一种用于培养病毒的无血清培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制品领域，涉及一种用于培养病毒的无血清培养基及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 二十世纪以来，细胞培养技术已成为工业化生产生物活性物质、疫苗、载体，如单 克隆抗体、药用蛋白质、基因工程药物等常用的手段，细胞培养技术与基因工程技术、酶工 程技术和发酵工程技术密切相关，在整个生物技术产业的发展中起到了关键的核心作用。 此外细胞培养技术的日臻完善，促进蛋白质表达纯化技术、病毒培养技术等的发展。从当前 发展趋势来看，细胞悬浮培养、无血清培养是近年来生物技术产业化发展的方向。
[0003] 目前，许多兽用疫苗都通过细胞培养来进行生产，在生产过程往往需要使用血清， 而血清的存在增加了细胞表达产物安全性的不确定因素，具有可能导致过敏反应、批次间 差异大、易受污染和成本较高等缺点。此外，血清中成分较为复杂，多含有分子量较大的组 分，影响病毒的分离纯化，且容易被支原体感染，这一现实问题已经成为动物细胞无血清培 养技术研究和应用发展动力。随着无血清培养技术的不断进步为动物细胞大规模无血清培 养技术的应用提供了必要的技术支撑，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生 产的总趋势。
[0004] 无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，既能满 足病毒的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因此，发展无血清培养 基是利用病毒生产疫苗重要条件。目前已有一些市售细胞培养的无血清培养基，但是现有 市售无血清培养基存在细胞增殖不够理想、价格昂贵等缺陷。
[0005] 中国专利申请号为201410467191.2的发明专利申请文件，无血清培养基及其用途 和一种猪病毒的培养方法，该无血清培养基以MEM为基础培养基，添加的氨基酸及其他组分 多达45种，组分非常复杂。
[0006] 因此，现有技术存在细胞贴壁性差，组分过于复杂，细胞增殖速率不够理想等问 题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种便于病毒繁殖、质量可控、安全可靠用于培养病毒的 无血清培养基及其制备方法。
[0008] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下： 一种用于培养病毒(本发明中的培养病毒是指将病毒接种到宿主细胞后，移种到培养 基中，病毒在宿主细胞中进行繁殖，最后使宿主细胞裂解的过程)的无血清培养基由以下重 量百分数计的组分制备而成：80-90%培养液、4-10%氨基酸、3-10%血清替代因子和0. Οδ-Ο. 5% 抗氧化剂； 所述培养液选自MEM培养基、DMEM培养基、DMEM-F12培养基（1:1)、ΗΒ培养基、ΒΕΜ培养基 中的一种； 所述氨基酸由以下重量的组分组成:赖氨酸l_2g、色氨酸1.5-2g、苯异亮氨酸0.5-lg、 结页氨酸〇 .5-2g、苏氨酸1-1.5g、亮氨酸0.5-lg、甘氨酸O-lg、异亮氨酸0-1.5g、丝氨酸0.5-lg、天冬氨酸0.5-1.5g、精氨酸0.5-lg和谷氨酰胺0-1.5g; 所述血清替代因子为生长因子、结合蛋白和贴壁因子一种或几种； 所述抗氧化剂为抗坏血酸、谷胱甘肽、维生素 E、类胡萝卜素、尿酸、枸橼酸、EDTA、泛醌和 多酚类抗氧化剂中的一种或几种。
[0009] 进一步地，所述生长因子为胰岛素、白介素-2、表皮生长因子、成纤维生长因子、皮 质醇和甲状腺激素中的一种或几种； 所述结合蛋白为转铁蛋白、磷蛋白、脂蛋白、糖蛋白、金属蛋白和色蛋白中的一种或几 种； 所述贴壁因子为鱼精蛋白、聚赖氨酸、糖蛋白、球蛋白和脂蛋白中的一种或几种。
[0010] 进一步地，所述血清替代因子为生长因子、结合蛋白、贴壁因子和微量元素的混合 物。
[0011] 进一步地，所述血清替代因子为生长因子、结合蛋白和贴壁因子以（0.2-1) :(0-1) :(0.2-1) 配比混合所得的混合物。
[0012]优选地，一种用于培养病毒的无血清培养基，其特征在于，所述培养基由以下重量 百分数计的组分制备而成:90%培养液、5%氨基酸、5%血清替代因子和0.1%抗氧化剂； 所述氨基酸由以下重量的组分组成:赖氨酸lg、色氨酸1.5g、苯异亮氨酸0.5g、缬氨酸 〇.58、苏氨酸4、亮氨酸4、甘氨酸4、异亮氨酸0.58、丝氨酸0.58、天冬氨酸0.58、精氨酸 0.5g和谷氨酰胺0.5g; 所述生长因子为:皮质醇； 所述结合蛋白为:转铁蛋白； 所述贴壁因子为:鱼精蛋白； 所述血清替代因子为皮质醇、转铁蛋白和鱼精蛋白以〇. 8:1:1配比混合所得的混合物； 所述抗氧化剂为谷胱甘肽和枸橼酸以1:1配比组成的混合物。
[0013] 相应地，本发明还提供该用于培养病毒的无血清培养基的制备方法，其特征在于， 所述制备方法步骤为:分别取配方量的培养液、氨基酸、血清替代因子和抗氧化剂，混合，即 得。
[0014] 此外，本发明还提供用于培养病毒的无血清培养基在病毒培养中的用途。
[0015] 与现有的技术相比，本发明具有以下技术优势： 本发明用于培养病毒的无血清培养基，通过加入氨基酸、血清替代因子和抗氧化剂，与 培养液混合，所制得的培养基不存在由于血清的存在增加细胞表达产物不确定的因素，且 减少了去除血清中含有分子量较大的物质纯化步骤，降低后续疫苗纯化后的难度。病毒繁 殖结束后，通过离心去除宿主细胞碎片，然后进行简单的超滤即可将去除外源性的小分子 蛋白及其他物质，节约了操作步骤、简化了疫苗纯化的工艺，降低了生产成本;同时，在培养 液中加入抗氧化剂对细胞生长也具有促进作用，主要用于抑制培养过程中活性氧对细胞的 损伤，从而增加病毒产率。本发明提供的培养基制备方法操作简单、便于实现大规模生产的 需要。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1 一种用于培养病毒的无血清培养基由以下重量百分数计的组分制备而成:90% DMEM-F12培养基(1:1)、5%氨基酸、5%血清替代因子和0.1%抗氧化剂； 所述氨基酸由以下重量的组分组成:赖氨酸lg、色氨酸1.5g、苯异亮氨酸0.5g、缬氨酸 〇.58、苏氨酸4、亮氨酸4、甘氨酸4、异亮氨酸0.58、丝氨酸0.58、天冬氨酸0.58、精氨酸 0.5g和谷氨酰胺0.5g; 所述血清替代因子为皮质醇、转铁蛋白和鱼精蛋白以〇. 8:1:1配比混合所得的混合物； 所述抗氧化剂为谷胱甘肽和枸橼酸以1:1配比组成的混合物。
[0017] 该用于培养病毒的无血清培养基的制备方法，其步骤为：分别取配方量的DMEM-F12培养基、氨基酸、血清替代因子和抗氧化剂，混合，即得。
[0018] 实施例2 一种用于培养病毒的无血清培养基由以下重量百分数计的组分制备而成:85% DMEM培 养基、8%氨基酸、8%血清替代因子和0.1%抗氧化剂； 所述氨基酸由以下重量的组分组成:赖氨酸1 g、色氨酸2g、苯异亮氨酸0.8g、缬氨酸1 g、 苏氨酸1 g、亮氨酸lg、甘氨酸〇. 5g、异亮氨酸0.5g、丝氨酸0.5g、天冬氨酸0.5g、精氨酸0.5g 和谷氨酰胺〇.5g; 所述血清替代因子为甲状腺激素、转铁蛋白和聚赖氨酸以0.6:0.8:1配比混合所得的 混合物； 所述抗氧化剂为类胡萝卜素。
[0019] 该用于培养病毒的无血清培养基的制备方法，其步骤为:分别取配方量的DMEM培 养基、氨基酸、血清替代因子和抗氧化剂，混