一种昆虫细胞表达抗菌肽Cecropin DC1的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种昆虫细胞表达抗菌肤Cecropin DC1的方 法。
【背景技术】
[0002] 抗菌肤是一类具有生物活性的小分子碱性多肤，具有杀菌力强、抗菌谱广、稳定性 好及不产生耐药性等优点，更为重要的是抗菌肤对真核细胞几乎没作用，仅作用于原核细 胞及发生病变的真核细胞。
[0003] 现有技术查阅发现中国专利ZL200510032743. 8公布了一种抗菌肤DC及其制备 方法与应用，根据天然抗菌肤的序列，设计、合成抗菌肤DC基因，选择酵母偏爱的遗传密码 子，转化穿梭质粒，转入季也蒙念球菌中表达。但目的基因DC在季也蒙念球菌中的表达量 受到限制、质粒转化体不稳定，目的基因容易丢失等缺点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是在于提供一种昆虫细胞表达抗菌肤CecropinDC1的方法，利用基 因工程，构建含有抗菌肤CecropinDC1基因的重组病毒，并利用Sf21细胞作为宿主，表达 生产具有生物活性的重组抗菌肤CecropinDC1。
[0005] 本发明通过W下技术方案来实现： 1、一种昆虫细胞表达抗菌肤CecropinDC1，通过点突变技术，将第38位赖氨酸的密码 子AAG改为天冬酷胺的密码子AAC。此处氨基酸密码子的改变对表达产物的杀菌活性明显 的提局。
[0006] 2、所述的昆虫细胞表达CecropinDC1，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0007] 3、一种昆虫细胞表达CecropinDC1的重组核巧酸序列，包含沈QIDNO:1所示的 核巧酸序列。
[0008] 4、一种昆虫细胞表达抗菌肤CecropinDC1的方法，包括W下步骤： 1)构建包含SEQIDNO: 1所示核巧酸序列的重组杆状病毒转移载体。
[0009] 2)将构建好的重组转移载体与首猜银蚊夜蛾多核型多角体病毒AcNPV- DNA共转 染Sf21昆虫细胞，按W下方式获得表达抗菌肤Cecropin的重组病毒。
[0010] 在1. 5ml灭菌的化pendo计管中加入2嗦重组转移载体DNA、10嗦AcNPV-DNA及 0. 8ml共转染缓冲液，将该混合物在室溫下解育30min后共转染对数期的Sf21昆虫细胞； 然后将共转染后的Sf21细胞先用无血清培养基Sf-900IISFM培养基清洗两次，再用含有 10%FBS的完全培养基在27°C下培养4~6d，收集培养基上清作为病毒原液用来筛选重组病 毒，重组病毒经过空斑筛选，获得病毒溶液，该病毒溶液命名为含有抗菌肤CecropinDCl基 因的重组病毒。
[0011] 3)重组病毒感染旺盛生长的Sf21细胞，27°C培养4~6d进行感染表达，之后通过 离屯、收集培养液。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果是： 1、抗菌肤CecropinDC1是一个经过修饰改进的基因。将第38位的赖氨酸改为天冬酷 胺，运种氨基酸密码子的改变使其具有较高的杀菌效价，特别是对多种病原微生物有较好 的抑菌作用，如大肠杆菌、金黄葡萄球菌等。
[0013] 2、本发明解决了抗菌肤CecropinDC1在季也蒙念球菌表达中质粒转化体不稳定， 目的基因容易丢失和在哺乳动物细胞生产成本太高等缺点，获得的Sf21细胞表达重组抗 菌肤CecropinDC1具有较高的生物活性，且大部分被分泌到培养基中，有利于蛋白的快速 提取纯化。本发明的抗菌肤CecropinDC1可W大量生产，并且为抗菌肤CecropinDC1在 医学、食品和化妆品上的应用开辟了广阔的前景。
【附图说明】
[0014] 图1是抗菌肤Cecropin DC1的PCR扩增产物； 1 :目的基因PCR产物，M:Marker。
[0015] 图2是本发明抗菌肤Cecropin DC1抗菌活性定量测定； 1:抗菌肤Cecropin DC1发酵液，2:抗菌肤DC发酵液，3:无菌水。
[0016] 图3是本发明抗菌肤抗菌肤Cecropin DC1抗菌活性定性测定； 邸一:无菌水，CK+:Amp，1 :抗菌肤DC，2 :抗菌肤CecropinDC1。
【具体实施方式】
[0017]W下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限 定。
[001引 实施例1 抗菌肤CecropinDC1基因的克隆 根据抗菌肤CecropinDC1基因改造和克隆的需要，利用Primerpremier5.0软件设 计、合成引物： P1 :5,ATGAAATGGAAGTTGTTCAAAAA3,； P2: 5'GTTAGCCAAGGCAGTAGC3' 所述PCR扩增反应为：93°C预变性5min; 93°C变性30s;58°C退火60s;72°C延伸Imin;30个循环后，72°C延伸10min，4°C保溫。
[0019] 用1%琼脂糖凝胶电泳对抗菌肤CecropinDC1基因进行PCR产物分析(结果如图 1所示)泳道1与DNA分子量Marker(DL2000)相对比可W清楚的看到140左右的目的片 段，说明成功合成了抗菌肤CecropinDC1基因。胶回收试剂盒（GelExtractionKit,OMEGA 公司）回收纯化目的基因。并将随机选取的质粒送金唯智基因公司测序。
[0020] 实施例2 获得重组病毒 将构建好的重组转移载体与首猜银蚊夜蛾多核型多角体病毒AcNPV-DNA共转染Sf21昆虫细胞，按W下方式获得表达抗菌肤Cecropin DC1的重组病毒。
[0021] 在1. 5ml灭菌的化pendo计管中加入2嗦重组转移载体DNA、10嗦AcNPV-DNA及 0. 8ml共转染缓冲液，将该混合物在室溫下培育30min后共转染对数生长期的Sf21昆虫细 胞；然后将共转染后的Sf21细胞先用无血清培养基Sf-900 II SFM培养基（不含抗生素或 其它添加物)清洗两次，再用含有10% FCS的新鲜培养基在27°C下培养4~6d，收集培养基上 清作为病毒原液用来筛选重组病毒，重组病毒经过空斑筛选，获得病毒溶液，该病毒溶液命 名为含有抗菌肤Cecropin DC1基因的重组病毒。
[00过实施例3 重组杆状病毒的提取 1)取1.5 ml离屯、管，加入20W的Proteinase K溶液。
[0023] 2)向离屯、管中加入200W血清或血浆，然后再加入200WBufferGB，满旋震荡 15seco
[0024] 3) 5