一种克隆白洗猪pid1基因cds区序列的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子遗传学领域，尤其是设及白洗猪的PID1基因CDS区序列克隆技 术。
【背景技术】
[0002] 憐酸酪氨酸互作结构域 1 (Phosphotyrosine interactiondomain containing 1，PID1)是2006年Wang等利用抑制性消减杂交技术从肥胖人群腹膜后脂肪组织中筛选的 新基因，命名为NYGGF4,提交NCBI W后统一命名PID1，在脂肪细胞生长中扮演着重要的作 用，随着研究的不断深入，已有学者提出将PID1基因作为一个膜岛素抑制导致肥胖治疗 的作用祀位点。PID1基因的结构PID1基因在不同物种位于不同的染色体上，并且其全长、 外显子W及内含子数目、转录的mRNA长度和编码氨基酸的数目都存在不同程度的差异。猪 PID1基因位于15号染色体上，其转录产生的mRNA长度654 bp，编码217个氨基酸。PID1 基因进化保守主要是由于该基因编码的氨基酸序列中含有一个特殊的PTB结构域，PTB结 构域属于PH结构域超家族成员，该结构域不但影响着PID1基因的进化，同时也决定PID1 基因的功能。
[0003] 现研究表明，PID1基因在小鼠中呈多组织表达特征；人的PID1基因还特异性地表 达于脂肪、屯、脏和骨骼肌，在肥胖患儿脂肪组织中PID1的表达量能显著升高；鸡PID1具有 多组织广泛表达特征，组织间表达活性差异不明显，而且鸡PID1基因在组织表达分布上比 人和鼠更具广泛性；徐洪刚等发现PID1基因的表达量与IMF呈极显著正相关，相关系数为 0. 943。钱源（2010)对S个猪种多个组织进行了 PID1基因的mRNA表达表明，PID1基因呈多 组织表达特点，且瘦肉型猪与脂肉型猪PID1基因表达存在差异，其首次克隆获得了猪PID1 基因CDS序列，并对其进行了生物信息学分析，进一步讨论分析了 =个猪品种间PIDI基因 mRNA表达水平与IMF含量呈显著正相关。覃兆鲜等相继克隆获得了陆川猪的PID1基因CDS 全长序列，并对其序列进行了生物信息学分析。崔景香（2011)运用qPCR技术对S个猪种 PID1基因mRNA表达水平进行了分析，得到了与钱源相同结论，其首次构建了猪PID1基因真 核表达载体，利用脂质体介导转染山羊毛囊细胞，并进行了真核表达载体鉴定。目前研究表 明，在3T3-L1前脂肪细胞中，细胞中游离脂肪酸（FFA)和肿瘤坏死因子-a (TNF-a)浓度 能上调PID1基因的表达量，而白细胞介素-6 (IL-6)，瘦素（1巧tin)和抵抗素（resistin) 等对PID1的表达起到抑制的作用，同时在3T3-L1前脂肪细胞转化成脂肪细胞的过程中也 会导致PID1的表达量上调。各物种之间PID1基因组织表达研究表明，PID1基因是一个多 组织表达的基因，而且不同的物种之间PID1基因的都高表达于肝脏、脂肪等与脂肪代谢 有关的组织。
[0004] 上述研究结果提示，白洗猪PID1基因可能与其生产水平、肉质性状等有关联。国 内未见关于白洗猪PID1基因的相关研究报道，NCBI数据库中无白洗猪PID1基因序列及相 关的文献报道。
【发明内容】
[000引本发明的目的是：提供一种克隆白洗猪PID1基因CDS区序列的方法，它准确性高， 为构建白洗猪的PID1基因的原核、真核表达载体及相关动物模型等研究提供基础材料。
[0006] 本发明解决技术问题采用如下技术方案： 一种克隆白洗猪PID1基因CDS区序列的方法，对白洗猪的组织提取总RNA，逆转录 总RNA为cDNA后，设计特异性引物，P1上游引物：AATCCCTCGGCTGGAAGATGT，P1下游引 物：CGGCCAATAATTTGGCAGTCTT ;P2 上游引物：AAGCTTGGCTGGAAGATGTGGCAG，P2 下游引物： TCTAGATCAGCCATCATCRGATTCY ;运用化st-PCR技术对白洗猪PID1进行PCR扩增，扩增产物 连接于PMD18-T Vector后，构建PMD18-T-PID1-CDS重组质粒，对重组质粒进行测序，克隆 白洗猪PID1基因为67化P，其中包含完整CDS区序列654bp。
[0007] 由于采用了 W上技术方案，与现有技术相比，本发明通过对白洗猪的组织提取总 RNA，逆转录为cDNA后，设计特异性引物扩增白洗猪的PID1基因，运用化st-PCR技术对白 洗猪PID1进行PCR扩增，扩增的目的片段包含白洗猪的PID1基因的完整CDS区序列及部 分UTR区，最终构建PMD18-T-PID1-CDS重组质粒，并对其进行测序，测序结果与NCBI数据 库中预测的PID1基因CDS区序列进行比对验证，为构建白洗猪的PID1基因的原核、真核表 达载体及相关动物模型等研究提供基础材料；本发明先采用化st-PCR处理后再进行T克 隆，获得序列的准确性高。
【附图说明】
[0008] 图1为白洗猪cDNA PID1基因CDS区PCR产物电泳图。
[0009] 图2为PMD18-T-PID1-CDS重组质粒PCR产物电泳图。
【具体实施方式】
[0010] 本发明的实施例：克隆白洗猪PID1基因CDS区序列的方法 1、白洗猪总RNA的提取及cDNA合成 取白洗猪背最长肌组织进行总RNA提取，提取方法参照Invitrogen公司TRIZ化 积Reagent试剂盒说明书进行，所得总RNA逆转录合成为cDNA，逆转录方法参照北京康为世 纪生物科技有限公司化FiScript cDNA第一链合成试剂盒说明书进行。
[0011] 2、白洗猪PID1基因CDS区序列引物设计 欲扩增包含白洗猪PID1基因完整CDS区654bp的mRNA序列，由于猪PID1基因在 GenBank中Sus scrofa mRNA全序列尚未公布，故采用牛的PID1基因各Exon (GenBank登 录号：AC_000159. 1)与猪PID1基因（GenBank登录号：GU396255)各Exon进行对比拼接后， 运用NCBI中Primer-BLAST在线设计引物得到外引物P1，内引物参照猪PID1 (GenBank登 录号：GU396255)完整CDS区序列设计引物序列P2,引物均由上海生工生物工程技术服务有 限公司合成，引物信息详见表1。
[001引 3、白洗猪PIDl基因CDS区序列的化St-PCR扩增 化St PCR反应条件为 外引物Pl:95 °C预变性5 min;94 °C变性45 s，62. 6 °C退火45 s，72 °C延伸1 min, X40个循环；72°C终延伸10 min，4°C保存。
[001引 内引物P2 :95 °C预变性5 min ;95°C变性45 s，62. 4 °C退火45 s，72 °C延伸1 min, X40个循环；72°C终延伸10 min，4°C保存。
[0014] PCR扩增标准体系见表2。
[0015] 4、重组质粒的构建及测序 白洗猪PID1基因CDS区PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后（图1)，用上海生工生物工 程技术服务有限公司SanPr巧柱式DNA胶回收试剂盒进行回收纯化，纯化产物按照TaKaRa 公司PMD18-T Vector试剂盒说明书进行操作，采用蓝白斑法筛选克隆产物，最终提取重组 质粒DNA (图2)后送生物公司测序。
[0016] 5、测序结果比对及验证 重组质粒测序结果如沈Q ID NO : 1所示： 扩增目的片段长度为67化P，其中包含完整CDS区序列654bp及部分UTR区序列，其中 加粗标注部分为白洗猪PID1基因完整CDS区序列，所构建的重组质粒序列与NCBI数据库 猪PID1基因完整CDS区序列比对相符，说明白洗猪的PID1基因CDS区序列克隆成功。
【主权项】
1. 一种克隆白洗猪PIDl基因CDS区序列的方法，其特征在于：对白洗猪的组织提取总 RNA，逆转录总RNA为cDNA后，设计特异性引物，Pl上游引物：AATCCCTCGGCTGGAAGATGT，Pl 下游引物：CGGCCAATAATITGGCAGTCTT ;P2 上游引物：AAGCTTGGCTGGAAGATGTGGCAG，P2 下游引 物：TCTAGATCAGCCATCATCRGATTCY ;运用Nest-PCR技术对白洗猪PIDl进行PCR扩增，扩增产 物连接于PMD18-T Vector后，构建pMD18-T-PIDl-CDS重组质粒，对重组质粒进行测序，克 隆白洗猪PIDl基因为675bp，其中包含完整⑶S区序列654bp。
【专利摘要】本发明公开了一种克隆白洗猪PID1基因CDS区序列的方法，所述方法通过对白洗猪的组织提取总RNA，逆转录为cDNA后，设计特异性引物，运用Nest-PCR技术对白洗猪PID1进行PCR扩增，PCR扩增目的片段包含白洗猪的PID1基因的完整CDS区序列及部分UTR区，最终构建pMD18-T-PID1-CDS重组质粒，并对其进行测序，测序结果与NCBI数据库中猪的PID1基因完整CDS区序列进行比对验证，为构建白洗猪的PID1基因的原核、真核表达载体及相关动物模型等研究提供基础材料。
【IPC分类】C12N15/10, C12N15/12
【公开号】CN105002185
【申请号】CN201510499060
【发明人】陈祥, 冯文武, 孙振梅, 李鹏程, 许厚强, 丁玫, 陈伟
【申请人】贵州大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年8月14日