一种培养Vero细胞用的无血清培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制品领域，涉及一种培养Vero细胞用的无血清培养基及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 自1995年WHO呼吁采用细胞为基质生产疫苗，细胞培养在疫苗生产过程中发挥的 作用越来越受人们的重视。而过去，在使用血清培养细胞的过程中，增加了细胞表达产物安 全性的不确定因素，并且采用含血清的培养基进行细胞的培养，可能由于血清的存在导致 过敏反应发生、批次间差异大、易受污染和成本较高等缺点，这一现实问题已经成为动物细 胞无血清培养技术研究和应用的发展动力。随着无血清培养技术的不断进步，无血清培养 已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。
[0003] Vero细胞是WHO允许用于疫苗生产的细胞株，它对多种病毒敏感，是现阶段病毒疫 苗生产的最主要的细胞基质。Vero细胞无血清培养技术提高了病毒疫苗生产工艺的可靠 性、产品质量的可控性和安全性。目前，Vero细胞无血清培养已在包括狂犬病疫苗、流行性 乙型脑炎疫苗、流感疫苗、肾综合征出血热疫苗、甲型肝炎疫苗、呼肠病毒疫苗等的研发和 生产中得到应用。
[0004] 无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，既能满 足细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因此，发展无血清培养 基是细胞走向临床应用的重要条件。目前已有一些市售的无血清培养基，如Sigma公司的 EX-CELL MDCK和GIB⑶公司的VP-SFM，但是现有市售无血清培养基存在细胞贴壁性差、细胞 增殖不够理想、价格昂贵、成分不明等缺陷。
[0005] 中国专利申请号为200710187466.7的专利，公开了一种用于Vero细胞的培养基及 其培养方法，该培养基以SFM为基础培养基，添加的细胞因子及其他组分50多种，组分非常 复杂。
[0006] 因此，现有技术存在细胞贴壁性差，组分过于复杂，细胞增殖速率不够理想等问 题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种质量可控、安全可靠、成分简单的培养Vero细胞用的 无血清培养基及其制备方法。
[0008] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下： 一种培养Vero细胞用的无血清培养基，其特征在于:所述培养基由以下按体积百分数 计的成分组成:基础培养液85-95%、氨基酸溶液2-5%、血清替代因子溶液2-7%、抗氧化剂溶 液0.1-0.5%、酵母抽提物溶液0.8-2%、乙醇胺溶液0.1-0.5%; 所述基础培养液选自MEM培养基、DMEM培养基、DMEM-F12培养基（1:1)、HB培养基、BEM培 养基中的一种； 所述氨基酸溶液中的溶剂为基础培养液，溶质由以下重量的成分组成:赖氨酸0.5-lg、 色氨酸〇. 5-1.5g、苯异亮氨酸0.5-lg、缴氨酸0.5-lg、亮氨酸0.5-1.5g、甘氨酸o-lg、异亮氨 酸0.5-1.5g、苏氨酸0-1 g、丝氨酸0.5-lg、精氨酸0.5-lg、天冬氨酸0-1 g和谷氨酰胺0.5-lg; 所述血清替代因子溶液中溶剂为基础培养液，溶质为生长因子、结合蛋白和贴壁因子 中的一种或几种组合； 所述抗氧化剂溶液中溶剂为基础培养液，溶质为抗坏血酸、谷胱甘肽、维生素 E、类胡萝 卜素、尿酸、枸橼酸、EDTA、泛醌和多酚类抗氧化剂中的一种； 所述酵母抽提物溶液溶剂为PBS，溶质为酵母提取物； 所述乙醇胺溶液溶剂为PBS，溶质为乙醇胺。
[0009] 进一步地，所述抗氧化剂溶液的浓度为0.5-2mg/L; 所述酵母抽提物溶液的浓度为4-10mg/L; 所述乙醇胺溶液的浓度为〇. 5-2mL/L。
[0010] 进一步地，所述血清替代因子的溶质由生长因子、结合蛋白和贴壁因子以配比为 (0 · 2-1): (0-1): (0 · 4-1)混合所得的混合物。
[0011] 进一步地，所述生长因子为胰岛素、白介素-2、表皮生长因子、成纤维生长因子、皮 质醇和甲状腺激素中的一种或几种组合； 所述结合蛋白为转铁蛋白、磷蛋白、脂蛋白、糖蛋白、金属蛋白和色蛋白中的一种或几 种组合； 所述贴壁因子为鱼精蛋白、聚赖氨酸、糖蛋白、球蛋白和脂蛋白中的一种或几种组合。
[0012] 优选地，一种培养Vero细胞用的无血清培养基，其特征在于:所述培养基由以下按 体积百分数计的成分组成:基础培养液90%、氨基酸溶液4%、血清替代因子溶液5%、抗氧化剂 溶液0.1%、酵母抽提物溶液0.8%、乙醇胺溶液0.1%; 所述氨基酸溶液中的溶剂为基础培养液，溶质由以下重量的成分组成:赖氨酸〇.5g、色 氨酸lg、苯异亮氨酸〇.5g、缴氨酸lg、亮氨酸lg、甘氨酸0.5g、异亮氨酸lg、苏氨酸0.5g、丝氨 酸0.5g、精氨酸1 g、天冬氨酸0.5g和谷氨酰胺0.5g; 所述血清替代因子的溶质由皮质醇、转铁蛋白和鱼精蛋白以配比为0.5:0.5:0.8混合 所得的混合物； 所述抗氧化剂溶液的溶剂为基础培养液，溶质为谷胱甘肽，浓度为lmg/L; 所述酵母抽提物溶液的溶剂为PBS，溶质为酵母抽提物，浓度为6mg/L; 所述乙醇胺溶液的的溶剂为PBS，溶质为乙醇胺，浓度为0.5mL/L。
[0013] 相应地，本发明还提供该培养Vero细胞用的无血清培养基的制备方法，其特征在 于，所述制备方法步骤为:分别取配方量的基础培养液、氨基酸溶液、血清替代因子溶液、抗 氧化剂溶液、酵母抽提物溶液和乙醇胺溶液，混合，即得； 所述氨基酸溶液由如下方法制成:取配方量的赖氨酸、色氨酸、苯异亮氨酸、缬氨酸、亮 氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺，然后溶在配方量的 基础培养液，即得； 所述血清替代因子溶液由如下方法制成：取配方量的由生长因子、结合蛋白和贴壁因 子，溶解于配方量的基础培养液，即得： 所述抗氧化剂溶液由如下方法制成:取抗氧化剂，溶解于基础培养液，配成浓度为ο. 5-2mg/L的溶液，即得： 所述酵母抽提物溶液由如下方法制成:取酵母抽提物，溶解于PBS，配成浓度为4-10mg/ L的溶液，即得； 所述乙醇胺溶液由如下方法制成：取乙醇胺，溶解于PBS，配成浓度为0.5-2mlVL的溶 液，即得。
[0014] 此外，本发明还提供该培养Vero细胞用的无血清培养基在Vero细胞培养中的用 途。
[0015] 与现有的技术相比，本发明具有以下技术优势： 本发明提供了一种培养Vero细胞用的无血清培养基，与市售的无血清培养基相比，本 发明提供的培养基能够促进Vero细胞的快速贴壁，培养的Vero细胞能够保持较好的细胞形 态，具有更好的细胞增殖速率，且本发明无血清培养基组分简单，降低了成本。此外，本发明 提供的制备方法简单，制得的无血清培养基用于Vero细胞的培养，培养获得的细胞表现出 优异的细胞性能。
【具体实施方式】
[0016] 本领域技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发 明的实践中发挥良好作用的技术。然而，在所公开的具体实施方案中可以做出许多改变，并 仍然获得相同或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。
[0017] 实施例！ 一种培养Vero细胞用的无血清培养基由以下按体积百分数计的成分组成:基础培养液 90%、氨基酸溶液4%、血清替代因子溶液5%、抗氧化剂溶液0.1%、酵母抽提物溶液0.8%、乙醇 胺溶液0.1%; 所述氨基酸溶液中的溶剂为基础培养液，溶质由以下重量的成分组成:赖氨酸〇.5g、色 氨酸lg、苯异亮氨酸〇.5g、缴氨酸lg、亮氨酸lg、甘氨酸0.5g、异亮氨酸lg、苏氨酸0.5g、丝氨 酸0.5g、精氨酸1 g、天冬氨酸0.5g和谷氨酰胺0.5g; 所述血清替代因子的溶质由皮质醇、转铁蛋白和鱼精蛋白以配比为0.5:0.5:0.8混合 所得的混合物； 所述抗氧化剂溶液的溶剂为基础培养液，溶质为谷胱甘肽，浓度为lmg/L; 所述酵母抽提物溶液的浓度为6mg/L; 所述乙醇胺溶液的浓度为〇. 5mL/L。
[0018]该培养Vero细胞用的无血清培养基的制备方法，其步骤为:分别取配方量的基础 培养液、氨基酸溶液、血清替代因子溶液、抗氧化剂溶液、酵母抽提物溶液和乙醇胺溶液，混 合，即得； 其中氨基酸溶液制备方法为:取配方量的赖氨酸、色氨酸、苯异亮氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、甘氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺，然后溶在配方量的基 础培养液，即得； 血清替代因子溶液制备方法为:取配方量的由生长因子、结合蛋白和贴壁因子，溶解于 配方量的基础培养液，即得： 抗氧化剂溶液制备方法为:取谷胱甘肽，溶解于基础培养液，配成浓度为lmg/L的溶液， 即得： 酵母抽提物溶液制备方法为:取酵母抽提物，溶解于PBS，配成浓度为6mg/L的溶液，即 得； 乙醇胺溶液制备方法为:取乙醇胺，溶解于PBS，配成浓度为0.5mL/L的溶液，即得。
[0019] 实施例2 一种培养Vero细胞用的无血清培养基由以下按体积百分数计的成分组成:基础培养液 92%、氨基酸溶液2%、血清替代因子溶液5%、抗氧化剂溶液0.2%、酵母抽提物溶液0.7%、乙醇 胺溶液0.1%; 所述氨基酸溶液中的溶剂为基础培养液，溶质由以下重量的成分组成:赖氨酸lg、色氨 酸0.5g、苯异亮氨酸lg、缴氨酸0.5g、亮氨酸0.5g、甘氨酸lg、异亮氨酸lg、苏氨酸0.5g、丝氨 酸1 g、精氨酸〇. 5g、天冬氨酸0.5g和谷氨酰胺0.5g; 所述血清替代因子的溶质由胰岛素、色蛋白和聚赖氨酸以配比为0.4:0.2:0.6混合所 得的混合物； 所述抗氧化剂溶液的溶剂为基础培养液，溶质为类胡萝卜素，浓度为〇. 5mg/L; 所述酵母抽提物溶液的浓度为8mg/L; 所述乙醇胺溶液的浓度为〇. 8mL/L。
[0020] 制备方法参考实施例1。
[0021] 实施例3 一种培养Vero细胞用的无血清培养基由以下按体积百分数计的成分组成:基础培养液 92%、氨基酸溶液3%、血清替代因子溶液4%、抗氧化剂溶液0.