一种高产杆状病毒的二化螟幼虫中肠细胞系的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及属于昆虫细胞培养技术领域，尤其涉及一种高产杆状病毒的二化螟幼虫中肠细胞系。
【背景技术】
[0002]随着生命科学的迅猛发展，在生物工程技术领域中，细胞工程已愈来愈受到重视。培养昆虫细胞作为研究材料，一直是细胞生物学、分子生物学和生物化学以及昆虫毒理学等科学研究的重要方面。
[0003]自从Grace在1962年首次建立天蚕蛾细胞系以来，昆虫细胞培养技术得到了迅速发展，目前已建立了 800多株昆虫细胞系，主要集中于鳞翅目、双翅目(潘李珍等，1980，曾庆韬等，1998)、鞘翅目(Lynn et al., 1995; Iwabuchi, 1999; Stiles, 1992)、直翅目(Heinandez-Crespo et al., 2000)、膜翅目、同翅目和半翅目等,其中大部分来自鳞翅目和双翅目，来源于其他目的昆虫细胞系仅占1/10左右(张寰等，2007)。昆虫细胞系的建立，不但促进了昆虫生物学方面的基础研究，也大大促进了基于昆虫细胞的应用性研究。其中，昆虫细胞-杆状病毒表达系统(BEVS)是当今最具高效的真核表达系统，已广泛应用于β-干扰素等外源基因的表达。
[0004]在所建立的昆虫细胞系中，研究和应用最多的是黑腹果Drosophi Ia
S2 细胞系、粉纹夜蛾(7—/?i)的 BT1-Tn-5B1_4 (High Five)细胞系和草地贪夜蛾(SjOOi/OjOtera细胞系及其克隆株Sf9等。相对于已知的上百万种昆虫以及昆虫细胞系的广泛用途来说，已经建立的细胞系还远远不够，仍需要建立更多的昆虫细胞系以满足实际需要。
[0005]二化螺CAiJo suppressalis (Walker)属鳞翅目，螺蛾科,是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一，在分蘖期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成虫伤株和白穗，一般年份减产3%?5%，严重时减产在3成以上。除危害水稻外，二化螟还危害玉米、甘蔗、粟、蚕豆、茭白、高粱、油菜、小麦、紫云英等作物。二化螟有很强的适应能力，能快速适应不利环境(如抗性品种和杀虫剂)，其致害性能快速变异。在二化螟的防治过程中，新型生物农药的筛选和鉴定日益成为研究重点。生物农药的活动生物测定需要大量发育一致的二化螟试虫，对饲养场地要严格的要求，工作量大，而若有离体培养的二化螟细胞，则可以在离体条件下研究生物农药对二化螟的作用，从而有助于在细胞水平研究杀虫剂对二化螟的作用机制，有助于当前杀虫剂的改进和新杀虫剂的发明。
[0006]目前，关于二化螟细胞的体外培养技术及二化螟细胞系，相关报道较少。二化螟的中肠是消化吸收的重要场所，也是杆状病毒主要的侵染，复制部位之一。因此，通过本发明，构建更加高效的杆状病毒表达载体系统是十分有意义的。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种二化螟中肠细胞组织来源的并具有高度病毒敏感性的细胞系，该细胞系名称为BIQ-ChSu-1I。
[0008]本发明的另一目的在于提供该细胞系的构建方法。
[0009]本发明的又一目的在于提供该细胞系在杆状病毒的大规模生产及使用杆状病毒表达载体表达重组蛋白上的用途。
[0010]
本发明建立一种高产杆状病毒的二化螟幼虫中肠细胞系的具体步骤如下:
(1)配制细胞原代培养液和细胞传代培养液；
(2)在无菌条件下，将二化螟幼虫浸没在70%或75%乙醇溶液中，进行表面消毒10?20分钟，用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫2?3次，用无菌滤纸吸干虫体或用吹风机吹干虫体；
(3)将虫体置于用70%或75%乙醇消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定，取出二化螟幼虫中肠；
(4)用生理盐水清洗(3)所取组织3-5次，再用HBSS清洗液清洗组织2_3次，最后再用细胞培养液ΤΝΜ-??清洗中肠I次。HBSS清洗液含200U/ml的青霉素，0.2 μ g /ml的链霉素，0.5 μ g /ml的两性霉素B ；
(5)将清洗过的中肠组织剪碎，置于预先盛有Iml细胞原代培养液的T-25cm2细胞培养瓶中，放入27°C无光照的细胞培养箱中培养；
(6)过夜后，待组织贴壁后，再加入2ml细胞传代培养液，使组织大部分浸没在该传代培养液中，在与步骤(5)同样条件下培养，在加液的时候勿使组织悬浮在细胞传代培养液中；
(7)每隔5-7天吸出50%?70%量的细胞传代培养液，并同时换入吸出量的新的细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶；
(8)把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入新的细胞传代培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多的新的细胞传代培养液，两个培养瓶放入培养箱中培养，细胞开始传代，细胞系建立成功；
整个过程都是在无菌条件下进行的。
[0011]本发明所述的细胞原代培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、两性霉素B和动物血清及饱和苯基硫脲的混合物，PH值为6.0-6.8。所述的细胞传代培养液是昆虫细胞培养液和动物血清的混合物，PH值为6.0-6.8。所述的昆虫细胞培养液选自TNM-FH，所述的动物血清为胎牛血清。所述的青霉素含量为200U/ml,链霉素含量为0.2yg /ml,两性霉素B含量为0.5 μ g /ml。所述的动物血清体积比含量为10?20%。所述的饱和苯基硫脲溶液为高压灭菌的苯基硫脲固体过量加入到无菌的TNM-FN培养液中配制而成。
[0012]本发明的有益效果是:采用上述方案，对二化螟幼虫中肠细胞进行了原代培养和传代培养，取得了较好的培养效果。本发明快速、有效、重复性强，是对鳞翅目昆虫细胞培养的重要补充。二化螟为水稻重要害虫，本发明有助于在离体条件下研究二化螟，为其防治途径的研究和新型生物农药的开发提供帮助。
[0013]本发明中二化螟幼虫中肠细胞系的生物学特征观察和测定。
[0014]1.经实验观察，该细胞系大部分贴壁生长，细胞的形状大部分圆形，少部分梭形，较少似巨噬细胞形(图1)。
[0015]2.以2xl05细胞/mL的浓度接种到T_25cm2培养瓶中，27°C无光照培养，每天取一瓶测定细胞浓度，绘制生长曲线(图2)，并按照公式T=tlg2/[lg(N/N。)]计算群体倍增时间， 经过计算第八代的细胞群体倍增时间为78小时。其中 T=在对数期平均增长一倍所需的时间 t=接种到测定细胞数的时间 N。=接种时的细胞数 N=时刻t所测定的细胞总数。
[0016]3.细胞系核型的确定:二化螟的染色体数目n=29，而本发明所建立的细胞系的染色体数目在136-147，因此，新建立的细胞系由5倍体细胞组成(图3)。
[0017]4.用白细胞介素-1 β引物，利用DAF-PCR的方法鉴定了本发明建立的细胞系的确来源于二化螟幼虫的中肠细胞，而非其他细胞系的污染(图4 )。由细胞系提供的DNA条带与二化螟幼虫DNA扩增后的带型相同，而与对照细胞系sf9和s2带型明显不同。
[0018]5.本发明所建细胞系对