专利名称：一种昆虫天然抗菌肽制品的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种昆虫天然抗菌肽制品的制备方法及其应用。本发明涉及生物活性物质分离纯化的技术领域。
背景技术：
青霉素等抗生素的发现给病原菌感染性疾病的治疗带来了革命性飞跃。但令人惊讶的是病原菌抗性产生的速度和抗性的广泛性。目前耐多药菌出现的频率超过新型抗生素的开发速度。近年来，在临床治疗中结构新颖的抗生素发现匾乏，抗药菌群迅猛发展，使某些感染性疾病成为临床治疗的难题。抗生素、化学防腐剂作为病原菌抑制剂添加到食品、饲料和化妆品中由来已久。从20世纪50年代开始，随着抗生素和化学防腐剂的广泛使用和人们对食品质量和环境质量的要求不断提高，它们的副作用也就日益表现出来，面临着被淘汰的局面。据美国卫生基金会和国家癌症研究所新公布的一份报告表明在全世界每年罹患癌症的500万人中，有50%左右与食品污染有关，而其中有30%左右受害于食品中的抗生素或化学防腐剂。为了应对以上种种问题，人们在不断研究和开发新型天然抗菌药物和抗菌防腐添加剂。近年来出现的抗菌肽就是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物、食品防腐保鲜添加剂和饲料添加剂。抗菌肽是一类小分子阳离子肽类生物活性物质，广泛存在昆虫、植物、动物、微生物及人体内。到目前为止，已从生物界分离得到800多种抗菌肽。单从昆虫中已经分离鉴定出200多种抗菌肽。虽然抗菌肽具有广泛的抗性(抗细菌、真菌、病毒、原虫等活性)，但是对正常的哺乳动物细胞无毒性。抗菌肽并不诱发抗性突变的产生，多数抗菌肽的水溶性较好， 对热稳定，对较大离子强度、较低或较高的PH都有较强的耐受性。综合国内外已报道的，至少有100种以上的不同细菌可以被抗菌肽所杀灭。因而抗菌肽可以作为医用和食品方面抗菌性的抗生素的替代药物或添加剂。抗菌肽的开发与应用研究已成为国内外昆虫学、植物学、微生物学、生理学、药理学等领域研究的热点。基于抗菌肽的重要作用，许多学者开展新型抗菌肽的寻找及制备研究。寻找和制备抗菌肽有三种途径化学合成，生物工程(重组技术)和从生物中筛选天然的抗菌肽类。化学合成常受到合成起始点的基础结构的限制。生物工程也存在如不正确转录而导致折叠不准确的蛋白质等问题。从生物中筛选抗菌肽具有来源丰富、物质天然等优点，因而倍受抗菌肽研究工作者的青睐。昆虫是地球上尚未被充分开发利用的巨大的生物资源。昆虫种类繁多(约200万种)，数量巨大，蕴藏着十分丰富的生物潜能。昆虫含有丰富的蛋白质和氨基酸，其粗蛋白含量平均在50%左右，人体必需氨基酸的含量很高，氨基酸模式符合或接近FAO提出的模式。 昆虫体内含还含有脂肪、维生素、微量元素、糖类、抗菌肽、SOD、凝集素、甲壳素及其它物质。 昆虫不仅可以作为食品，还具有治疗保健作用，即药食同源。家蝇、黄粉虫和桔小实蝇等是资源昆虫家族中占重要的一类，但长期以来仅被作为一种饲料蛋白资源来应用，而未对其在食品、药品、饲料和护肤品等领域中的价值开展深入研究及充分开发和利用。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种昆虫天然抗菌肽制品的制备方法及其应用。本发明具有简便快速，制备的抗菌肽纯度高且环保安全的特点。为了达成上述目的，本发明的解决方案是 一种昆虫天然抗菌肽制品的制备方法，包括如下步骤
1)原材料的筛选选用黄粉虫、家蝇和桔小实蝇昆虫为原材料；
2)提取和热处理采用磷酸盐缓冲液对原材料充分均浆处理后经过100°C沸水浴中热处理10分钟后离心提取上清液；
3)切向流分级分离处理上清液经膜过滤后依次经截留量为30KD膜包初纯、截留量为IOKD膜包精纯后收集透过液；
4)阳离子交换柱层析透过液经阳离子交换柱(CMSepharose Fast Flow柱，XK 16/20)层析，收集与阳离子交换柱结合样品；
5)切向流脱盐处理最后将与阳离子交换柱结合样品经截留量为5KD膜包脱盐处理， 收集透过液；
6)喷雾干燥透过液经喷雾干燥后即得到昆虫天然抗菌肽制品。所述的步骤2)中采用4°C预冷，0. 2M，pH6. 0的磷酸盐缓冲液(PB)；且磷酸盐缓冲液与原材料按体积重量比(0. 5-1. 5) ml: (3-7) g的比例混合勻浆处理后经4°C浸提M小时后离心处理。所述的磷酸盐缓冲液与原材料优选按体积重量比Iml 5g的比例混合。所述的步骤3)中膜过滤采用0. 45 μ m滤膜；选用切向流超滤系统对其进行逐级分离，选用截留量为30 KD，切向流速度为56L/H;截留量为10 KD，切向流速度为32L/H的膜包经过2次分级分离，每次浓缩10倍。所述的膜包规格为0. 7m2。所述的步骤4)中阳离子交换柱层析分离采用2种洗脱液pH6.0，50 mM醋酸铵缓冲溶液A和pH6. 0，IM醋酸铵缓冲溶液B ；经线性梯度洗脱，即由100%醋酸铵缓冲溶液 A-100%醋酸铵缓冲溶液B洗脱3个柱体积后，收集与阳离子交换柱结合样品。所述的步骤5)中采用切向流超滤系统对其进行脱盐处理，选用截留量为5KD，切向流速度为6L/H，浓缩10倍后收集透过液。所述的步骤6)中喷雾干燥采用120°C条件下，2 mL/min的速度进行喷干。一种昆虫天然抗菌肽制品的应用，采用上述方法制备的抗菌肽制品能用作医药原料，食品、果蔬防腐保鲜剂，饲料添加剂和护肤品。本发明的有益效果为本发明具有原料来源丰富，价格低廉，简便快速，制备的抗菌肽纯度高且环保安全，本发明产品与化学合成抗菌剂相比具有无毒，无残留，不受合成起始点的基础结构的限制；选择资源昆虫作为原材料，具有较高的食用安全性，且具有生产成本低，周期短，得率高的特点。制备的抗菌肽制品可广泛应用于医药原料、食品、果蔬防腐保鲜以及饲料添加剂和护肤品等领域。
图1是本发明的制备工艺流程图。
具体实施例方式下面结合图1和具体实施例来进一步详细说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。实施例1
首先称取果蝇、家蝇和桔小实蝇资源昆虫，灭菌蒸馏水清洗后自然干燥，按Iml 5g的体积重量比例加入4°C预冷的磷酸盐缓冲液(ΡΒ，0. 2M，pH6. 0)，(所述的磷酸盐缓冲液与原材料的混合比例可采用(0. 5-1. 5)ml: (3-7)g的体积重量比例中的任意值)充分勻浆处理后，4°C冰箱浸提对h后离心(4°C，10000 X g离心30分钟)，沉淀反复浸提数次，合并上清液。上清液置100°C沸水浴中热处理10分钟，而后于离心30分钟(4°C，10000 X g)，收集上清液。上清液经0. 45 μ m滤膜过滤后，选用切向流超滤系统对其进行逐级分离，选用截留量为30 KD膜包(切向流速度为56L/H)、10 KD的膜包(切向流速度为32L/H)经过2次切向流分级分离(均浓缩10倍，膜包规格为0. 7m2))，收集经10 KD膜包切向流分离后的透过液，上阳离子交换柱(CM Sepharose Fast Flow柱，XK 16/20)进行层析分离，层析过程中采用2种洗脱液pH6. 0,50 mM醋酸铵缓冲溶液A和pH6. 0, IM醋酸铵缓冲溶液B ；经线性梯度洗脱，即由100%醋酸铵缓冲溶液A-100%醋酸铵缓冲溶液B洗脱3个柱体积后，收集与阳离子交换柱结合样品。最后样品经5KD膜包(切向流速度为6L/H)进行脱盐，浓缩10倍后收集透过液，在120°C条件下2 mL/min的速度进行喷干，收集喷干粉，即得昆虫天然抗菌肽制品。本实施例的方法简便快速，制备的抗菌肽纯度高。制备的抗菌肽制品可广泛应用于医药原料——抗菌药物，食品、果蔬防腐保鲜以及饲料添加剂和护肤品添加剂。
权利要求
1.一种昆虫天然抗菌肽制品的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)原材料的筛选选用黄粉虫、家蝇和桔小实蝇昆虫为原材料；2)提取和热处理采用磷酸盐缓冲液对原材料充分均浆处理后经过100°C沸水浴中热处理10分钟后离心提取上清液；3)切向流分级分离处理上清液经膜过滤后依次经截留量为30KD膜包初纯、截留量为IOKD膜包精纯后收集透过液；4)阳离子交换柱层析透过液经阳离子交换柱层析，收集与阳离子交换柱结合样品；5)切向流脱盐处理最后将与阳离子交换柱结合样品经截留量为5KD膜包脱盐处理， 收集透过液；6)喷雾干燥透过液经喷雾干燥后即得到昆虫天然抗菌肽制品。
2.如权利要求1所述的一种昆虫天然抗菌肽制品的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中采用4°C预冷，0. 2M, pH6. 0的磷酸盐缓冲液；且磷酸盐缓冲液与原材料按体积重量比(0. 5-1. 5) ml: (3-7) g的比例混合勻浆处理后经4°C浸提M小时后离心处理。
3.如权利要求2所述的一种昆虫天然抗菌肽制品的制备方法，其特征在于所述的磷酸盐缓冲液与原材料按体积重量比lml:5g的比例混合。
4.如权利要求1所述的一种昆虫天然抗菌肽制品的制备方法，其特征在于所述的步骤3)中膜过滤采用0. 45μπι滤膜；选用切向流超滤系统对其进行逐级分离，选用截留量为 30 KD，切向流速度为56L/H ；截留量为10 KD，切向流速度为32L/H的膜包经过2次分级分离，每次浓缩10倍。
5.如权利要求4所述的一种昆虫天然抗菌肽制品的制备方法，其特征在于所述的膜包规格为0. 7m2。
6.如权利要求1所述的一种昆虫天然抗菌肽制品的制备方法，其特征在于所述的步骤4)中阳离子交换柱层析分离采用2种洗脱液pH6.0，50 mM醋酸铵缓冲溶液A和pH6.0， IM醋酸铵缓冲溶液B ；经线性梯度洗脱，即由100%醋酸铵缓冲溶液A-100%醋酸铵缓冲溶液 B洗脱3个柱体积后，收集与阳离子交换柱结合样品。
7.如权利要求1所述的一种昆虫天然抗菌肽制品的制备方法，其特征在于所述的步骤5)中采用切向流超滤系统对其进行脱盐处理，选用截留量为5KD，切向流速度为6L/H，浓缩10倍后收集透过液。
8.如权利要求1所述的一种昆虫天然抗菌肽制品的制备方法，其特征在于所述的步骤6)中喷雾干燥采用120°C条件下，2 mL/min的速度进行喷干。
9.一种如权利要求1所述的昆虫天然抗菌肽制品的应用，其特征在于采用上述方法制备的抗菌肽制品能用作医药原料，食品、果蔬防腐保鲜剂，饲料添加剂和护肤品。
全文摘要
本发明公开了一种昆虫天然抗菌肽制品的制备方法及其应用，包括如下步骤1)选用黄粉虫、家蝇和桔小实蝇昆虫为原材料；采用磷酸盐缓冲液对原材料充分均浆处理后经过离心提取上清液；上清液经膜过滤后依次经截留量为30KD膜包初纯、截留量为10KD膜包精纯后收集透过液；透过液经阳离子交换柱层析，收集与阳离子交换柱结合样品；然后将与阳离子交换柱结合样品经截留量为5KD膜包脱盐处理，收集透过液；透过液经喷雾干燥后即得到昆虫天然抗菌肽制品。本发明具有简便快速，制备的抗菌肽纯度高且环保安全的特点。制备的抗菌肽制品可广泛应用于医药原料、食品、果蔬防腐保鲜以及饲料添加剂和护肤品等领域。
文档编号A61K8/64GK102321164SQ20111013632
公开日2012年1月18日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者党向利, 包小霞, 毛伟光, 王丽芳 申请人:绍兴市曙光科技开发有限公司