一种多功能无血清细胞培养基及其应用
【专利摘要】本发明提供一种多功能无血清细胞培养基及其应用，本发明多功能无血清细胞培养基的组分及配制方法：将DMEM高糖培养基与F12营养培养基混合，加入B27添加剂、PC?1添加剂、基因重组人表皮生长因子以及青链霉素双抗。本发明培养基成分简单，可满足多次传代需要；更重要的是，该培养基既可用于原代真皮成纤维细胞及传代真皮成纤维细胞的体外快速扩增培养，又可以用于原代表皮细胞的培养。
【专利说明】
一种多功能无血清细胞培养基及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种多功能无血清细胞培养基及其应用，属于生物医学领域。
【背景技术】
[0002] 皮肤是人体面积最大的器官，承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能，使 体内各组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物的侵袭。遗传疾病、烧烫伤、慢 性皮肤创伤(如糖尿病）、白癜风、白化病等很多原因会对皮肤造成损害，影响皮肤美观、使 皮肤留下疤痕甚至失去生理功能。当皮肤受到严重损害，如深度的大面积烧烫伤时，皮肤不 能再进行自我恢复，会失去对细菌的抵御作用，导致大量细菌通过皮肤侵入人体，极易引发 全身感染而导致死亡。
[0003] 因此，创面的修复在现实生活及临床工作中有着重要的现实意义。随着组织工程 技术的发展，组织工程皮肤的出现为这一问题的解决提供了光明的前景。成纤维细胞 (Fibroblasts，Fbs)和人表皮细胞在创伤愈合中起至关重要的作用。例如，在组织工程皮肤 的构建过程中，在真皮层中，常加入自体和(或)异体的真皮成纤维细胞，以使构建的真皮层 具有细胞活性，从而促进表皮细胞的迀移和增殖，达到修复创面的目的。
[0004]在组织工程皮肤中，现有的细胞培养基用途单一，且有较大局限性。目前尚未有既 能用于真皮成纤维细胞的体外快速扩增，还可用于原代表皮细胞培养的培养基。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，我们发明了一种多功能无血清细胞培养基，该培养基中不 含血清，成分简单，可满足多次传代需要;更重要的是，该培养基既可用于原代真皮成纤维 细胞及传代真皮成纤维细胞的体外快速扩增培养，又可以用于原代表皮细胞的培养。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案如下：一种多功能无血清细胞培养基，以 500ml计，各组分的用量关系如下： DMEM高糖培养基 250ml
[0007] F12营养培养基 250ml B27添加剂 5-20 mi PC-I 添加剂 5..20 ml
[0008] 基因重组人表皮生长因子 1CM00 ul 青链霉素 Sml
[0009] 本发明培养基配制方法是:在超净工作台内，将DMEM高糖培养基与F12营养培养基 混合，加入B27添加剂、PC-I添加剂、基因重组人表皮生长因子以及青链霉素双抗。配制好的 培养基可以在4°C稳定保存3-4个月。
[0010] 本发明多功能无血清细胞培养基，不仅可以用于真皮成纤维细胞的体外快速扩 增，还可用于原代表皮细胞的培养。
[0011] 本发明多功能无血清细胞培养基用于真皮成纤维细胞的体外快速扩增具体包括 以下步骤：
[0012] (1)真皮成纤维细胞用IOml含双抗的F12培养基重悬洗细胞一次，1000 rpm离心 5min；
[0013] (2)弃上清，加 IOml本发明多功能无血清细胞培养基重悬细胞，接种于T75的培养 瓶中；
[0014] (3)将培养瓶放置于培养箱中培养，培养条件为36°c-38°c，4.5%-5.5%C〇2， 90 %-100 % 湿度；
[0015] (4)4天更换本发明多功能无血清细胞培养基一次。培养3-4天细胞汇合度可达 90%以上。
[0016] 所述步骤(1)真皮成纤维细胞如为冻存真皮成纤维细胞，则从液氮罐中取出细胞， 37°C水浴轻摇使其溶解;然后将溶解的细胞加入8ml含10%胎牛血清FBS的DMEM中，1000 rpm 离心5min;弃上清，然后用IOml含双抗的F12培养基重悬洗细胞一次，1000 rpm离心5min。
[0017] 所述步骤(4)待细胞汇合度达90%以上时，用本发明多功能无血清细胞培养基进 行细胞传代。
[0018]传代步骤是：
[0019 ] (5)将培养瓶中的多功能无血清细胞培养基吸走弃掉。
[0020] (6)用IOml PBS洗一次去除残留的血清。
[0021] (7)加含EDTA的0.05 %胰酶，每个T75培养瓶中加3ml胰酶，放在细胞培养箱中孵育 4_8min〇
[0022] (8)加 IOml含10%FBS的DMEM中和胰酶，将细胞吹下转移到离心管中。
[0023] (9) 1000 rpm 离心 5min。
[0024] (10)弃上清，用IOml含双抗的Fl 2重悬细胞，计数。1000 rpm离心5min。
[0025] (11)弃上清，用多功能无血清细胞培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中。此时， 细胞记为Pl代。
[0026] (12)将培养瓶放置于培养箱中培养，培养条件为36 °C-38 °C，4.5 %-5.5 %⑶2， 90%-100%湿度。培养4天后，Pl代真皮成纤维细胞的汇合度可达90%。
[0027] 本发明多功能无血清细胞培养基用于原代表皮细胞的培养，具体包括以下步骤：
[0028] (1)培养瓶用Coating Matrix预处理：将Coating Matrix(Gibco，R011k)0.5-3ml 加入培养瓶铺匀，室温静置IOmin，然后将瓶内多余液体弃掉；
[0029] (2)将成人或胚胎表皮细胞或多功能混合细胞用IOml含双抗的F12培养基重悬洗 细胞一次，1000 rpm离心5min弃上清；
[0030] (3)加 IOml本发明多功能无血清细胞培养基重悬细胞，并在培养基中加入0.5-50ul IOuM的Rock inhibitor，放入T75的培养瓶中；
[0031] (4)将培养瓶放置于培养箱中培养，培养条件为36 °C_38°C，4.5 %-5.5 % CO2， 90 %-100 % 湿度；
[0032] (5)3天后换为常规表皮细胞培养基继续培养。培养至汇合度达80%左右，即可消 化收集细胞，进行细胞传代。
[0033]所述步骤(2)的细胞如为冻存细胞，从液氮罐中取出后37°C水浴轻摇使其溶解;然 后将溶解的细胞分别加入约8ml含10%FBS的DMEM中，1000 rpm离心5min。
[0034] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0035] 1.本发明多功能无血清细胞培养基配方中不含有血清，更加有利于体外培养细胞 的生长，使细胞的性能更加一致;可以消除来自血清的不均一性;降低生产成本，简化分离 纯化步骤，避免血清对细胞的毒性作用及血清源性污染如病毒污染等;提高细胞培养及实 验结果的可重复性，避免了由于血清批次之间的差异所造成的影响；可以提高产品的表达 水平，并容易进行细胞产品的纯化和下游加工。
[0036] 2.使用本发明多功能无血清细胞培养基进行真皮成纤维细胞的培养与使用普通 培养基培养相比，真皮成纤维细胞贴壁快，生长迅速，生长状态良好，一般3-4天细胞汇合度 即可达到90 %左右。
[0037] 3.使用本发明多功能无血清细胞培养基进行原代表皮细胞的培养时，只需用 Coating Matrix将细胞培养瓶进行包被处理，并在培养基中加入适量Rock inhibitor来抑 制真皮成纤维细胞的生长即可，使用本发明多功能无血清细胞培养基培养的原代表皮细胞 贴壁快，生长迅速，并且聚团生长。
【附图说明】
[0038] 图1:复苏的原代表皮细胞的生长状态
[0039] 其中A、B为用本发明培养基培养3天时，复苏的原代(PO代)胚胎表皮细胞的生长状 态;C、D为用本发明培养基培养3天时，复苏的原代成人表皮细胞的生长状态。
[0040] 图2:分离后直接培养的原代表皮细胞的生长状态。
[0041] 其中A、B为使用本发明培养基培养3天时，原代(PO代)胚胎表皮细胞的生长状态； C、D为使用本发明培养基培养3天时，原代成人表皮细胞的生长状态。
[0042] 图3:复苏及传代后的真皮成纤维细胞的生长状态。
[0043] 其中图A、B为使用本发明培养基培养4天时，P2代胚胎真皮成纤维细胞的生长状 态;C、D为传代后使用本发明培养基培养3天时，P3代胚胎真皮成纤维细胞的生长状态。
[0044] 图4:分离后直接培养的原代真皮成纤维细胞及传代后的细胞生长状态。
[0045] 其中A、B为使用本发明培养基培养4天时，原代(PO代)胚胎真皮成纤维细胞的生长 状态;C、D为传代后使用本发明培养基培养4天时，Pl代胚胎真皮成纤维细胞的生长状态。
[0046] 图5:使用不同培养基培养的P5代胚胎真皮成纤维细胞的状态。
[0047]其中A、B为使用含10 %FBS的DMEM培养基培养2天时，P5代真皮成纤维细胞的生长 状态;C、D为使用本发明真皮成纤维细胞培养基培养2天时，P5代真皮成纤维细胞的生长状 ??τ O
【具体实施方式】
[0048] 下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行 进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本 发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0049] 本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用 的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0050]实施例1、一种多功能无血清细胞培养基，所需的试剂及用量如下：
[0052] 在超净工作台内，将DMEM高糖培养基与F12营养培养基混合，加入适量B27添加剂、 PC-I添加剂、基因重组人表皮生长因子以及青链霉素，混匀。配制好的培养基可以在4°C稳 定保存3-4个月。
[0053]实施例2、本发明多功能无血清细胞培养基用于冻存的原代表皮细胞的复苏及培 养
[0054] (1)培养瓶用Coating Matrix预处理：将Coating Matrix(Gibco，R011k)0.5_3ml 加入培养瓶铺匀，室温静置IOmin，然后将瓶内多余液体弃掉。
[0055] (2)液氮罐中取出成人和胚胎原代表皮细胞，37°C水浴轻摇使其溶解。
[0056] (3)将溶解的细胞分别加入约8ml含10%FBS的DMEM中，1000 rpm离心5min。
[0057] (4)弃上清，成人和胚胎细胞沉淀分别用IOml含双抗的F12培养基重悬洗细胞一 次，1000 rpm 离心 5min。
[0058] (5)弃上清，加 IOml本发明多功能无血清细胞培养基重悬细胞，并在培养基中加入 0.5-50ul IOuM的Rock inhibitor，接种于T75的培养瓶中。此时，细胞记为PO代。
[0059] (6)将培养瓶放置于培养箱中培养，培养条件为36°C_38°C，4.5%-5.5%C02， 90 %-100 % 湿度。
[0060] (7) 3天后换为常规表皮细胞培养基继续培养至细胞汇合度达80 % -90 %左右（见 图1 )，开始消化收集细胞，进行细胞传代。
[0061] 从图1可以看出使用本发明培养基培养的原代表皮细胞生长迅速，并且胚胎细胞 可以聚团生长。
[0062] 实施例3、本发明多功能无血清细胞培养基用于分离的原代表皮细胞的培养
[0063] (1)培养瓶用Coating Matrix预处理：将配好的Coating Matrix(Gibco,ROllk) 0.5-3ml加入培养瓶铺匀，室温静置10min，然后将瓶内多余液体弃掉。
[0064] (2)分离的成人和胚胎细胞分别用IOml含双抗的F12培养基重悬洗细胞一次， I OOOrpm 离心 5min。
[0065] (3)成人和胚胎细胞分别加 IOml本发明多功能无血清细胞培养基重悬细胞，并在 培养基中加入〇.5-50ul IOuM的Rock inhibitor，接种于T75的培养瓶中。此时，细胞记为PO 代。
[0066] (4)将培养瓶放置于培养箱中培养，培养条件为36 °C_38°C，4.5 %-5.5 %⑶2， 90 %-100 % 湿度。
[0067] (5) 3天后换为普通表皮细胞培养基继续培养至细胞汇合度达80 % -90 %左右（见 图2)，开始消化收集细胞，进行细胞传代。
[0068] 从图2可以看出使用本发明培养基培养的原代表皮细胞生长迅速，并且胚胎细胞 可以聚团生长。
[0069] 实施例4、本发明多功能无血清细胞培养基用于冻存的胚胎真皮成纤维细胞的培 养及传代
[0070] (1)液氮罐中取出Pl代真皮成纤维细胞，37°C水浴轻摇使其溶解。
[0071] (2)将溶解的细胞加入约8ml含10%FBS的DMEM中，1000 rpm离心5min。
[0072] (3)弃上清，沉淀用IOml含双抗的F12培养基重悬洗细胞一次，1000 rpm离心5min。
[0073] (4)弃上清，加 IOml多功能无血清细胞培养基重悬细胞，接种于T75的培养瓶中。
[0074] (5)将培养瓶放置于培养箱中培养，培养条件为36°C-38°C，4.5%-5.5%C02， 90 % -100 %湿度。此时，细胞记为P2代。4天更换本发明多功能无血清细胞培养基一次。 [0075] (6)待P2代细胞汇合度达90%以上时（图3A、B)，开始进行细胞传代。
[0076] (7)将培养瓶中的表皮或多功能无血清细胞培养基吸走弃掉。
[0077] (8)用IOml PBS洗一次去除残留的血清。
[0078] (9)加含EDTA的0.05 %胰酶，每个T75培养瓶中加3ml胰酶，放在细胞培养箱中孵育 4-8min〇
[0079] (10)加 IOml含10%FBS的DMEM中和胰酶，将细胞吹下转移到离心管中。
[0080] (11) 1000 rpm离心5min。
[0081] (12)弃上清，用IOml含双抗的F12重悬细胞，计数。1000 rpm离心5min。
[0082] (13)弃上清，用本发明多功能无血清细胞培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中。 此时，细胞记为P3。
[0083] (14)将培养瓶放置于培养箱中培养，培养条件为36 °C-38 °C，4.5 %-5.5 %⑶2， 90%-100%湿度。培养3天后，P3代真皮成纤维细胞的汇合度可达80%-90% (图3C、D)。
[0084] 从图3可以看出使用多功能无血清细胞培养基培养的冻存后复苏的真皮细胞体积 小，在培养到4天时，细胞汇合度即可达到90%以上;传代后的真皮成纤维细胞体积变化不 大，生长迅速，3天真皮成纤维细胞的汇合度即可达到80%-90%，可以满足多次传代需要。
[0085] 实施例5、本发明多功能无血清细胞培养基用于分离的胚胎原代真皮成纤维细胞 的培养及传代
[0086] (1)分离的细胞用IOml含双抗的F12培养基重悬洗细胞一次，1000 rpm离心5min。
[0087] (2)弃上清，加 IOml本发明多功能无血清细胞培养基重悬细胞，接种于T75的培养 瓶中。
[0088] (3)将培养瓶放置于培养箱中培养，培养条件为36 °C-38°C，4.5 %-5.5 %⑶2， 90 % -100 %湿度。此时，细胞记为PO代。4天更换多功能无血清细胞培养基一次。
[0089] (4)待PO代细胞汇合度达90%以上时（图4A、B)，开始进行细胞传代。
[0090] (5)将培养瓶中的多功能无血清细胞培养基吸走弃掉。
[0091] (6)用IOml PBS洗一次去除残留的血清。
[0092] (7)加含EDTA的0.05 %胰酶，每个T75培养瓶中加 3ml胰酶，放在细胞培养箱中孵育 4_8min〇
[0093] (8)加 IOml含10%FBS的DMEM中和胰酶，将细胞吹下转移到离心管中。
[0094] (9) 1000 rpm 离心 5min。
[0095] (10)弃上清，用IOml含双抗的Fl 2重悬细胞，计数。1000 rpm离心5min。
[0096] (11)弃上清，用多功能无血清细胞培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中。此时， 细胞记为Pl代。
[0097] (12)将培养瓶放置于培养箱中培养，培养条件为36 °C-38 °C，4.5 %-5.5 %⑶2， 90%-100%湿度。培养4天后，Pl代真皮成纤维细胞的汇合度可达90% (图4C、D)。
[0098] 从图4可以看出使用多功能无血清细胞培养基培养的原代(PO代)胚胎真皮成纤维 细胞呈长梭形，体积小，且有表皮细胞聚团生长，在培养到4天时，真皮成纤维细胞汇合度即 可达到90%以上;传代后的真皮成纤维细胞(Pl)呈优势生长，体积变化不大，生长迅速，4天 真皮成纤维细胞的汇合度即可达到90%，可以满足多次传代需要。
[0099] 实施例6、使用多功能无血清细胞培养基和常规培养基培养的胚胎真皮成纤维细 胞对比实验
[0100] (1)液氮罐中取出2支P4代真皮成纤维细胞，37°C水浴轻摇使其溶解。
[0101] (2)将溶解的2支细胞加入2个装有8ml含10%FBS的DMEM的离心管中，1000 rpm离心 5min〇
[0102] (3)弃上清，沉淀分别用IOml含双抗的F12培养基重悬洗细胞一次，1000 rpm离心 5min〇
[0103] (4)弃上清，2个离心管中分别加 IOml本发明多功能无血清细胞培养基和含10% FBS的DMEM培养基重悬细胞，分别接种于2个T75的培养瓶中，此时，细胞记为P5。
[0104] (5)将培养瓶放置于培养箱中培养，培养条件为36°c-38°c，4.5%-5.5%C〇2， 90%-100%湿度。4天后分别更换多功能无血清细胞培养基和含10%FBS的DMEM培养基一 次。
[0105] (6)待P5代细胞汇合度达90 %以上时(见图5)，开始进行细胞传代。
[0106] 由图5可以看出，使用本发明培养基培养的传代真皮成纤维细胞扩增速度更快，细 胞体积更小，可满足多次传代需要。
【主权项】
1. 一种多功能无血清细胞培养基，其特征是，以500ml计，各组分的用量关系如下： DMEM高糖培养基 250ml F12营养培养基 250ml B27添加剂 5-20 ml PC-1 添加剂 5-20 ml 基因重组人表皮生长因子 10-100 ul 青链霉素2. 权利要求1所述多功能无血清细胞培养基在真皮成纤维细胞的体外快速扩增中的应 用。3. 如权利要求2所述多功能无血清细胞培养基在真皮成纤维细胞的体外快速扩增中的 应用，其特征是，步骤如下， (1) 真皮成纤维细胞用l〇ml含双抗的F12培养基重悬洗细胞一次，lOOOrpm离心5min; (2) 弃上清，加10ml权利要求1所述培养基重悬细胞，接种于T75的培养瓶中； (3) 将培养瓶放置于培养箱中培养，培养条件为36 °C_38°C，4.5 %-5.5 %⑶2,90 %-100 %湿度； (4) 4天更换权利要求1所述培养基一次。4. 如权利要求3所述多功能无血清细胞培养基在真皮成纤维细胞的体外快速扩增中的 应用，其特征是，所述步骤（1)真皮成纤维细胞如为冻存真皮成纤维细胞，则从液氮罐中取 出细胞，37°C水浴轻摇使其溶解;然后将溶解的细胞加入8ml含10%胎牛血清FBS的DMEM中， lOOOrpm离心5min;弃上清，然后用10ml含双抗的F12培养基重悬洗细胞一次，lOOOrpm离心 5min〇5. 如权利要求3或4所述多功能无血清细胞培养基在真皮成纤维细胞的体外快速扩增 中的应用，其特征是，所述步骤(4)待细胞汇合度达90%以上时，用权利要求1所述培养基进 行细胞传代。6. 权利要求1所述多功能无血清细胞培养基在原代表皮细胞的培养中的应用。7. 权利要求6所述多功能无血清细胞培养基在原代表皮细胞的培养中的应用，其特征 是，步骤如下， (1) 培养瓶用Coating Matrix预处理：将Coating Matrix 0.5_3ml加入培养瓶铺勾，室 温静置l〇min，然后将瓶内多余液体弃掉； (2) 将成人或胚胎表皮细胞或多功能混合细胞用10ml含双抗的F12培养基重悬洗细胞 一次，lOOOrpm离心5min弃上清； (3) 加10ml权利要求1所述培养基重悬细胞，并在培养基中加入0.5-50ul 10uM的Rock inhibitor，放入T75的培养瓶中； (4) 将培养瓶放置于培养箱中培养，培养条件为36°C-38°C，4.5%-5.5%⑶2,90%-100 %湿度； (5) 3天后换为常规表皮细胞培养基继续培养。8. 权利要求7所述多功能无血清细胞培养基在原代表皮细胞的培养中的应用，其特征 是，所述步骤(2)的细胞如为冻存细胞，从液氮罐中取出后37°C水浴轻摇使其溶解;然后将 溶解的细胞分别加入约8ml含10%FBS的DMEM中，lOOOrpm离心5min。
【文档编号】C12N5/071GK105861421SQ201610473348
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】邢志青, 吴训伟
【申请人】济南磐升生物技术有限公司