一种艾滋病抗原检测芯片制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备方法，尤其涉及一种艾滋病抗原检测芯片制备方法。
【背景技术】
[0002]目前，艾滋病的诊断方法有病毒检测和抗体检测两大类。病毒检测是诊断艾滋病的重要方法，由于艾滋病感染者，首先在体内出现的是艾滋病病毒，只有过一段时间后再在体内产生抗体，因此，病毒检测是实现对HIV的早期诊断的有效方法。病毒检测包括细胞培养(病毒分离)、抗原检测和病毒核酸检测。其中细胞培养的方法专一性强，但因为必须有一定数量的感染细胞存在才能培养和分离出病毒来，因而敏感性较差，而且操作时间长，操作复杂，不适用于临床的快速检测。核酸序列扩增反应既可扩增RNA又可扩增DNA，因此，病毒核酸检测方法有较高的灵敏度，可用于艾滋病的早期诊断，但其最大的缺点是检测的试剂与仪器昂贵，而且操作复杂、耗时长，难以在一般实验室推广，不适合于对大量病人的快速检测。P24抗原检测是诊断艾滋病的一个有效方法，通常采用免疫分析方法进行检测，相对细胞培养和病毒核酸检测，该方法既达到早期检测的目的，又操作简单、快速、对试剂与仪器要求不高，成本低，容易推广。而如果采用新型稀土荧光纳米粒子作标记物，通过蛋白质芯片和时间分辨荧光免疫分析技术，则既能达到高灵敏度，又能达到高通量与快速检测之效果。
[0003]国际国内对p24抗原的检测均采用ELISA方法的原理，即采用抗原-抗体高特异性免疫反应的方法实现P24抗原的检测，使用的标记物为传统的发射性同位素、酶、有机荧光染料、稀土配合物、化学发光物质等，检测用的载体材料多采用96孔板。这些方法在一定程度上能实现对HIV p24抗原的检测，但存在的缺点明显:一是由于使用的标记物为传统的标记物，检测灵敏度受到一定限制；二是由于通常都是在96孔板上或试纸条(卡)上进行，因而不能实现高通量化，难以实现对大量患者群体的高通量快速检测，如对疫情较严重地区患者人群的HIV普查、监测和献血血源筛查等，而且试剂消耗量很大。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种艾滋病抗原检测芯片制备方法。
[0005]本发明通过以下技术方案来实现上述目的:
[0006]本发明包括以下步骤:
[0007]步骤一，合成新型核壳型二氧化硅荧光纳米粒子；
[0008]步骤二，标记链亲和素；
[0009]步骤三，制备基于检测HIV p24抗原检测的蛋白质芯片。
[0010]根据步骤一，合成原料包括表面活性剂、助表面活性剂、环己烷和硝酸银水溶液，将合成原料混合成微乳液，加入还原剂，将Ag+还原为单质Ag，然后加入正硅酸乙酯与氨水使发生聚合反应，在纳米银表面就包覆一层S12，加入带有螯合基团配位体的试剂，反应后分尚出纳米粒子，再将该纳米粒子分散到Eu3+或Eu3+与Tb3+水溶液中充分反应,将纳米粒子离心、洗涤、干燥即得到最终所需要的纳米粒子。
[0011]进一步，所述纳米粒子中核为Ag核，壳为S12，发光来源于稀土配合物，Ag核对稀土配合物发光具有金属增强荧光效应。
[0012]进一步，根据步骤二，采用戊二醛交联法标记链亲和素。
[0013]进一步，根据步骤三，所述芯片拟采用醛基或巯基修饰的玻片做片基，采用夹心法引入生物素链亲和素放大系统，对P24抗原的分析拟采用两株配对的抗p24单克隆抗体，或一种为单抗，另一种为多抗，其中一株抗体通过点样固定在玻片上制成固相抗体，另一株抗体标记生物素，在分析buffer中加入一种解离剂如甘氨酸与Tris-HCl混和试剂，以使血清中的p24从抗原-抗体复合物中解离出来，首先通过夹心法使待分析的p24抗原与芯片上的固定抗体及加入的与该抗体配对的标记生物素的另一株单克抗体反应，然后加入标记链亲和素的荧光纳米粒子，利用生物素-链亲和素高亲和反应，使荧光纳米粒子固定到反应复合物上，反应完成后将芯片置于芯片扫描仪上扫描，测量荧光信号，获取数据并进行数据处理与分析。
[0014]本发明的有益效果在于:
[0015]本发明依据抗原-抗体高特异性免疫反应，采用稀土荧光纳米粒子作标记物来提高检测信号和检测灵敏度，在此基础上制备微陈列蛋白质芯片，这样可以使用极少量的样品，在极短时间内实现对大量病人高通量、高灵敏度和快速检测，大大节省原料和人力物力和时间。
【附图说明】
[0016]图1为本发明所述的一种艾滋病抗原检测芯片制备方法的流程图。
【具体实施方式】
[0017]下面对本发明作进一步说明:
[0018]如图1所示，本发明包括以下步骤:
[0019]步骤一，合成新型核壳型二氧化硅荧光纳米粒子，合成原料包括表面活性剂、助表面活性剂、环己烷和硝酸银水溶液，将合成原料混合成微乳液，加入还原剂，将Ag+还原为单质Ag,然后加入正娃酸乙酯与氨水使发生聚合反应,在纳米银表面就包覆一层S12,加入带有螯合基团配位体的试剂，反应后分离出纳米粒子，再将该纳米粒子分散到Eu3+或Eu3+与Tb3+水溶液中充分反应，将纳米粒子离心、洗涤、干燥即得到最终所需要的纳米粒子，所述纳米粒子中核为Ag核,壳为S12,发光来源于稀土配合物,Ag核对稀土配合物发光具有金属增强荧光效应；
[0020]步骤二，采用戊二醛交联法标记链亲和素；
[0021 ] 步骤三，制备基于检测HIV p24抗原检测的蛋白质芯片，所述芯片拟采用醛基或巯基修饰的玻片做片基，采用夹心法引入生物素链亲和素放大系统，对P24抗原的分析拟采用两株配对的抗p24单克隆抗体，或一种为单抗，另一种为多抗，其中一株抗体通过点样固定在玻片上制成固相抗体，另一株抗体标记生物素，在分析buffer中加入一种解离剂如甘氨酸与Tris-HCl混和试剂，以使血清中的p24从抗原-抗体复合物中解离出来，首先通过夹心法使待分析的P24抗原与芯片上的固定抗体及加入的与该抗体配对的标记生物素的另一株单克抗体反应，然后加入标记链亲和素的荧光纳米粒子，利用生物素-链亲和素高亲和反应，使荧光纳米粒子固定到反应复合物上，反应完成后将芯片置于芯片扫描仪上扫描，测量荧光信号，获取数据并进行数据处理与分析。
[0022]本领域技术人员不脱离本发明的实质和精神，可以有多种变形方案实现本发明，以上所述仅为本发明较佳可行的实施例而已，并非因此局限本发明的权利范围，凡运用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变化，均包含于本发明的权利范围之内。
【主权项】
1.一种艾滋病抗原检测芯片制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤一，合成新型核壳型二氧化娃突光纳米粒子； 步骤二，标记链亲和素； 步骤三，制备基于检测HIV P24抗原检测的蛋白质芯片。2.根据权利要求1所述的一种艾滋病抗原检测芯片制备方法，其特征在于:根据步骤一，合成原料包括表面活性剂、助表面活性剂、环己烷和硝酸银水溶液，将合成原料混合成微乳液，加入还原剂，将Ag+还原为单质Ag，然后加入正硅酸乙酯与氨水使发生聚合反应，在纳米银表面就包覆一层S12，加入带有螯合基团配位体的试剂，反应后分离出纳米粒子，再将该纳米粒子分散到Eu3+或Eu3+与Tb3+水溶液中充分反应，将纳米粒子离心、洗涤、干燥即得到最终所需要的纳米粒子。3.根据权利要求2或所述的一种艾滋病抗原检测芯片制备方法，其特征在于:所述纳米粒子中核为Ag核,壳为S12,发光来源于稀土配合物，Ag核对稀土配合物发光具有金属增强荧光效应。4.根据权利要求1或所述的一种艾滋病抗原检测芯片制备方法，其特征在于:根据步骤二，采用戊二醛交联法标记链亲和素。5.根据权利要求4或所述的一种艾滋病抗原检测芯片制备方法，其特征在于:根据步骤三，所述芯片拟采用醛基或巯基修饰的玻片做片基，采用夹心法引入生物素链亲和素放大系统，对p24抗原的分析拟采用两株配对的抗p24单克隆抗体，或一种为单抗，另一种为多抗，其中一株抗体通过点样固定在玻片上制成固相抗体，另一株抗体标记生物素，在分析buffer中加入一种解离剂如甘氨酸与Tris-HCl混和试剂，以使血清中的p24从抗原-抗体复合物中解离出来，首先通过夹心法使待分析的P24抗原与芯片上的固定抗体及加入的与该抗体配对的标记生物素的另一株单克抗体反应，然后加入标记链亲和素的荧光纳米粒子，利用生物素-链亲和素高亲和反应，使荧光纳米粒子固定到反应复合物上，反应完成后将芯片置于芯片扫描仪上扫描，测量荧光信号，获取数据并进行数据处理与分析。
【专利摘要】本发明公开了一种艾滋病抗原检测芯片制备方法，包括以下步骤：步骤一，合成新型核壳型二氧化硅荧光纳米粒子；步骤二，标记链亲和素；步骤三，制备基于检测HIV p24抗原检测的蛋白质芯片。本发明依据抗原-抗体高特异性免疫反应，采用稀土荧光纳米粒子作标记物来提高检测信号和检测灵敏度，在此基础上制备微陈列蛋白质芯片，这样可以使用极少量的样品，在极短时间内实现对大量病人高通量、高灵敏度和快速检测，大大节省原料和人力物力和时间。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN104977413
【申请号】CN201410127560
【发明人】戴天岩
【申请人】虫洞(北京)卫生科技有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月1日