一种参与丹参酮合成的2‑酮戊二酸依赖性双加氧酶基因克隆鉴定及应用的制作方法

本发明属于植物分子生物学及基因工程领域，特别涉及一种参与丹参酮合成的2-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因克隆鉴定及应用。

背景技术：

中药丹参是鼠尾草属唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根和根茎，是最常用的大宗药材之一，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈等功效，在临床治疗心脑血管疾病有较高使用价值。丹参生态适应性较强，在华东、华北、西北、西南、中南等地区广泛分布，现如今丹参野生资源大幅减少，主要来源于人工栽培品，于河北、江苏、安徽、辽宁、陕西、山东、河南、山西、湖北、四川等地大量种植。丹参主要活性成分是脂溶性丹参酮类化合物和水溶性酚酸类化合物。丹参基原植物具有生命力强、世代周期短、基因组小、染色体数目少、组织培养和转基因技术成熟等特点，被认为是中药研究的理想模式生物。近来，丹参主要活性成分丹参酮的生源途径正被逐步解析。由于丹参酮的高氧化活性，其生物合成途径由一系列氧化酶参与，已报道多个CYP450s参与丹参酮的合成。2OGD超家族是植物基因组中的第二大基因家族，其功能主要涉及氧化和羟基化作用，如赤霉素、黄酮类等的合成，但是目前2OGDs是否参与丹参酮的生物合成仍然未知。

技术实现要素：

本发明目的在于探索2OGD家族成员在丹参酮合成中的功能，提供一种参与丹参酮生物合成的2OGD编码基因及应用。

本发明目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于丹参全基因组及不同丹参组织器官转录组差异表达分析的丹参酮合成途径相关2OGD超家族基因成员2OGD-5的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述基因2OGD编码蛋白质的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2。

一种含有2OGD-5编码基因的正向和反向片段序列植物RNAi双元表达载体。

本发明通过发根农杆菌侵染丹参叶片，获得阳性2OGD-5-RNAi毛状根，毛状根经0.1mg/L IAA诱导大量侧根生成。

本发明采用代谢组(LC-MS)技术鉴定2OGD-5-RNAi转基因毛状根的隐丹参酮和丹参酮IIA的含量与对照相比显著降低。本发明提供的2OGD-5催化隐丹参酮和丹参酮IIA的生物合成，为丹参酮生物合成途径的解析奠定基础。

附图说明

图1所示为丹参基因组2OGD家族成员系统发育进化树。

图2所示为丹参2OGD家族成员编码基因在丹参不同组织器官中的差异表达。

图3所示为2OGD-5在丹参不同组织器官中的差异表达。

图4所示为丹参2OGD-5编码基因结构与及蛋白三维结构预测。

图5所示为发根农杆菌ACCC10060介导的遗传转化获得2OGD-5-RNAi的丹参毛状根。

图6所示为pK7GWIWG2D(II)-2OGD-5转基因毛状根的抑制作用图。

图7所示为UPLC分析不同转基因毛状根之间丹参酮含量差异。

图8所示为LC-MS分析不同转基因毛状根之间丹参酮含量差异。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1全基因组筛选丹参2OGD家族

1)基于丹参全基因组扫描2OG-FeII_Oxy结构域(PF03171)，筛选到丹参2OGD超家族成员132个，氨基酸序列长度分布从120aa到504aa。

2)采用MEGA比对及构建系统发育树，丹参2OGD超家族被分为DOXB和DOXC两个亚家族，其中DOXB包含14个2OGD成员，DOXC包含116个2OGD成员，如图1所示。

3)收集丹参不同器官组织及处理的转录组测序数据，采用Tophat和Cufflinks软件分析丹参2OGD成员在丹参不同器官组织及MeJA处理下的差异表达谱，如图2所示。

4)根据丹参酮在丹参不同部位的合成及积累，筛选基因差异表达一致的丹参2OGD家族成员，其中2OGD-5在丹参根中特异表达且显著受MeJA诱导，如图3所示。

实施例2丹参2OGD-5编码基因的克隆及结构分析

1)将实施例1中筛选出的2OGD-5序列比对设计全长引物，从丹参根的cDNA中进行PCR扩增，获得长度为1089bp的核苷酸序列，如SEQ ID No.1。根据全长cDNA序列翻译后推导出丹参2OGD-5的氨基酸序列，共362个氨基酸残基，如SEQ ID No.2。

2)采用PyMOL软件预测2OGD-5蛋白结构，参考拟南芥AtLDOX的蛋白三维结构模型(PDBID：1GP5)，如图4所示。

实施例3丹参2OGD-5功能鉴定

1)Gateway引物设计及片段扩增。对2OGD-5基因设计186bp的RNAi片段引物(基因位置：304-489bp)，5’端添加attB1序列：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT，3’端添加attB2序列GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT。设计RNAi引物时为了避免设计的RNAi区域特异性差导致转基因沉默靶点不单一，将每个基因的RNAi区域与基因组BLAST比对，选取特异性最好的RNAi区域，引物序列如下：

F-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCCTCGGAGACGATGGACG

R-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTCGTCGCTGAAGACGCAC

2)Gateway构建RNAi载体。BP反应：取25ng的attB PCR回收产物和75ng pDONR221入门载体，加水混匀至4μL，然后加入1μL的BPclonase II enzyme，混匀，25℃孵育1h，加入0.5μL的Proteinase K，37℃孵育10m，转入DH5α感受态细胞，于50mg/L Kan抗性LB固体培养基上筛选阳性克隆，并PCR检测；LR反应：取75ng的pDONR-RNAi和75ng pK7GWIWG2D(II)受体载体，加水混匀至4μL，然后加入1μL的LR clonase II enzyme，混匀，25℃孵育1h，加入0.5μL的Proteinase K，37℃孵育10m，转入DH5α感受态细胞，于50mg/L Spec抗性LB固体培养基上筛选阳性克隆并送测，测序成功的阳性克隆提取重组质粒pK7GWIWG2D(II)-2OGD-5导入发根农杆菌ACCC10060。

3)农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片(叶盘法)。设计对照实验，分别选择含重组质粒PK7GWIWG2D(II)和pK7GWIWG2D(II)-2OGD-5的发根农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片。含有重组质粒的发根农杆菌接种于50mg/L Spec+50mg/L Rif的YEB培养基中，28℃摇床至OD600约为0.5；离心后，用等体积的MS液体培养基重悬沉淀(MS-plasmid)；将丹参无菌苗幼嫩叶片剪成0.5cm²的叶盘，MS固体培养基预培养2-3天；预培养的叶盘于MS-plasmid中浸泡10min，无菌纸吸干后，空白MS固体培养基于25℃黑暗共培养48-72h；共培养后的叶盘于含500mg/L Car(羧苄青霉素)的无菌水中清洗10min，转入含500mg/L Car+50mg/L Kan的MS固体培养基中，25℃黑暗中筛选，每10天继代一次；选择长势快的，抗性毛状根，切下2-3cm编号并与含30mg/L Kan的MS固体培养基上培养；培养过程中选择含30mg/L Kan+0.1mg/L IAA的MS固体培养基上刺激2-3d，随后转入不含IAA的30mg/L Kan的MS固体培养基上，待生长出大量侧根后转移至液体6，7-V培养基于120rpm 25℃黑暗中摇床培养；荧光显微镜下检测GFP的表达，并扩大培养，如图5所示。

实施例4丹参酮含量检测

本发明采用UPLC及LC-MS技术对转基因毛状根的丹参酮含量进行检测，主要采取以下步骤：1)丹参毛状根烘干并用研钵研磨成粉，100mg粉末用0.5mL甲醇提取，对提取物超声处理两次，1,500g离心10min，上清经0.2μm聚四氟乙烯注射过滤器过滤，待检测；2)UPLC条件，采用Waters ACQUITY UPLC BCH C18色谱柱，流动相：甲醇(A)-水(B)，75％A∶25％B洗脱10min，每个色谱过程完成后用100％的甲醇洗柱5min，然后初始比例75％A∶25％B平衡柱子5min；柱温，30℃；流速，0.3mL/min；检测波长，270nm；进样量，5μL；3)LC-MS/MS条件：LC：Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM20A UPLC系统，色谱柱：WatersACQUITY UPLC HSS T3C18(1.8μm，2.1mm×100mm)，进样量：5μL，流动相：A＝乙腈(0.04％乙酸)，B＝0.04％乙酸水溶液，线性梯度：5％-95％A(0-12min)，95％A(12-15min)，流速：0.4mL/min，柱温：40℃；MS/MS：AB SCIEX QTRAP 4500，电喷雾离子化温度：550℃，质谱电压：5500V，反吹气帘气：25psi，碰撞诱导电离：高。获得如下结果：2OGD-5-RNAi转基因毛状根的丹参新酮、隐丹参酮和丹参酮IIA的含量显著降低，是对照的0.16、0.56和0.56倍；二氢丹参酮和丹参酮I的含量略微降低，如图6、7所示。

本发明首次基于丹参全基因组筛选及克隆2OGD-5基因，验证发现2OGD-5参与丹参酮的生物合成，为解析丹参酮生物合成途径提供新思路，并为丹参酮体外合成生物学研究奠定基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。