胰岛样细胞的培养液及培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及胰岛样细胞的培养液及培养方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种体内糖代谢紊乱引起的健康问题。I型糖尿病患者通常依靠胰岛素 皮下注射等措施维持体内的糖代谢功能，但只治标而不治本。而目前中国糖尿病患者超过 4100万人，30岁以上人群糖尿病的发病率达到5%。而胰岛细胞移植则是一个比较理想的 根治糖尿病的方法。但是该方法每次移植需要2-4个供体胰腺，而受制于伦理学以及传统 观念，供体短缺严重，完全不足以满足I型糖尿病患者的需求。
[0003] 理论上讲，胰岛β细胞可来源于多能干细胞（主要是胚胎干细胞）或它的直接前 体细胞（胰导管细胞），还可来源于其它组织特异性干细胞的横向分化。Ramiya等从未发病 的成年非肥胖糖尿病（NOD)小鼠的胰导管上皮结构中分离出胰腺干细胞，经过长期体外培 养，能诱导分化为Langerhans'胰岛，证明成年胰导管上皮细胞具有干细胞的特性。最近， Zulewski等发现，人和大鼠胰岛中均存在Nestin染色阳性的细胞，这些细胞具有干细胞的 特性，在体外培养中能分化成胰腺外分泌细胞、导管细胞和内分泌细胞以及肝细胞。因此， 除了胰腺导管外，胰岛中也存在多潜能的胰岛前体细胞。
[0004] 因此如果能在体外大规模培养胰岛干细胞，则能提供大量的胰岛细胞，从而为胰 岛移植提供足够的种子细胞。并且由于胰岛干细胞的免疫原性较低，在移植到患者体内可 以减少排斥反应，增加移植成功率，也可以减少免疫抑制剂的使用，从而减少对身体以及胰 岛细胞的毒害作用，增加远期疗效。
[0005] 然而现有技术对胰岛细胞的培养效果并不理想，体外培养的胰岛细胞通常增殖能 力较差，且其中具有分化功能的胰岛干细胞数量少，不同批次培养的干细胞的稳定性也很 难保证。并且现有技术中，胰岛细胞传代非常困难，通常P4代后，细胞便不再增殖且干细胞 特性消失。并且，现有技术为了维持细胞的活性和稳定性，通常在培养基中添加了异源血 清，大大增加了移植过程中人体排异反应的风险。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供胰岛样细胞的培养液及培养方法。 以本发明提供的培养液培养胰岛细胞，细胞增殖能力前，具有分化功能的胰岛干细胞数量 较多，且未添加异种血清。
[0007] 本发明提供的胰岛样细胞培养液，包括基础培养液、转铁蛋白、牛血清白蛋白、纤 粘连蛋白、硒酸、孕酮、丙酮酸钠、胰岛素和rox-i。
[0008] PDX-I即胰-十二指肠同源框-1，现已知rox-ι在胰腺的生长发育过程中不仅是 β细胞中胰岛素基因的转录因子，而且对于β细胞的分化表达及延缓β细胞的自身凋亡 方面也起到关键作用。
[0009] 孕酮又称黄体酮，为孕激素。在细胞培养中作为促进细胞生长的附加成分添加在 培养基中。
[0010] 胰岛素能够促进细胞生长，提高细胞对葡萄糖的利用率。
[0011] 牛血清白蛋白在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用 和载体作用。
[0012] 转铁蛋白又名运铁蛋白（transferrin，TRF，siderophilin)是血衆中主要的含铁 蛋白质，能结合铁离子，减少铁离子对细胞的毒性，促进细胞的生长。
[0013] 纤粘连蛋白（fibronectin，FN)，广泛存在于动物组织和组织液中，是一种大分子 糖蛋白，具有多种生物活性，添加在培养基中能够促进细胞的贴壁。
[0014] 硒酸，分子式为H2SeO4，提供给细胞硒元素，硒是谷胱甘肽过氧化物酶的必需成分， 并与能量代谢、糖脂代谢关系密切。
[0015] 丙酮酸钠的分子式为CH3COCOONa,丙酮酸为细胞代谢必须物质，是糖代谢的底物， 用于提供碳源。
[0016] 本发明将上述物质添加在基础培养液中用以胰岛样细胞的原代培养，结果显示， 在原代培养中，细胞生长良好，细胞贴壁迅速、能够很好的分离胰岛样细胞与其他胰腺细 胞。
[0017] 在本发明的实施例中，其中各组分的含量为：转铁蛋白2mmol/L~4mmol/L、牛血 清白蛋白40 μ g/mL~60 μ g/mL、纤粘连蛋白4 μ g/mL~6 μ g/mL、硒酸2mmo1 /T,~3mmol/ L、孕酬 3mmol/L ~5mmol/L、丙酬酸纳 40ng/mT,~60ng/mL、膜岛素 15ng/mL ~25ng/mL、 PDX_115ng/mL ~35ng/mL〇
[0018] 在一些实施例中，其中各组分的含量为：转铁蛋白3mmol/L、牛血清白蛋白50 μ g/ mL、纤粘连蛋白5 μ g/mL、硒酸2. 5mmol/L、孕酮4mmol/L、丙酮酸钠50ng/mL、胰岛素20ng/ mL、PDX-115ng/mL 〇
[0019] 在本发明的实施例中，本发明提供的培养液中还包括碱性成纤维生长因子和表皮 生长因子。
[0020] 碱性成纤维生长因子（bFGF)在体内具有潜在的促血管生成活性。
[0021] 表皮细胞生长因子（EGF)在体内能够促进皮肤及角膜中表皮细胞的生长。
[0022] 本发明将bFGF和EGF添加在培养液中，用于胰岛样细胞的传代培养，实现显示，在 传代培养过程中，细胞增殖旺盛，且具有分化功能的胰岛干细胞数量较多。经传代6代，细 胞仍呈对数增殖，且细胞数量扩增了 613倍。
[0023] 在本发明的实施例中，其中碱性成纤维生长因子的含量为15ng/mL~25ng/mL ;表 皮生长因子的含量为15ng/mL~25ng/mL。
[0024] 在一些实施例中，其中碱性成纤维生长因子的含量为20ng/mL ;表皮生长因子的 含量为20ng/mL。
[0025] 在本发明的实施例中，基础培养液为DMEM/F12培养液。
[0026] DMEM/F12培养液为一种无血清培养基，本发明提供的培养液中也不包含异源血 清，从而降低了细胞移植后人体发生排异反应的风险。
[0027] 本发明还提供了一种胰岛样细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0028] 步骤1 :以培养液1重悬胰腺细胞至密度为I X IO5个/mL~I X 10 6个/mL，培养 Ih后，转移未贴壁细胞；
[0029] 步骤2 :将所述未贴壁细胞以培养液1培养24h后，弃除未贴壁细胞及培养液1，获 得贴壁细胞；
[0030] 步骤3 :将所述贴壁细胞以培养液1培养至细胞融合度为70%~90%后，以培养 液2传代培养；
[0031] 培养液1包括：基础培养液、转铁蛋白、牛血清白蛋白、纤粘连蛋白、砸酸、孕酬、丙 酮酸钠、胰岛素和rox-i;
[0032] 培养液2包括：基础培养液、转铁蛋白、牛血清白蛋白、纤粘连蛋白、硒酸、孕酮、丙 酮酸钠、胰岛素、PDX-1、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子。
[0033] 在本发明的实施例中，培养液1中各组分的含量为：转铁蛋白2mmol/L~4mmol/ L、牛血清白蛋白40 μ g/mL~60 μ g/mL、纤粘连蛋白4 μ g/mL~6 μ g/mL、硒酸2mmol/L~ 3mmol/L、孕酬 3mmol/L ~5mmol/L、丙酬酸纳 40ng/mT,~60ng/mL、膜岛素 15ng/mL ~25ng/ mL、PDX_115ng/mL ~35ng/mL〇
[0034] 在一些实施例中，培养液I中各组分的含量为：转铁蛋白3mmol/L、牛血清白蛋白 50 μ g/mL、纤粘连蛋白5 μ g/mL、硒酸2. 5mmol/L、孕酮4mmol/L、丙酮酸钠50ng/mL、胰岛素 20ng/mL、PDX-115ng/mL〇
[0035] 在本发明的实施例中，培养液2中各组分的含量为：转铁蛋白2mmol/L~4mmol/ L、牛血清白蛋白40 μ g/mL~60 μ g/mL、纤粘连蛋白4 μ g/mL~6 μ g/mL、硒酸2mmol/L~ 3mmol/L、孕酬 3mmol/L ~5mmol/L、丙酬酸纳 40ng/mT,~60ng/mL、膜岛素 15ng/mL ~25ng/ mL、roX-llSng/mL~35ng/mL、碱性成纤维生长因子15ng/mL~25ng/mL ;表皮生长因子 15ng/mL ~25ng/mL〇
[0036] 在一些实施例中，培养液2中各组分的含量为：转铁蛋白3mmol/L、牛血清白蛋白 50 μ g/mL、纤粘连蛋白5 μ g/mL、硒酸2. 5mmol/L、孕酮4mmol/L、丙酮酸钠50ng/mL、胰岛素 20ng/mL、PDX-115ng/mL、碱性成纤维生长因子20ng/mL、表皮生长因子20ng/mL。
[0037] 在本发明的实施例中，基础培养液为DMEM/F12培养液。
[0038] 在本发明的实施例中，传代培养的次数为6次。
[0039] 在本发明的实施例中，胰腺细胞的制备方法为：将胰腺组织以四型胶原酶消化后 以PBS洗涤制得胰腺细胞。
[0040] 在本发明的实施例中，胰腺细胞为SD大鼠胰腺细胞。
[0041] 在一些实施例中，胰腺细胞的制备方法为：摘取4~7周龄SD大鼠胰腺，用PBS清 洗2遍后剪碎，按照5倍体积加入浓度为lg/L四型胶原酶，37°C震荡消化50分钟后加入等 体积的PBS稀释消化液，然后用200目滤网过滤，2000g离心5分钟，弃除上清，获得胰腺细 胞。
[0042] 在一些实施例中，步骤1具体为，以培养液1重悬胰腺细胞至细胞密度为I X IO5个 /mL~IX IO6个/mL，37°C 5% CO2培养箱中培养1小时，转移未贴壁细胞。
[0043] 在一些实施例中，步骤2具体为将未贴壁细胞于37°C 5% CO2培养24小时，弃去 未贴壁细胞以及上清液，加入与弃去上清液等量的培养液37°C 5% 0)2继续培养，每3天全 量换液一次，培养至细胞融合度达到80%。
[0044] 在一些实施例中，传代培养具体为：将贴壁细胞以PBS清洗2遍，加入含有质量分 数为0. 4%的EDTA的浓度为0. 25%的胰酶消化细胞1分钟，加入5倍于消化液体积的培养 液2终止消化，离心去后去除上清液，用培养液2按照I X IO5~I X 10 6AiL的密度重悬细 胞，转入新的培养瓶中37°C 5% CO2培养，记为Pl代。重复该过程直到传至P6代。
[0045] 本发明提供的方法利用不同的培养液分别对胰腺细胞进行原代培养