力载荷，以模拟其承受生理载荷的环境。常见的加压培养技术有液压培养技术、离心管培养技术和直接接触压缩培养技术等。液压培养技术是将软骨细胞或软骨块置于培养皿中，其中加满完全培养液，去除培养皿上盖换成压力膜，排出皿内空气后用粘胶使压力膜与皿贴紧，确保皿内无残留气泡，然后将培养皿置于压力室中，压力室内充满蒸馏水，压力和频率由计算机控制下的压力阀来调控。离心管培养技术则是将细胞及培养基置于离心管内，通过离心力产生加压，通过调控离心速度的快慢，来调节细胞承受重力大小，加压强度不能灵活调整，离心过程中细胞的培养条件可能不稳定。直接接触压缩培养技术中较有代表性的是flexcell公司的细胞力学培养产品，该系统基本原理(正气压交换模式):利用橡胶密封垫在细胞培养板基底膜与基座之间形成封闭腔，把此密封腔的进、出气管插入二氧化碳培养箱里，把此密封腔放入二氧化碳培养箱，利用封闭腔正气压挤压培养孔里的活塞，进而使活塞和固定台之间的三维培养物间接受到压力发生形变，通过计算机控制系统调节气体的压力来改变基底膜的形变量。目前几种加压培养方法中，利用液压或气压加载方式，组织处于相对密闭的培养环境中，难以实现对细胞组织培养液的动态更新，需在实验载荷间隙更换培养液。
[0004]软骨是人或脊椎动物体内的一种结缔组织。骨关节炎可引起关节软骨的破坏，其他原因也可导致软骨缺损，软骨破坏或缺损后，其自身很难再生修复，常用异体软骨移植、假体替代和自身软骨细胞移植等进行治疗，但这些治疗方法的效果不甚理想。科学家们正在研宄通过组织工程学对破坏或缺损的软骨进行再生修复。组织工程学是指利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法，再造或者修复器官及组织的技术。组织工程化软骨现已逐渐被认为是一种有希望治疗全层软骨缺损的手段。软骨的组织工程是将关节软骨酶解后，游离出原代软骨细胞，或直接利用可向软骨细胞分化的干细胞，种植于可降解吸收的聚合物上，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)等或天然载体如胶原纤维，经离体三维培养一段时间后再移植到动物体内，继续生成新的软骨。三维培养环境有利于软骨细胞的增殖、分化、表型稳定和基质蛋白合成。
[0005]人体内部分组织或细胞在不同部位需要不同的营养物质，这些营养物质对于细胞的增殖、分化、表型稳定和基质蛋白合成等也是非常重要的。以最具有代表性的软骨组织为例来进行说明。软骨是人或脊椎动物体内的一种结缔组织。关节软骨组织呈分层结构，靠近关节腔的部分为关节软骨表层，靠近软骨下骨的部分为关节软骨深层，又称为关节软骨钙化层。关节软骨无血管、无淋巴管、无神经，其营养来源有:①软骨下骨组织的血管穿入钙化层，供应该层的营养；?软骨周围的滑膜血管与滑液进行营养交换；③滑膜分泌的滑液藉渗透作用进入软骨，为关节软骨表层提供营养。因此，关节软骨表层与关节软骨深层分别由不同营养来源的不同营养物质提供营养。培养基在软骨细胞三维培养中对细胞分化起着关键性作用。但现有研宄尚未对培养基的研宄给予足够的重视。现有的软骨组织或细胞培养中，未对软骨组织进行结构区分，仅使用一种培养基提供营养。目前尚未有使用两种培养基对软骨组织进行培养的报道，更未有可以同时使用两种培养基对软骨细胞进行三维立体体外培养的装置。
[0006]当在细胞外培养基质中对软骨细胞等细胞或组织进行三维立体体外培养时，模拟其所处的力学和/或营养环境即显得尤为重要。建立一套能够模拟体内生理环境的体外培养装置及方法，是进行软骨细胞等细胞或组织相关基础研宄的重要手段。
【发明内容】
[0007]有鉴于此，有必要针对现有细胞培养中不能实现两种不同培养液的分层动态灌注培养的问题，提供一种细胞体外培养装置及培养方法。
[0008]为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案:
[0009]细胞体外培养装置，包括生物反应器和双培养液灌溉系统；
[0010]所述生物反应器包含盖板、中板、底板和双重培养杯，所述盖板对合放置在中板上，所述底板对合放置在中板下，所述中板设有中板方孔，所述方孔内放置双重培养杯，所述双重培养杯包括方杯以及位于方杯之内的圆杯；所述圆杯包含圆杯壁和圆杯多孔底片，所述圆杯设有圆杯抽吸管和圆杯输液管，所述方杯设有方杯抽吸管和方杯输液管；所述圆杯和方杯之间设有支撑结构；
[0011]所述双培养液灌溉系统包括两个培养液盛放装置、两个废液回收装置、两个培养液输送管、两个废液回收管和一个多通道蠕动泵，两个培养液盛放装置分别通过一个培养液输送管与圆杯输液管或方杯输液管相连，所述圆杯抽吸管和方杯抽吸管各通过一个废液回收管与一个废液回收装置相连；所述多通道蠕动泵为培养液的输送和废液的抽吸提供动力。
[0012]优选的，所述细胞体外培养装置还包括加载装置，所述加载装置包括马达、加压板、加压柱和多孔加压片；所述加压板位于盖板之上，所述盖板上对应中板方孔的位置设有盖板方孔，所述加压柱的上端与加压板螺纹连接，加压柱穿过盖板方孔，加压柱的下端与多孔加压片螺纹连接；所述马达与加压板连接。
[0013]优选的，所述细胞体外培养装置还包括监测系统，所述监测系统包括压力感应片、电子显微镜和电脑；所述压力感应片位于所述底板上，且与双重培养杯对应设置，所述压力感应片通过数据线与电脑连接；所述电子显微镜位于盖板和中板之间，通过数据线与电脑连接；所述电脑还通过数据线与多功能蠕动泵和马达连接。
[0014]优选的，所述盖板的底面设有盖板管槽和盖板电子显微镜安装槽，所述中板的正面设有中板管槽和中板电子显微镜安装槽。
[0015]优选的，所述方杯和圆杯分别设有管道固定结构。
[0016]更优选的，所述双重培养杯分为压力承载杯和非压力承载杯；所述压力承载杯的方杯含有3个管道固定结构，圆杯有I个管道固定结构，圆杯抽吸管穿过加压柱；所述非压力承载杯的圆杯含有2个含有管道固定结构，所述方杯含有4个管道固定结构。
[0017]优选的，细胞体外培养装置含有12个双重培养杯，分为3排，每排4个，中间I排为非压力承载杯，其余2排为压力承载杯。
[0018]优选的，所述支撑结构为设于圆杯底部的支撑脚。
[0019]一种细胞体外培养方法，使用上述细胞体外培养装置及两种培养液进行培养，包括以下步骤:
[0020]S1、预制含有细胞的液态凝胶；
[0021]S2、将生物反应器和加载装置装配后置于超净台上，将电脑连接马达，控制马达调节加压板位置使多孔加压片与圆杯多孔底片之间有1_4_的间隙，然后将预制的液态凝胶注入该间隙中，使液态凝胶与多孔加压片和圆杯多孔底片的表面充分接触，置于室温待液态凝胶充分凝固；
[0022]S3、在圆杯和方杯中分别加适量的第一种培养液或第二种培养液；再将生物反应器转移至细胞培养箱，连接双培养液灌溉系统以及监控系统；启动驱动马达和培养液蠕动泵，对培养组织施加设定的压力载荷，并维持稳定的培养液环境，实时监测加压板的加压位移情况，以及组织的受力大小变化。
[0023]优选的，细胞体外培养装置及培养方法适用于人体内生存于压力条件下的各种组织和细胞的体外培养，例如:胃上皮