专利名称：猪生长性状基因inpp5f的克隆及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及猪生长性状相关基因INPP5F基因的克隆以及其在标记辅助选择上的应用。
背景技术：
我国养猪历史悠久，已有6000～10000年。养猪业一直是畜牧业的重要组成部分，近年来，猪肉一直占肉类总产的65％左右，对于改善人民的生活，增加农民收入，保证社会稳定起到了重要的作用。尤其随着我国经济体制的改革，农民商品意识逐步增强，养猪业正由传统家庭副业向专业化、规模化、集约化、工厂化方向迅速发展。因此，加快遗传育种学的发展用于支持养猪业有着极为重要的作用。
猪育种中选择的主要目标性状包括以下两个方面，一方面是胴体性状，包括胴体各组分的度量值(如背膘厚度、眼肌面积、胴体长、小肠长度、各种内脏重等等)和各组成的重量百分比(如屠宰率、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率和内脂等等)；另一方面是生长速度，其测定指标一般包括60日龄体重、前期平均日增重、后期平均日增重和全期平均日增重等等。
随着人们对肉品需要量的增加，畜牧业必须缩短家畜饲养期，更多的为人们提供肉食产品。生长性状属于数量性状，由多基因控制、并存在主基因(major gene)效应。分子生物学技术的发展，使人们可以在DNA水平寻找控制生长性状的主基因或与其紧密连锁的分子标记，在育种过程中用于标记辅助选择(markerassisted selection，MAS)，以便提高选择进展，更好地改善猪生长性状，满足人们的需要，同时获得较大的经济效益。
通过候选基因法，已经找到了一些影响猪的生长速度的基因。位于猪12号染色体上的生长激素基因(Growth Hormon，GH)是神经分泌内生长轴中调控动物生长发育的核心基因，其产物生长激素具有调节新陈代谢、促进生长发育等作用，是与猪的生长相关的主要候选基因，许多学者对它的基因型与生产性状的关系进行了广泛的研究。实验证明外源性猪GH能促进生长期猪的新陈代谢水平，增强消化道对饲料的消化吸收，促使肌肉蛋白、胶原蛋白合成增加、而脂肪沉积减少，使血液中的胰岛素样生长因子IGF-I浓度有所上升，总的结果提高了猪的平均日增重，增加了瘦肉率(贺淹才等，猪生长激素与养猪业，江西畜牧兽医杂志，1994，312-14)。方美英等(方美英等，六个品种猪生长激素基因座位遗传多态性检测，动物学研究，1998，19(4)334-336)宋成义等(宋成义等，猪GH基因部分突变位点对生长性能的影响，遗传，2001，23(5)427-430)俞沛初等(俞沛初等，香猪生长激素基因不同基因型对生长性能的影响，上海交通大学学报，2006，24(4)，326-329)也曾发现，不同的GH基因型与猪不同月龄平均日增重、不同月龄体重有着显著相关。关学敏等(关学敏等，猪肌肉生长抑制素基因5’-调控区的突变与生产性能的相关分析，西北农业学报，2006，15(2)7-9)在长白猪、大白猪、杜洛克猪、山西瘦肉型猪新品系(SD-III系)和山西地方品种马身猪5个品种中研究发现肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)基因型对出生重影响显著。
位于15号染色体的肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)是影响骨骼肌生长发育的抑制因子。其对猪瘦肉量和脂肪沉积有重要的影响(Sonstegard T S等，Myostatin maps to porcine chromosome 15by linkageand physical analyses.Anim Genet，1998，2919-22)。Grobet L等研究报道其突变能引起肌肉的增长(Grobet L等，A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype incattle.Nat Genet，1997，1771-74)。Te Pas等(Te Pas M F等，Influences of myogenin genotypes onbirth weight，growth rate，carcass weight，backfat thickness，and lean weight of pigs.J AnimSci，1999，772352-2356)同时发现Myogenin mRNA的表达水平能显示肌肉中被激活的卫星细胞数目，反映肌肉的生长速度。通过对猪MSTN基因在发育过程中表达水平的变化也说明MSTN基因的表达与生长速度有关(ji S等，Myostatin expression in porcine tissuestissue specificity and developmental andpostnatal egulation.Am.J.Physiol，1998，2751265-1273).
猪MC4R基因被认为是影响生长肥育性状的主效基因之一(Kim K S等，Linkage and physical mappingof the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R)gene.Journal of Animal Science，2000，78791-792)。它位于第1号染色体。肖石军等(肖石军等，猪资源家系MC4R基因扫描及其与脂肪性状的相关分析，畜牧兽医学报，2006，37(9)841-845)采用PCR-TaqI-RFLP技术，检测了9个中国地方猪种、3个外来猪种和1个培育猪种的612个个体及白色杜洛克×二花脸资源家系418头F个体在MC4R基因D298N主效位点的遗传变异，统计分析发现MC4R基因型与日增重等生长性状显著相关，同时，GG基因型个体的240日龄重、至240日龄平均日增重明显大于AA基因型个体。Kim等(Kim K S等，Linkage and physical mapping of theporcine melanocortin-4 receptor(MC4R)gene.Journal of Animal Science，2000，78791-792；Kim KS等，A missense vari ant of the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R)gene is associated withfatness，growth，and feed intake traits.Mammalian Genome，2000，1131-135)研究表明猪MC4R在该突变位点的基因型与一些品系的背膘厚和生长率以及所有品系的采食量呈强相关。
此外，猪胰岛素样生长因子(IGF-1)，PIT1基因，肥胖基因(LEP)等均被认为与猪的生长速度有关。
INPP5F(inositol polyphosphate-5-phosphatase F)基因是一个编码肌醇磷酸酶的基因，肌醇磷酸酶参与神经末梢的细胞的吞噬和外排作用。Jonathan等利用组织特异性的芯片技术，验证该基因的其中的一个转录本/Inpp5f_v2在鼠上为母系印记，该转录本在小鼠的脑中特异的表达并印记。(Jonathan等，A NovelVariant of Inpp5f Is Imprinted in Brain，and Its Expression Is Correlated with DifferentialMethylation of an Internal CpG Island.MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，2005，135514-5522)。后来的研究发现Inpp5f_v2在人的胎儿的大脑，心脏和舌头里面也为母系印记基因。人和小鼠的基因组研究结果将INPP5F基因分别定位于人的10(10q26.11)号染色体和鼠的7号染色体。在人上面INPP5F基因有三个选择性剪接的转录本，其DNA序列全长为103051bp，而在小鼠上目前只得到了一个转录本，其DNA全长为85072bp。通过对人与鼠之间的序列相似性比较发现，Inpp5f_v2在人和鼠之间有5个外显子是高度保守的。肌醇磷酸酶参与神经末梢的细胞吞噬和外排作用，而这个过程又是与内涵蛋白包膜的脱落和突触小泡的再循环密切相关的，暗示该基因有可能在机体脑的发育和新生儿的存活率方面起着重要的作用(Arai等，Developmental changes of synaptojanin expression in the human cerebrum and cerebellum.Dev.Brain Res..2001，1291-9)。但是到目前为止，仍没见到全面研究INPP5F基因功能的报导。研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以申请人对这个基因的部分的外显子进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它的功能。
发明内容
本发明的目的在于克隆猪生长性状基因INPP5F，寻找INPP5F基因的突变位点以及作为猪生长性状基因多态性的检测方法，为标记辅助育种提供一种有用的分子标记。
本发明是这样实现的一种猪生长相关基因INPP5F，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
PCR扩增的INPP5F基因组序列全长为355bp，其中全为如附图2所述的外显子20序列。
所获得的INPP5F基因部分DNA序列中有1个如序列表SEQ ID NO1所述的A279-G279的碱基突变，导致HincII/-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)多态性。
一种制备猪生长性状INPP5F基因DNA序列的方法，按照以下步骤用人INPP5F基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得相似性90％以上的表达序列标签(EST)；然后拼接猪EST-重叠群；根据EST-重叠群设计引物，引物用于PCR扩增，对获得的PCR产物纯化、克隆和测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO1所述的DNA序列。
本申请人应用上述PCR-RFLP方法对猪INPP5F基因第279位的碱基突变进行了检测。
以下对本发明作进一步的描述1、INPP5F基因的第20外显子的克隆(1)引物设计用人INPP5F基因cDNA(GenBank收录号NM_014937)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列相似性为90％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计引物，序列如下5’GACTCCTACCACTCCGATGAAT 3’(正向)，5’GCTGGGTCACTTTGTTTTGTG 3’(反向)。
(2)PCR产物的纯化、克隆和测序PCR产物的纯化在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是每100mg的凝胶中300μL的S1液，于65℃温育10min至凝胶完全融化，将S1/DNA混合物转入回收柱，9200g离心30s，使浆液通过Minicolumn挤出。将下面管子中的废液倒掉，再加入500μL的W1液至管中，9200g离心15s，倒掉管中的废液。再加入500μL的W1液，静置1min，9200g离心30s，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，加入25μL的灭菌水或者TE液，静置1min之后，9200g离心1min，以洗脱DNA存于Ependorff管。
连接反应将纯化PCR产物与pGEM-T载体(购自Promega公司)连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl 2×buffer，0.5μl的T载体，0.5μl的纯化PCR产物，0.5μl的T4连接酶，最后加入1μl灭菌水置4℃水浴过夜。
感受态细胞的制备从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。
转化无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3~4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。
(4)DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。
2.PCR-RFLP诊断方法建立(1)引物序列INPP5FPL1 5′-GACTCCTACCACTCCGATGAAT-3′PR2 5′-GCTGGGTCACTTTGTTTTGTG-3′该引物扩增片段长度355bp。
(2)PCR扩增条件PCR反应总体积20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(购自Promega公司)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(购自Promega公司)。PCR扩增程序是94℃4min，循环34次94℃30s，55℃30s，72℃20s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。
(3)RFLP检测条件PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR产物3-5μl，限制性内切酶HincII为0.2μl(2U)，用H2O补足10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
3.标记性状关联分析在利用本申请人分子生物学遗传育种实验室大白猪群体做性状关联分析，236个DNA样品(取自猪耳朵组织)用于基因型检测。所分析的性状有部分生长性状和部分繁殖性状。运用SAS Vergion8.1软件(一种公开使用的通用计算机软件)中GLM程序按以下模型进行基因型和性状间的关联分析，分析有两个步骤，先建立如下模型剔除所有系统效应yi＝μ+Gi+εi，其中，yi为性状表型值，μ为总体平均值，Gi为基因型效应(包括Ai加性效应，Di显性效应)。εi为随机误差，假定服从N(0，Iσ2)分布。
本发明的效果是1、猪INPP5F基因部分DNA序列的克隆PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示PCR产物的长度为355bp。其全部为外显子20序列(如图2、SEQ ID NO1所示)。测序结果表明在该片段的279bp处存在A、G两个等位基因，测序峰图见图4。
2、PCR-RFLP诊断方法建立用INPP5F-PL1和INPP5F-PR1扩增猪基因组DNA得到355bp特异扩增片段(详见图3)。测序的结果发现在该355bp片段中存在Hinc II酶切位点(GTY*RAC)，其中第281bp处为多态性切点，位于外显子20中，用INPP5F-PL1和INPP5F-PR1扩增猪的INPP5F基因获得长度为355bp的PCR产物，酶切产生三种基因型，基因型BB型有281bp和74bp两条带，AA型只有355bp的一条带，杂合子AB型有355bp，281bp和74bp三条带。(其中74bp的条带在图中看不到)3、标记性状关联分析对猪INPP5F基因第20外显子HincII-RFLP多态性位点与部分生长、繁殖性状进行关联分析，基因型检测结果表明在236个个体中AA基因型有113个，AB基因型有98个，BB基因型有25个(由于个别测定性状的数据缺失，因此得到的实际值如表2、表3所示)，所得到相关的性状是30-100Kg日增重和全程日增重。
由表2可知，A等位基因是猪30-100Kg日增重和全程日增重的有利标记，AA基因型标记可用于提高猪生长速度的选择标记(分子标记)。
表2 INPP5F基因多态性对30-100Kg日增重的影响
表3 INPP5F基因多态性对全程日增重的影响
序列表SEQ ID NO1是本发明克隆的猪生长性状相关基因INPP5F DNA序列。
图1是本发明关于INPP5F基因制备的流程图。
图2是本发明中猪INPP5F基因20外显子序列，其中第279位碱基处的括号内为等位基因的突变位点。
图3是本发明中猪INPP5F基因第二十外显子的扩增序列的电泳图谱，片段大小为355bp(琼脂糖胶浓度为1.5％)。图中M泳道为DNA分子量标记(250bp ladder)。
图4是本发明中猪INPP5F基因测序发现的279A-279G等位基因突变。
图5是本发明中猪INPP5F基因第二十外显子的Hinc II-RFLPs的三种基因型(AA AB BB)电泳图谱。MDNA分子量标准(250bp ladder)具体实施方式
实施例1PCR-RFLP-Hinc II多态性在各猪品种中的分布情况利用PCR-Hinc II-RFLP检测了五个猪种其中属于中国地方血缘的猪种分别是二花脸猪，大花白猪，江西玉山黑猪，属于外来的例如欧美血缘的猪种分别是杜洛克猪和大白猪，这些猪种基本涵盖各猪种的基因型。试验使用的猪种的基因频率如表3所示，发现地方猪种均等位基因A占优势，国外猪种均等位基因G占优势。
表4 INPP5F基因PCR产物基因型频率及基因频率
几个品种间基因型频率的卡方检验结果如表5。x2检验五个猪种间基因型频率差异性发现，国内猪和国外猪存在显著或极显著差异。
表5 INPP5F基因的PCR-Hinc II-RFLP基因型分布x2检验结果
注肩注*表述P＜0.05；肩注**表述P＜0.01实施例2猪标记性状关联分析对猪INPP5F基因第20外显子Hinc II-RFLP多态性位点与部分生长、繁殖性状进行关联分析，基因型检测结果表明在236个个体中AA基因型有113个，AB基因型有98个个体，BB基因型有25个(由于个别测定性状的数据缺失，因此得到的实际值如表2所示)，在与部分生产性状进行关联分析中，所分析的性状有部分生长性状和繁殖性状，所分析的性状是30-100Kg日增重和全程日增重。
由表可知，A等位基因是30-100Kg日增重和全程日增重的有利标记，AA基因型标记可用于提高猪生长速度的选择标记。
表2 INPP5F基因多态性对30-100Kg日增重的影响
表3 INPP5F基因多态性对全程日增重的影响
序列表SEQUENCE LISTING<110>华中农业大学<120>猪生长性状基因INPP5F的克隆及其应用<130>
<141>2007-03-30<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>355<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)
<220>
<221>gene<222>(1)..(355)<223>
<220>
<221>mutation<222>(279)..(279)<223>
<400>1gactcctacc actccgatga attccttaca aattccaagt ctgatgaaga taggcagcta60gccaactctt tagagaatgt agggccgata gactatgttc tgcctagttg tggcattatt120gcttcagcac ctcgtttagg cagtcgatcc cagtctatta gcagcactga tattagcatt180cacgttcctt cagaggttcc tactgctcat ggaagtgggc ttggaaaagg ccacgagtct240tctttgaaga aaagtccttc tgctgacaac atacacacrt tgactggctt tgccaagcct300gtggatgttt actgccacag atttgtccaa gacgcacaaa acaaagtgac ccagc 35权利要求
1.一种猪生长性状基因/NPP5F，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
2.根据权利要求1所述的基因/NPP5F，其特征在于，序列表SEQ ID NO1的第279bp处有一个A279-G279的碱基突变，导致Hinc II-RFLP多态性。
3.权利要求1所述的一种猪生长性状基因/NPP5F，其中检测A279-G279碱基处的突变的正、反向引物的DNA序列如下所示正向5′GACTCCTACCACTCCGATGAAT 3′，反向5′GCTGGGTCACTTTGTTTTGTG 3′。
4.权利要求1或2所述的一种猪生长性状基因/NPP5F在猪标记辅助选择中的应用。
5.权利要求3所述的一种猪生长性状基因INPP5F的引物在猪标记辅助选择中的应用。
6.一种筛选猪生长性状基因/NPP5F分子标记的方法，按照以下步骤用人INPP5F基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得相似性90％以上的表达序列标签；然后拼接猪表达序列标签-重叠群；根据表达序列标签-重叠群设计引物，利用引物进行PCR扩增，对获得的PCR产物纯化、克隆和测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ IDNO1所述的DNA序列。
全文摘要
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及猪生长性状基因INPP5F的克隆及其应用。本发明克隆了一种猪生长性状基因INPP5F，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。序列表SEQ ID NO1的第279bp处有一个A279－G279的碱基突变，导致Hinc II－RFLP多态性。本发明还公开了猪生长性状基因INPP5F的制备方法、引物设计以及在猪分子标记辅助选择中的应用。
文档编号C12N15/65GK101054581SQ20071005177
公开日2007年10月17日 申请日期2007年4月2日 优先权日2007年4月2日
发明者赵书红, 周泉勇, 朱猛进, 李奎, 刘榜, 樊斌, 余梅, 李长春 申请人:华中农业大学