一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽用生物制品领域，更具体地说，涉及一种适用于无血清培养系统的 vero细胞驯化方法及其在猪流行性腹泻病毒增殖培养方法中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，国内在动物疫苗的生产过程中，传代细胞及病毒的增殖培养大多含有牛血 清。因为牛血清是天然培养基，所以其来源有限，价格连年上涨，增加了疫苗生产的原材料 成本；牛血清组分不明确、不稳定，批次间的差异影响了疫苗产品的稳定性；另外，血清供 应链存在一定风险，有潜在的外源病原污染风险。而无血清（VP-SFM)培养系统无动物源成 分、无蛋白及蛋白水解物、无生长因子并且化学成分明确、原料安全、供应链广。用无血清培 养动物细胞进行病毒繁殖、疫苗生产是目前生物医药产业新技术的发展方向。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种适用于无血 清培养系统的vero细胞驯化方法及其在猪流行性腹泻病毒增殖培养方法中的应用。
[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种适用于无血清培养系统的 vero细胞驯化方法，将冻存的vero细胞复苏后置于血清培养基中培养，并采用逐步降低血 清含量的方法驯化vero细胞。
[0005] 本发明所述的适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法，其中，包括以下步 骤：
[0006] (1)将冻存的vero细胞复苏；
[0007] (2)将复苏后的vero细胞置于血清培养液中进行培养，待vero细胞长满单层时， 加入消化液I，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:3进行消 化传代培养；
[0008] (3)将步骤（2)得到的vero细胞置于混合培养液I中进行培养，待vero细胞长 满单层时，加入消化液I，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为 1:(2-3)进行消化传代培养；
[0009] (4)将步骤（3)得到的vero细胞置于混合培养液II中进行培养，待vero细胞长 满单层时，加入消化液I，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为 1:(2-3)进行消化传代培养；
[0010] (5)将步骤（4)得到的vero细胞置于混合培养液III中进行培养，待vero细胞长 满单层时，加入消化液II，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为 1:(2-3)进行消化传代培养；
[0011] (6)将步骤（5)得到的vero细胞置于无血清培养液中进行培养，待vero细胞长 满单层时，加入消化液II，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为 I: (2-3)进行消化传代培养，即得适用于无血清培养系统的ver〇细胞。
[0012] 本发明所述的适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法，其中，所述血清培养 液为含体积百分数为8%的胎牛血清的DMEM培养液；所述无血清培养液为含4mM的L-谷 氨酰胺的VP-SFM培养液；所述混合培养液I是由体积百分数为80%的血清培养液和体积 百分数为20 %的无血清培养液组成的混合培养液；所述混合培养液II是由体积百分数为 50%的血清培养液和体积百分数为50%的无血清培养液组成的混合培养液；所述混合培 养液III是由体积百分数为20 %的血清培养液和体积百分数为80 %的无血清培养液组成的 混合培养液。在细胞驯化过程中，配制混合培养液时，应先分别将血清营养液及无血清营养 液配制好后，再按照不同比例混合。
[0013] 本发明所述的适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法，其中，所述胎牛血清 购自gibco公司，批号为1128144 ;所述DMEM培养液购自Hyclone公司，批号为NZHl 194 ;所 述VP-SFM培养液购自gibco公司，批号为1637720 ;所述L-谷氨酰胺购自Sigma公司，批 号为 WXBB6280v。
[0014] 本发明所述的适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法，其中，所述消化液 I为由质量百分数为〇. 25 %的胰酶和质量分数为0. 02 %的EDTA的Hanl s液组成的 EDTA-胰酶消化液；所述消化液II为TrypLE select，购自gibco公司，批号为1596842。
[0015] 本发明还提供一种猪流行性腹泻病毒在无血清培养系统中的增殖培养方法，包括 如下步骤：
[0016] (1)将经权利要求1所述的驯化方法培养得到的vero细胞置于VP-SFM培养液中 培养，待适应VP-SFM培养液的vero细胞长成单层细胞后，倾去VP-SFM培养液上清，以体积 分数为1-3%的剂量接入猪流行性腹泻病毒，吸附1小时后，加入维持液；然后置于37°C体 积百分数为5%的CO 2培养箱中培养，每天观察单层细胞的病变情况；当70%以上单层细胞 出现病变时，将单层细胞冻融2-3次，收获病毒液，标记为病毒液Fl代；
[0017] (2)将步骤⑴中的病毒液Fl代再以体积分数为1-3 %的剂量接入适应VP-SFM 培养液的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液，置于37°C体积百分数为5% 的CO2培养箱中培养，当70%以上单层细胞出现病变时，将单层细胞冻融2-3次，收获病毒 液，标记为病毒液F2代；
[0018] (3)将步骤⑵中的病毒液F2代以体积分数为1-3 %的剂量接入适应VP-SFM的 长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液，置于37°C体积百分数为5%的0) 2培 养箱中培养，当70 %以上单层细胞出现病变时，将单层细胞冻融2-3次，收获病毒液，标记 为病毒液F3代。
[0019] 本发明所述的猪流行性腹泻病毒在无血清培养系统中的增殖培养方法，其中，所 述维持液由体积百分数为0-80 %的DMEM培养液和体积分数为20-100 %的含4mM的L-谷 氨酰胺的VP-SFM培养液组成的混合培养液。
[0020] 本发明所述的猪流行性腹泻病毒在无血清培养系统中的增殖培养方法，其中，所 述DMEM培养液购自Hyclone公司，批号为NZHl 194 ;所述VP-SFM培养液购自gibco公司， 批号为1637720 ;所述L-谷氨酰胺购自Sigma公司，批号为WXBB6280V。
[0021] 实施本发明的一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法及其在猪流行性 腹泻病毒增殖培养方法中的应用，具有以下有益效果：
[0022] (1)采用逐渐减少血清含量的无血清培养方法对vero细胞进行驯化培养，以使 vero细胞能适应无血清培养的环境，得到一种能适应无血清培养的vero细胞；驯化后的 vero能在VP-SFM中连续传代培养至少50代。
[0023] (2)将猪流行性腹泻病毒（PEDV毒）接种在经上述方法驯化后的适应VP-SFM的 vero中进行传代增殖培养，摸索其在不含血清条件下的培养增殖条件。结果显示，在经驯化 后的vero中，当病毒维持液为由体积分数为80 %的DMEM培养液及体积分数为20 %的无血 清培养液组成的混合营养液时，PEDV毒能在该无血清条件下连续传代培养3代，均能产生 明显细胞病变，病毒含量可达l〇 7 33TCID5(l/ml，与有血清培养的PEDV毒的毒价相当。所述无 血清培养液为含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM培养液。
【附图说明】
[0024] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0025] 图1是经驯化后的vero细胞在无血清培养液，即含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM 中传代增殖培养50代时的细胞形态图；
[0026] 图2是正常的未经驯化的vero细胞在含8%胎牛血清的DMEM液中传代增殖培养 50代时的细胞形态；
[0027] 图3是在经驯化后的vero细胞中培养的PEDV毒产生的细胞病变图（维持液为含 体积百分数为80%的DMEM的无血清培养液）；
[0028] 图4是在经驯化后的vero细胞中培养的PEDV毒产生的细胞病变图（维持液为含 体积百分数为50 %的DMEM的无血清培养液）；
[0029] 图5是在未经驯化的vero细胞中培养的PEDV毒产生的细胞病变图（维持液为含 体积百分数为2%的胎牛血清的DMEM液）；
[0030] 图6是未接PEDV毒的经驯化的vero细胞形态对照图。
【具体实施方式】
[0031] 下面，结合附图以及【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0032] 实施例1
[0033] -种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方