一种nk细胞的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及一种NK细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002] NK细胞是机体抵抗恶性肿瘤和病毒感染的重要免疫调节细胞，起源于骨髓来源的 CD34+造血祖细胞，无需有抗体存在或预先致敏便可直接杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的 重要效应细胞。随着对NK细胞识别人类肿瘤分子机制研宄的深入，以NK细胞为基础的抗肿 瘤免疫治疗引起重视并取得重大进展。目前有关NK细胞在肿瘤免疫治疗的研宄主要集中 在自体NK细胞过继免疫治疗、异体NK细胞过继免疫治疗及基因修饰NK细胞免疫治疗等， 并已取得显著成效。但如何在保证临床安全性的前提下提高NK细胞体外增殖效率和杀伤 活性一直是科研工作者和临床医生共同探索研宄的重点。
[0003] 目前主要是从培养基和血清种类，细胞刺激因子，辅助饲养细胞等各方面探索NK 细胞高效培养的捷径。体外NK细胞扩增培养体系中，常用培养基分别为CellGro SCGM， 1^]\〇-164〇培养基，无血清培养基0，1￥〇了]\1361'11111-打66]^(1丨3)3大类。各培养基的使用 效果证实CellGro SCGM培养基比RPMI-1640和X-VivolO培养基能更有效支持NK细胞生 长活化与扩增。已知IL-2、IL-15、IL-18和IL-12等细胞因子对NK细胞的活化与扩增非常 重要，其中IL-15的作用尤为重要。IL-2是体外扩增NK细胞体系中最常用的细胞因子，可 以在24h反应期内提高NK杀伤活性并刺激其增殖。近期Strivastava等研宄证实IL-15 单独或联合IL-2使用通常会导致最低限度NK细胞扩增（Strivastava S，Lundqvist A， Childs RW. Cytotherapy，2008,10(8) :775-783)。大量研宄证明细胞因子对NK细胞的活化 和扩增是必要的，但是仅有细胞因子并不能刺激NK细胞达到最理想的增殖状态。Alici等 在多发性骨髓瘤患者体外NK细胞扩增的研宄中使用IL-2和0KT3作为其细胞刺激因子，细 胞扩增明显（Alici E，Sutlu T，Bjork strand B，Gill jam M，et al. Blood，2008,111(6): 3155-3162)。另外绝大多数研宄人员认为NK细胞持续增殖需要在细胞因子的基础上增加 额外刺激信号，比如同种异体单核细胞、自体淋巴细胞、促分裂素活性淋巴细胞、脐血间充 质干细胞等辅助饲养细胞。目前多采用病毒转染的B淋巴细胞及肿瘤细胞作饲养细胞以提 高NK细胞扩增倍数，但其安全性尚待探讨。
[0004] 总体来说，目前的NK细胞扩增效果仍不能满足实际应用，且Cellgro培养基和 IL-15的价格都非常昂贵，故一般在国内使用的培养基均为普遍可以用来培养免疫细胞的 培养基，但细胞培养的效果奇差。如何找到一种成本低且操作便捷的NK细胞培养方法具有 巨大的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个目的在于 提供了一种NK细胞的培养技术，旨在降低了 NK细胞的培养成本。
[0006] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0007] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种NK细胞的培养方法，其特征在于，包 括以下步骤：
[0008] (1)从人外周血中分离单个核细胞；
[0009] (2)将单个核细胞接种到适合淋巴细胞培养的培养基中，加入CD3单克隆抗体，重 组人白细胞介素2,自体血浆，培养3-5天；
[0010] (3)加入重组人白细胞介素2,自体血衆，培养；
[0011] ⑷收获NK细胞。
[0012] 另外，根据本发明上述实施例提供的一种NK细胞的培养方法，还可以具有如下附 加的技术特征：
[0013] 根据本发明的实施例，所述适合淋巴细胞培养的培养基为AM-V培养基；X-VIVO 15培养基；H3培养基；GT-T551培养基；Alys-505N无血清培养基 ；RPMI1640+10%FBS培养 基；AM-V培养基；X-VIVO 15培养基和ALyS505NK培养基中的一种。
[0014] 根据本发明的实施例，所述步骤（2)中⑶3单克隆抗体的浓度为50~300ng/mL。
[0015] 根据本发明的实施例，所述重组人白细胞介素-2的浓度为300-600U/mL。
[0016] 根据本发明的实施例，所述自体血浆的浓度为0~5%。
[0017] 根据本发明的实施例，所述步骤（3)中的培养为扩瓶培养。
[0018] 根据本发明的实施例，所述步骤（3)中的培养为培养袋培养。
[0019] 根据本发明的实施例，所述步骤（3)中的培养至少5天。
[0020] 根据本发明的实施例，所述方法得到的细胞主要由表型为CD3-CD56+的自然杀伤 细胞组成。
[0021] 本发明的技术效果为：
[0022] 1、本发明选用廉价的培养基培养单核细胞，大大降低了成本，同时还保证了 NK细 胞的扩增倍数和细胞毒性；
[0023] 2、本发明仅用了两种细胞因子即CD3单克隆抗体和重组人白细胞介素2就实现了 对NK细胞的激活和扩增。
[0024] 3、本发明在不加入任何血清时，同样能实现对NK细胞的激活和扩增，还避免了过 多外界物质的介入影响了 NK细胞；
[0025] 4、本发明操作简便，加入因子种类少，节省了操作时间的同时减少了操作失误的 可能性，使细胞的获得效率更高且安全性更好。
[0026] 总之，本发明提供的一种NK细胞培养方法既保证了 NK细胞的扩增倍数和细胞毒 性，又大大降低了 NK细胞的培养成本。
[0027] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0028] 图1是血液来源的单核细胞未经诱导前NK含量图；
[0029] 图2是本发明提供的一种NK细胞培养方法进行培养后达到的效应细胞图；
[0030] 图3是常规方法进行培养后达到的效应细胞图。
[0031]图4是本发明与常规培养方法NK细胞扩增倍数的比较图。
[0032] 图5是本发明与常规培养方法所得NK细胞对K562细胞杀伤性的比较图。
[0033] 图6是使用本发明培养NK细胞的方法培养的NK细胞第5天的细胞图。
[0034] 图7是使用本发明培养NK细胞的方法培养的NK细胞第10天的细胞图。
[0035] 图8是使用本发明培养NK细胞的方法培养的NK细胞第15天的细胞图。
【具体实施方式】
[0036] 下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅 用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0037] 实施例1
[0038] 来自外周血液的NK细胞培养
[0039] 材料与方法
[0040] 本发明中用到的RPMI-1640培养基选自GIBCO公司，重组人IL-2从市场购买而 来。
[0041] 步骤a:自体血浆的制备
[0042] 在生物安全柜中将注射器中的40mL-60mL抗凝全血平均分装到2支50mL无菌离 心管中，用离心机离心，离心转速为2500rpm，离心10min，离心完成后吸取上层血浆，56°C， 30min灭活补体，置于4°C水浴中放置15分钟，再用离心机离心，离心速度为2500rpm，离心 20分钟，转移上清液至新的离心管。标记，置于-20°C冰箱中保存；
[0043] 步骤b:单个核细胞的分离
[0044] 向步骤a中所述的离心后未被吸取的血细胞中加入缓冲盐溶液25mL，稀释血细 胞，边吹打边旋转离心管，混匀。取30mL混匀的稀释血缓慢加到装有淋巴细胞分离液的 50mL离心管内。用离心机离心，离心转速为2100rpm离心30分钟