专利名称：一种在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，涉及一种在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法。
背景技术：
抗菌肽是动植物体内分泌的一类小分子活性多肽，一般由15-45个氨基酸组成， 在动植物的免疫系统中发挥着重要作用。目前，由于抗生素的滥用导致耐药菌株不断增多， 人们对抗菌肽的研究投入极大热情。家蚕抗菌肽属于Cecropin家族中的一个成员，为线性、d_螺旋肽，含有35个氨基酸；抗菌肽具两亲性N端具有亲水性、C端具有疏水性，同时抗细菌、抗真菌及抗肿瘤作用， 且对正常真核细胞无明显毒副作用。抗菌肽CM4是张双全等从中国家蚕(Bombyx mori)(浙农1号X苏12号)中分离得到的。它是线性的、具有α螺旋两亲的阳离子肽，由35个氨基酸组成，分子量约为3. 8KD， 有很强的杀菌能力，对细菌，真菌等都有作用且不含甲硫氨酸。从蚕蛹中提取的执菌肽CM4 具有较广泛的抗菌和杀伤某些肿瘤细胞的能力，并且不破坏正常细胞。目前已有在大肠杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统中表达抗菌肽CM4的报道，但至今尚未有在昆虫细胞中表达抗菌肽CM4的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法，包括如下步骤1)将两端分别包含BamHI和HindiII酶切位点的抗菌肽CM4基因克隆入 pFastBacHT B 载体的 BamHI/Hindlll 位点间得到重组质粒 pFastBac HTB-ABP ；幻将重组质粒pFastBac HTB-ABP转化DHlOBac大肠杆菌感受态细胞，与其中的杆状病毒穿梭载体Bacmid重组，获得插入ABP基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP ；3)脂质体介导重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP转染Sf9昆虫细胞，获表达抗菌肽的重组病毒；4)培养所述的重组病毒，表达抗菌肽CM4。其中，步骤1)所述的两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因通过如下方法获得以中国家蚕(Bombyx mori)(浙农1号X苏12号)的总RNA为模板，利用上游引物sABP-F =SEQ ID NO. 1，下游引物sABP-R =SEQ ID NO. 2通过rPCR扩增得到所述的抗菌肽CM4基因；然后以所述的抗菌肽CM4基因为模板，利用上游引物pFastBacHTB-F SEQID N0. 3，下游引物pFastBacHTB-R :SEQ ID NO. 4通过PCR扩增得到两端分别包含BamHI 和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因。本方法还包含所述的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP的鉴定。
所述的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP的鉴定方法优选PCR鉴定分别以 M13-F=SEQ ID NO. 5、M13_R :SEQ ID NO.6 和 M13-F :SEQ ID NO. 5、pFastBacHTB-R :SEQ ID NO. 4 以及 pFastBacHTB-F =SEQ ID NO. 3、M13-R =SEQ ID NO. 6 为引物对重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP进行PCR扩增，能够扩增出对应的M7 Ibp、1876bp、740bp目标片段的即为真正含有整合了目的基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP。所述的重组病毒培养基为无血清无抗生素的Sf-900II SFM。有益效果发明人参照CM4序列合成了昆虫细胞偏爱密码子的引物，进而将CM4克隆入 PFastBacHTB载体，并进一步获得含ABP基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP，通过脂质体介导转染Sf9昆虫细胞，成功实现了抗菌肽CM4基因在昆虫细胞中的表达，为抗菌肽 CM4的大量获得提供一条新途径，为进一步的抗菌机理的研究及新药的开发打下工作基础。本发明首次实现了在昆虫细胞中表达抗菌肽CM4基因，与在毕赤酵母中表达CM4 比较的积极作用1.在昆虫中表达家蚕抗菌肽CM4，由于与家蚕的种属相近，有望得到后加工完整、 生物活性高的CM4 ；2.只要获得高滴度的重组CM4的杆状病毒，可直接感染昆虫细胞，易于纯化，易于大规模生产外源蛋白。
图1、CM4基因PCR扩增产物；1 :CM4 gene(105bp)，M =Marker 2000。图 2、BamHI/Hindlll 双酶切鉴定重组表达载体 pFastBac HTB-ABP ；1 :pFastBac HTB-ABP BamHI/Hindlll 酶切产物，M :Marker 2000。图3、I单酶切鉴定重组表达载体pFastBac HTB-ABP ；1 :pFastBac HTB ；2 :Sal I 单酶切 pFastBac HTB 产物；3 :Sal I 单酶切 pFastBac HTB-ABP 产物；M =Marker 2000。图 4、PCR 鉴定 Bacmid-ABP ；1 以M13-F、M13-R为弓丨物扩增Bacmid，2 以M13-F、M13-R为弓丨物扩增 Bacmid-ABP, 3 以 M13-F、pFastBacHTB-R 为引物扩增 Bacmid，4 以 M13-F、pFastBacHTB-R 为引物扩增 Bacmid-ABP, 5 以 pFastBacHTB-F、M13-R 为引物扩增 Bacmid, 6 以 pFastBacHTB-F、M13-R 为弓丨物扩增 Bacmid-ABP, LaneM =Marker 2000。图5、正常Sf9细胞。图 6、Bacmid/ABP 转染的 Sf9 细胞。图7是.重组融合抗菌肽CM4的SDS-PAGE和^festern blotting分析；M泳道分子量标记；1泳道未感染的培养液；2泳道感染的细胞培养液；3泳道未感染的细胞裂解液；4泳道感染的细胞裂解液；5泳道融合抗菌肽的Western blotting 结果。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例IpFastBac HT B/ABP表达载体的构建(1)获得两端分别包含BamH I和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因sABP-F 5’ -CGTTGGAAGATCTTCAAGAAGATCGAGAAGGTGGGTCAGAACATCC GTGACGGTATC GT -3，(SEQ ID NO. 1)sABP-R 5’ -GATGGTAGCAGCCTGACCCACCACAGCCACAGCGGGACCAGCCTTC ACGATACCGTC AC -3，(SEQ ID NO. 2)斜黑体为互补部分。以中国家蚕(Bombyx mori)(浙农1号X苏12号)的总RNA为模板，利用上游引物sABP-F :SEQ ID NO. 1，下游引物sABP-R SEQ ID NO. 2通过rPCR扩增得到所述的抗菌肽 CM4基因(图1)。以上一步扩增的的抗菌肽CM4基因为模板，利用上游引物pFastBacHTB-F =SEQ ID NO. 3，下游引物pFastBacHTB-R =SEQ ID NO. 4通过PCR扩增得到两端分别包含BamHI和 HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因。PCR扩增(引入酶切位点和肠激酶切割位点)，引物设计如下pFastBacHTB-F 5 ‘ -ATCT GGATCC GACGACGACGACAAGCGTTGGAAGATCTTC-3 ‘(SEQ ID N0. 3) 个BamHI 肠激酶切割位点pFastBacHTB-R 5 ‘ -GCTCGA AAGCTT TCATTAGTTGATGGTAGCAGCCTG-3 ’(SEQ ID N0. 4)个HindIII(2)抗菌肽CM4基因克隆入pFastBacHT B载体利用BamHI和hindIII分别对步骤(1)扩增得到的两端分别包含BamHI和HindIII 酶切位点的抗菌肽CM4基因和pFastBacHT B载体(金思瑞生物科技有限公司)进行双酶切，获得抗菌肽CM4基因目的片段和pFastBacHT B载体线性片段，连接两片段，得到连接产物。(3)连接产物转化和重组质粒鉴定将甘油冻存保存的DH5 α (北京百亿新创科技有限公司)接种划平板，37°C倒置培养过夜；挑取单克隆至装有:3ml LB的试管中，37°C 220rpm振摇12h ；吸取Iml菌液至1. 5ml 离心管中，4°C 12000g离心;3min，弃上清；用400 μ 1 0. lmol/1预冷的CaCl2重悬菌体沉淀， 12000g离心3min，弃上清；用200 μ 1 0. lmol/1预冷的CaCl2再次重悬菌体沉淀，置冰上过夜；将连接液20 μ 1全部加入200 μ 1感受态细菌中，置冰上Ih ；42°C热休克90sec，迅速置冰中5min ；加入800 μ 1 37°C预热的LB培养液；37°C，220rpm振摇lh，离心后全部涂布于含 100 μ g/mlAmp的LB平板，37°C倒置培养过夜。挑取单菌落接种含100 μ g/ml Amp的LB培养基37°C过夜振荡培养，提取重组质粒进行BamHI/Hindlll双酶切鉴定和Ml I单酶切鉴定，结果见图2和图3。酶切验证正确的质粒命名为重组表达载体pFastBac HTB-ABP0实施例2重组杆状病毒的获得将pFastBac HTB-ABP转化DHlOBac大肠杆菌感受态细胞(金思瑞生物科技有限公司，其中含有一个杆状病毒穿梭载体简称Bacmid，还有一个辅助质粒)，以获得插入ABP 基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP。(1)重组pFastBac HT B-ABP转化进入感受态大肠杆菌DHlOBac (转座)1)取5 μ 1重组表达载体pFastBacHT B-ABP加入IOOul感受态大肠杆菌DHlOBac 中，轻轻混勻，将离心管放入冰水浴30min。再置于42°C热休克45s，然后迅速移至冰水中放置 2min ；2)在该管中加入灭菌的LB液体培养基900ul，37°C摇床220r/min振荡培养4h，使之发生转座；3)用LB培养液制备10倍系列的细胞稀释液，以KT1UO-2,和10_3，不同的稀释度稀释，各取100 μ 1分别涂布于含50 μ g/ml卡那霉素、7 μ g/ml庆大霉素、10 μ g/ml四环霉素、100 μ g/ml x-gal，and 40 μ g/ml IPTG 的 LB 平板；4)将平皿于37°C倒置培养48h，观察蓝白斑的生长情况。发生转座后的DHlOBac 细菌因其LacZ基因被插入失活，而使含有重组Bacmid的大肠杆菌菌落成为白色。(2)重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP的提取阳性表形的确定1)用10 μ 1的枪头轻轻挑取10个分隔较大的白色菌落，划线于同样含有卡那霉素、庆大霉素、四环霉素、X-gal、IPTG的LB平板上，37°C培养过夜；2)如果所得菌落仍然均为白斑，说明所挑菌落均为真正含有整合了目的基因的阳性克隆Bac-ABP ；3)从再划线平板上挑取阳性白色单克隆进含卡那霉素、庆大霉素、四环霉素的液体培养液中，37°C摇床225rpm振荡培养Mh。重组杆状病毒的提取1)将此培养液分装至1. 5ml的Eppendorf管中，14000g离心Imin沉淀菌体；2)弃净上清，加入 300 μ 1 溶液 I (15mM Tris-HCl, pH 8. 0，IOmM EDTA, 100 μ g/ml RNaseA,过滤除菌)，重悬沉淀；3)加入300 μ 1溶液11(0. 2Ν NaOH, 1% SDS，过滤除菌)，温和颠倒混勻，室温放置 5min，使细菌裂解；4)缓慢逐滴加入300 μ 1 3Μ(ρΗ5. 5)的乙酸钾溶液，加入过程中轻微摇动，一层厚厚的白色菌体蛋白和基因组DNA慢慢出现，将样品置于冰上5-lOmin，14000g离心IOmin ；5)同时标好另一干净的Eppendorf管，加入800 μ 1异丙醇，轻轻将4)中所得上清转移至已加好异丙醇的新管中，注意不要混有任何白色沉淀，将离心管颠倒数次混勻，置于冰上5-10min, 14000g离心15min,弃上清；6)分别用75%和100%的乙醇各洗涤一次，14000g离心5min ；
7)弃上清，室温风干(在细胞室内无菌条件下)5-10min，得表达抗菌肽的重组杆状穿梭载体病毒fecmid-ABP ；8)溶于 40μ 1 IXTE 缓冲液(IOmmol Tris-HCI, lmmol EDTA, ρΗ8· 0)，4°C保存。(3)重组杆状穿梭载体病毒Bacmid-ABP的PCR鉴定Bacmid中的M13引物配对位点位于mini_attTn7两侧，以M13上游引物和M13下游引物扩增重组杆状穿梭载体病毒Bacmid-ABP，以野生的杆状病毒(金思瑞生物科技有限公司)为对照。M13-F 5' -GTTTTCCCAGTCACGAC-3‘ (SEQ ID NO. 5)；M13-R 5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3‘ (SEQ ID NO. 6)； pFastBacHTB-F 5 ‘ -ATCT GGATCC GACGACGACGACAAGCGTTGGAAGATCTTC-3，；(SEQ ID NO. 3)。pFastBacHTB-R 5 ‘ -GCTCGAAAGCTTTCATTAGTTGATGGTAGCAGCCTG-3‘ (SEQ IDN0. 4)。分别以M13-F、M13-R 和 M13-F、pFastBacHTB-R 以及 pFastBacHTB-F、M13-R 为引物，对重组杆状穿梭载体病毒Bacmid-ABP进行PCR鉴定，结果见图4。由图4可见对于重组杆状穿梭载体病毒Bacmid-ABP，以M13-F、M13-R为引物，可扩增出2471bp的条带，以 M13-F、pFastBacHTB-R 为引物，可扩增出 1876bp 的条带，以 pFastBacHTB_F、M13-R 为引物， 可扩增出740bp的条带。实施例3重组杆状穿梭载体病毒Bacmid-ABP转染Sf9细胞(1)转染Sf9单层细胞在35mm的六孔板中每孔以2ml的无血清无抗生素的Sf-900 II SFM培养液接种9X IO5个Sf9细胞(南京金思瑞生物科技有限公司)，培养过夜，待细胞密度长至 60% -70%时进行转染。在无菌的Eppendorf管中配制以下溶液，A 液5 μ 1 重组 Bacmid-ABP 加 100 μ 1 无血清无抗生素的 Sf-900 II SFM ；B液6 μ 1脂质体转染试剂Cellfectin加100 μ 1无血清无抗生素的Sf-900 II SFM ；然后将A液和B液轻轻混合均勻，室温放置15-45min。同时去除六孔板中每个孔中的培养液，以无血清无抗生素的Sf-900II SFM洗涤一遍，弃净培养液。在上述混合液中补加 800μ 1无血清无抗生素的Sf-900II SFM，至总体积约1ml，再吸入每个孔中，置于27°C孵育证。证后去除DNA混合液，每孔加入anl Sf-900II SFM,在27°C培养箱中培养7 之后观察细胞病变状况，细胞病变前后对比见图5和图6。(2)重组杆状病毒的获得与扩大待被转染的细胞出现明显病变状况后，在每个孔中收集含有重组杆状病毒颗粒的培养上清液，500g离心5min去除细胞和大碎片，将上清分成小份避光4°C保存，此为Pl代病毒，可用于再次感染Sf9单层细胞以获。为获高滴度病毒，可用以下公式计算获某一特定MOI时所需接种的Pl代病毒P(k) = I-P(O)MOI = -InP (0)
权利要求
1.在昆虫细胞Sf9中表达抗菌肽的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因克隆入PFastBacHTB 载体的BamHI/Hindlll位点间得到重组质粒pFastBac HTB-ABP ；(2)将重组质粒pFastBacHTB-ABP转化DHlOBac大肠杆菌感受态细胞，与其中的杆状病毒穿梭载体Bacmid重组，获得插入ABP基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP ；(3)脂质体介导重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP转染Sf9昆虫细胞，获表达抗菌肽的重组病毒；(4)培养所述的重组病毒，表达抗菌肽CM4。
2.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法，其特征在于步骤1) 所述的两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因通过如下方法获得以中国家蚕浙农1号X苏12号的总RNA为模板，利用上游引物sABP-F =SEQ ID NO. 1，下游引物sABP-R =SEQ ID NO. 2通过rPCR扩增得到所述的抗菌肽CM4基因；然后以所述的抗菌肽CM4基因为模板，利用上游引物pFastBacHTB-F =SEQ ID NO. 3，下游引物pFastBacHTB-R SEQ ID NO. 4通过PCR扩增得到两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因。
3.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法，其特征在于本方法还包含所述的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP的鉴定。
4.根据权利要求3所述的在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法，其特征在于所述的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP的鉴定方法为PCR鉴定分别以Ml3_F SEQ ID NO. 5、M13-R :SEQ ID NO. 6 和 M13—F :SEQ ID NO. 5、pFastBacHTB-R :SEQ ID NO. 4 以及pFastBacHTB-F :SEQ ID NO. 3、M13-R :SEQ ID NO. 6为引物对重组杆状病毒穿梭载体 Bacmid-ABP进行PCR扩增，能够扩增出对应的M71bp、1876bp、740bp目标片段的即为真正含有整合了目的基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP。
5.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法，其特征在于所述的重组病毒培养基为无血清无抗生素的Sf-900 II SFM。
全文摘要
本发明涉及生物基因工程领域，公开了一种在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法。本发明方法包括如下步骤(1)将抗菌肽CM4基因克隆入pFastBacHT B载体得到重组质粒pFastBacHTB-ABP；(2)将重组质粒pFastBac HTB-ABP转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP；(3)Bacmid-ABP转染Sf9昆虫细胞，获表达抗菌肽的重组病毒。经Western blotting检测，结果表明目的基因在昆虫细胞中获得融合表达。本实验建立的昆虫/杆状病毒表达系统为抗菌肽的大量获得提供一条新途径，为进一步的抗菌机理的研究及新药的开发打下工作基础。
文档编号C12N15/12GK102191251SQ201110073088
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日
发明者康春涛, 张双全 申请人:盐城星海饲料有限公司