专利名称：家蝇抗菌肽基因及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种家蝇抗菌肽基因及其克隆方法，属于分子生物学技术领域。
自从1981年伯曼(Boman)等人在昆虫中发现第一种抗菌肽以来，经过近20年的研究，现在已报道的昆虫抗菌肽有100多种。昆虫抗菌肽具有分子量小，热稳定性、水溶性好、抗菌谱广及材料来源丰富等优点。虽然从这些抗菌肽中显示出明显的结构多样性，但它们也有很多的共同特性分子量较低，因此抗原性低；在生理pH下具正电荷，大多数具有双亲的α-螺旋或β-片层或同时具有两种结构。根据其序列结构和抗菌特性，已发现的昆虫抗菌肽可以归纳为三大类即(1)即不含半胱氨酸的线形抗菌肽(2)具有半胱氨酸的环行抗菌肽(3)富含脯氨酸和/或甘氨酸的抗菌肽，参见陈留存，王金星，1999.昆虫抗菌肽研究现状。生物工程进展，19(5)55-60。
目前已克隆的抗菌肽基因只有20多种。国内，南京大学、南京师范大学对家蚕的抗菌肽进行了较系统地研究。谢维等，1997，抗菌肽CMIV突变体基因在E.coli中融合表达的研究，中国科学C辑，27278-283将化学合成的家蚕抗菌肽基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达成功，华南农业大学黄自然等对柞蚕抗菌肽也做了大量研究。在转基因研究方面，我国也有一系列的研究工作。贾士荣，屈贤铭等1996年将抗菌肽B基因导入水稻推广品种中百1号和京引37119号，首次获得抗白叶病和细菌性条纹病的转基因水稻，公开报道见王志兴，贾士荣，1996，抗菌肽分泌型载体的构建及转基因马铃薯中蛋白的胞外分泌，农业生物技术学报，4(3)277-286。
抗生素类药物的应用开创了抗感染治疗的新纪元。当抗生素首次使用时，具抗性和不具抗性的病原体的比例小于1％，然而仅在抗生素应用几年之后耐药菌就出现，并随之广泛传播。每一种新抗菌药物的应用总是伴随耐药菌的出现，为了克服这一情况会有新的药物诞生和应用，然而同样地又可出现更顽固的耐药菌，甚至是多重耐药菌(MDR)，例如葡萄球菌(MRSA)、结核杆菌、肺炎球菌等对多种抗生素产生耐药性，致使目前许多临床应用的药物已无效。特别是近年来还出现一些新病原微生物，如嗜肺军团菌、空肠弯曲菌、幽门螺杆菌、卡氏肺孢子虫及HIV病毒等，这些病菌对感染性疾病治疗提出了严峻挑战，有些学者指出我们已面临“医疗灾难”的边沿。因此，发现和筛选具有新的作用机理的抗生素成为当前医药研究领域的迫切任务。
昆虫抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗性，并且抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，仅仅作用原核细胞和发生病变的真核细胞。改造过的抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，而且也作用于真菌、原虫、某些病毒和肿瘤细胞，同时，还能加速免疫和伤口愈合过程，参见赵东红等，1999，昆虫抗菌肽的功能、作用机理与分子生物学研究最新进展，生物工程进展19(5)14-18。特别是部分抗菌肽对一些临床耐药致病菌也有良好的抗菌作用，同时抗真菌肽的发现，对棘手的人类真菌病的治疗提供了新的思路。更为引人关注的是昆虫抗菌肽对癌细胞有杀伤作用，而对人体细胞无任何无不良影响，这是目前使用的肿瘤化疗药物所不具备的特性。在目前许多病原菌对现有抗生素逐步产生抗药性，而新的抗生素的发现极其困难的情况下，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。目前已经引起了人们的浓厚兴趣，国外已有一些公司投入大量人力物力进行肽类抗生素的研究。总之，昆虫抗菌肽的研究不仅在理论上具有重要意义，而且在实践上具有巨大的应用潜力，因此，它已成为当今生物医药研究的热点之一。家蝇以其生活在杂菌横生的环境中，接触并传播病菌，但它本身却不受其害，说明其体内存在着比其他昆虫更完善的或特有的免疫应答和分子保护机制，因此，研究家蝇抗菌肽可望获得具有特殊性能的、具更高活性的抗菌肽及其基因，用于生物医药产品开发和基因工程生产抗菌肽，并为抗病转基因作物研究提供目的基因。到目前为止尚无家蝇抗菌物质分离提取的报道，基因库中亦无家蝇抗菌肽基因。
常用的从昆虫中提取总RNA的方法有异硫氰酸胍法或RNA提取试剂盒法。异硫氰酸胍法，又称一步法，参见乔姆兹因斯基和萨奇的“用酸性异硫氰酸胍-酚氯仿一步法提取RNA”一文，载于《分析生物化学》162156-169(Chomczynski，P.，N.Sacchi，1987.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phend-chloroformextraction.Analy Biochem，162156-169)。
本发明的目的在于弥补已有技术的不足，提供一种分离纯化的家蝇抗菌肽基因，及其克隆方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
一种分离或纯化的家蝇抗菌肽基因，它具有如下所示的序列序列表基因一(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度229碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源家蝇(Musca domestica)(f)序列描述SEQ ID NO.1
(2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征*长度40氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型肽(c)序列描述GWLKKMGKKIERVGQHTRDA TIQTIGVAQQ AANVAATLKG1020 30 40一种上述分离或纯化的家蝇抗菌肽基因的同系基因，它具有如下所示的序列同系基因二(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度229碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源家蝇(Musca domestica)(f)序列描述SEQ ID NO.1 (2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征*长度40氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型肽(c)序列描述GWLKKMGKKI ERVGQHTRDA TIQTIGVAQQ AANVAATLKG10 20 30 40
上述分离或纯化的家蝇抗菌肽基因的克隆方法如下用OD值为0.8-1.0的大肠杆菌或/和金黄色葡萄球菌刺激家蝇成虫，进行抗菌肽的诱导，利用诱导24-48小时的家蝇成虫提取总RNA，然后将总RNA反转录合成cDNA，根据天蚕素类抗菌肽的氨基酸序列设计兼并引物，进行常规链式聚合酶反应(PCR反应)，产物扩增纯化后克隆到pUCm-T载体或p-GEM-T Easy载体上，序列测定，得到229bp的DNA片段。
上述克隆方法中所述的兼并引物是正向引物5’GG(T/C) TGG TTG AA(A/G) AA(A/G) AT3’反向引物寡聚脱氧胸腺核苷酸[Oligod(T)18]上述链式聚合酶反应(PCR)的具体步骤如下(1)首先将下列试剂混在一起10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)模板cDNA 1μl正向引物(1.25μg/μl) 1μl反向引物(1.25μg/μl) 1μl脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μlTaq DNA聚合酶 0.25μl灭菌水 37.75μl总体积 50μl(2)将上述混合液94℃变性2分钟，然后进入下列循环94℃ 30秒，51℃30秒，72℃30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟，结果扩增到230bp的一条带。
(3)将扩增产物纯化，取3μl纯化产物克隆到pUCm-T载体(上海生物化工产品)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板过夜培养。挑取3个白斑，提取质粒，用于序列测定。
结果得到了229bp的DNA片段，由此推得具40个氨基酸的一段序列，将此序列与已发表的抗菌肽的序列比较，结果与果蝇天蚕素A1的氨基酸序列具有相似性，因此可以确定该基因为一种新的天蚕素类抗菌肽基因。利用上述方法得到了上述两个同系基因。
本发明的关键是诱导出抗菌肽基因和获得高质量的RNA，以采用异硫氰酸胍法为佳。
本发明首次得到分离和纯化的家蝇抗菌肽基因，并设计了合适的兼并引物，采用异硫氰酸胍法提取总RNA得到较好的结果，成功地完成了家蝇抗菌肽基因的克隆。本发明的分离和纯化的家蝇抗菌肽基因可以抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌生长，也可以抑制真菌生长。家蝇抗菌肽的分子量很小，不会引起人体产生免疫反应，有很大的药用开发的前景。
实施例1.一种分离和纯化的家蝇抗菌肽基因，具有如下序列(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度229碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源家蝇(Musca domestica)(f)序列描述SEQ ID NO.1 (2)SEQ IDNO.2的信息(b)序列特征*长度40氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型肽(c)序列描述GWLKKMGKKI ERVGQHTRDA TIQTIGVAQQ AANVAATLKG10 20 30 40实施例2.实施例1的同系基因，具有下列序列(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度229碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源家蝇(Musca domestica)
(f)序列描述SEQ ID NO.1 (2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征*长度40氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型肽(c)序列描述GWLKKMGKKI ERVGQHTRDA TIQTIGVAQQ AANVAATLKG10 20 30 40实施例3.分离和纯化的家蝇抗菌肽基因克隆方法家蝇(Musca domestica)成虫由本实验室饲养，供试菌种为大肠杆菌(Escherichia coli)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus auceus)。
(1)用9号注射针头蘸取OD值为0.8-1.0大肠杆菌和金黄色葡萄球菌刺激家蝇，进行抗菌肽诱导24小时。
(2)总RNA提取取诱导后的家蝇0.5-1克，液氮中研磨粉碎，用异硫氰酸胍法提取总RNA。
(3)cDNA第一链合成10微克总RNA，加反应液20微升42℃反应90分钟。70℃10分钟终止反应。反应液组成50毫摩尔氯化钾，3毫摩尔氯化镁，10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)pH 8.3，1毫摩尔二硫苏糖醇(DTT)，5微摩尔寡聚脱氧胸腺核苷酸(Oligod(T)17)，500微摩尔脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶。
(4)链式聚合酶反应(PCR反应)试剂与条件首先将下列试剂混在一起·10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)·模板cDNA 1μl·正向引物(1.25μg/μl) 1μl·反向引物(1.25μg/μl) 1μl·脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl·Taq DNA聚合酶 0.25μl·灭菌水 37.75μl·总体积 50μl
PCR反应条件为首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环94℃ 30秒，51℃30秒，72℃30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。
(5)反应产物纯化利用德国奎因(QIAGEN)公司产品(QIAquick Gel ExtractionKit)，操作步骤按产品说明书进行。
(6)抗菌肽基因克隆取纯化产物3微升，连接于pUCm-T载体(上海生工产品)。转化到大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)的平板生长过夜，挑取3个白斑，在LB液体培养基(5毫升，含100微克/毫升氨苄青霉素)过夜培养。
(7)质粒纯化收取过夜培养菌液1-2毫升，离心(10000转，1分钟)收集细胞。用微量DNA纯化试剂盒(Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System，美国普洛麦Promega公司)纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。
(8)序列测定与同源检索取纯化质粒2-5微升，用载体引物T7进行全自动测序，本工作在上海生工公司完成。将所得序列与基因库序列比较。实施例4.如实施例3所述，所不同的是总RNA的提取是用日本宝生物(大连)公司RNA提取试剂盒CatrimoxTM。
权利要求
1.一种分离或纯化的家蝇抗菌肽基因，其特征在于，它具有SEQ ID NO 1所示的序列(a)序列特征*长度229碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源家蝇(Musca domestica)(f)序列描述SEQ ID NO.1
2.一种权利要求1所述的分离或纯化的家蝇抗菌肽基因的同系基因，其特征在于，它具有SEQ ID NO 1所示的序列(a)序列特征*长度229碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源家蝇(Musca domestica)(f)序列描述SEQ ID NO.1
3.一种权利要求1或2所述的分离或纯化的家蝇抗菌肽基因的克隆方法，其特征是，用OD值为0.8-1.0大肠杆菌或/和金黄色葡萄球菌注入家蝇成虫体内，进行抗菌肽的诱导，利用诱导24-48小时的家蝇成虫提取总RNA，然后将总RNA反转录合成cDNA，根据天蚕素类抗菌肽的氨基酸序列设计兼并引物，进行常规链式聚合酶反应，产物扩增纯化后克隆到pUCm-T载体或p-GEE-T Easy载体上，序列测定，得到229bp的DNA片段。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的兼并引物是正向引物5’GG(T/C) TGG TTG AA(A/G) AA(A/G) AT 3’反向引物寡聚脱氧胸腺核苷酸[Oligod(T)18]。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述链式聚合酶反应的具体步骤如下(1)首先将下列试剂混在一起10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)模板cDNA 1μl正向引物(1.25μg/μl) 1μl反向引物(1.25μg/μl) 1μl脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μlTaq DNA聚合酶 0.25μl灭菌水 37.75μl总体积 50μl(2)将上述混合液94℃变性2分钟，然后进入下列循环94℃ 30秒，51℃30秒，72℃30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟，结果扩增到230bp的一条带；(3)将扩增产物纯化，取3μl纯化产物克隆到pUCm-T载体(上海生物化工产品)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板过夜培养。挑取3个白斑，提取质粒，用于序列测定。
全文摘要
一种分离或纯化的家蝇抗菌肽基因及其克隆方法,属于分子生物学技术领域。本发明的两个同系基因具有SEQID NO 1所示的序列,长度为229碱基对。用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对家蝇成虫进行抗菌肽的诱导,提取总RNA,反转录合成cDNA,设计兼并引物,进行常规链式聚合酶反应,产物扩增纯化后克隆到载体上,得到229bp的DNA片段。本发明的家蝇抗菌肽基因可抑制革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌和真菌的生长。
文档编号C07H21/04GK1365981SQ0110775
公开日2002年8月28日 申请日期2001年1月19日 优先权日2001年1月19日
发明者王金星, 赵小凡 申请人:山东大学