专利名称：：用mmp23基因预示和鉴定猪产仔数的分子标记方法
技术领域：
：本发明涉及动物分子遗传学，具体说就是一种用MMP23基因预示和鉴定猪产仔数的分子标记方法。(二)
背景技术：
：一直以来，提高生长速度与瘦肉率，改善肉质，提高产仔数，增强抗病力是猪育种的主要目标。在过去几十年，随着育种方法的改进及BLUP方法的应用，猪的生长速度、饲料报酬和瘦肉率等中高等遗传力性状的遗传进展很快，人们从中获取了很大的经济效益；但西方猪种在繁殖性状上的改进效果微乎其微。据报道，法国用30多年的时间来改良猪产仔数性状，但进展甚微；丹麦将产仔数提高1头用了50多年；美国育种专家估计，要经过25个世代的常规选择，才能使美国猪种的产仔水平赶上中国猪的水平。性状的遗传组分大小决定了用来改良该性状的适宜方法。繁殖性状的低遗传力以及限性表达，使得采用常规技术对该性状的遗传改良几乎不可能。分子生物学技术的迅速发展，使科学家可以从DNA水平上对影响繁殖性状的单个基因或染色体片段进行分析，从而为该性状的遗传改良提供了新的契机。借助分子标记对繁殖性状进行标记辅助选择，可以改变繁殖性状通过传统选择改良进展小的现状，从而加速该性状的遗传改良。目前，猪产仔数候选基因研究的重点集中在与下丘脑-垂体-性腺轴有关的激素及其受体基因、激活素和抑制素等基因，如雌激素受体(Estrogenreceptor,ESR)基因、促卵泡素(Follicle-stimulatingHormone,FSH)-|3亚基基因，以及与胚胎早期发育有关的视黄酸受体Y(Retinoicacidreceptorgamma，RARG)基因、视黄醇结合蛋白4(retinolbindingprotein4,RBP4)基因、骨桥蛋白(OPN)基因以及骨形成蛋白15(bonemorphogeneticprotein-15，BMP15)基因等。其中，对产仔数具有较大遗传效应的是ESR基因和FSH-P基因。ESR是具有转录激活作用的核受体超家族的一员，它可以与下游耙基因的雌激素应答元件相结合，从而促使下游基因的转录。Rothschild等利用候选基因法在含有梅山猪血统的群体中，发现该基因与高产仔数主效基因相连锁。对该座位进行RFLP分析，发现具有3.7kb条带的纯合子(BB基因型)母猪比具有4.3kb条带的纯合子(AA基因型)母猪初产时多2.3头仔猪(P0.01)，各胎平均多产1.5头(PO.Ol)。对含有大白猪血统的群体进行分析发现，纯合子BB基因型母猪比其它等位基因的纯合型母猪多产l头仔猪。从而提出将B基因作为猪高产仔遗传标记。Short等采用新的PCR-PwII-RFLP方法扩增并酶切^^基因，其中B等位基因为65bp和55bp，A等位基因为120bp，在对4262头大白猪进行分析后得出BB型个体具有较高的产仔数和产活仔数(PO.l)，并对日增重背膘厚等性状无显著影响。FSH是由垂体前叶分泌的一种糖蛋白，其生物学作用在于促进颗粒细胞的增生，刺激类固醇生成，调节配子细胞的发育和成熟，最终引发排卵。是下丘脑-垂体-性腺轴中的主要激素之一。研究发现FSH卩亚基基因序列在不同猪种中存在差异，这种差异是由一个长度为292bp的逆转座子的插入引起的，带有插入片段的基因命名为A基因，不带有插入片段的基因命名为B基因。进一步将FSH(3亚基基因作为控制猪产仔数主效基因的侯选基因，与猪产仔数进行了关联分析。结果表明，BB型母猪比AA型母猪头胎产仔数和产活仔数分别高出2.53和2.12头，各胎次平均估计高出1.5头，并首次提出FSH(3是另一个控制猪产仔数的主基因或候选基因。虽然在产仔数分子标记研究方面取得一定的成果,但目前鉴定的基因或标记远未达到分子育种应用的要求，而且鉴定的标记大都受到国外专利的保护，很难在生产中直接应用。因此，我们需要加大对繁殖性状优良基因的挖掘和产仔数分子标记的筛选工作，为产仔数遗传改良以及分子育种实施提供依据。基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase,MMP)家族的大多数基因在生殖过程中高表达，包括卵泡发育、排卵、黄体形成与溶解以及子宫基质重建。Velasco等从人卵巢cDNA文库中分离鉴定了人的MMP23基因，Northernblot分析显示其主要在卵巢、子宫和前列腺组织中表达。Ohnishi等从大鼠未成熟卵巢中分离鉴定了大鼠的MMP23基因，该蛋白主要分布在细胞核周围的区域，在卵泡发育过程中MMP23mRNA的定位从颗粒细胞到鞘纤维细胞和卵巢表面的上皮细胞发生了显著的转换。MMP23在卵巢的时空特异性表达受cAMP信号途径的调控。进一步研究显示，MMP23在卵巢间质细胞和颗粒细胞中高度表达，而在FSH处理过的颗粒细胞中MMP23的表达量则显著下降。MMP23的表达与卵泡发育相关，其蛋白酶水解活性与排卵有关。以上研究成果显示，MMP23基因可能通过影响排卵，进而在生殖过程中发挥作用，因此，该基因可作为影响繁殖性状的功能候选基因。通过连锁图谱分析确定在染色体某一区域内影响繁殖性状的QTL，选择定位在QTL区域的基因作为候选基因也是切实可行的。MMP23基因定位在猪8号染色体上，与微卫星标记SW2521紧密连锁。研究显示，在该标记位点周围的区域内存在许多与繁殖性状有关的QTL，如排卵率、乳头数和血浆中的FSH浓度等。因此，MMP23可作为控制猪繁殖性状的位置候选基因。(三)
发明内容本发明的目的在于提供一种寻找猪MMP23基因突变位点以及基因多态性的检测方法，也就是用MMP23基因预示和鉴定猪产仔数的分子标记方法。本发明的目的是这样实现的本发明提供了大白猪、梅山和清平猪包括猪MMP23基因第2，3，4外显子和第2，3内含子的482bp的基因组核苷酸序列，通过3个猪种(大白猪、梅山猪和清平猪)的基因组核苷酸序列进行ClusterW比对提供了位于该482bp扩增片段内部的两处单核苷酸多态性(SNP)。制备该基因片段的步骤如下(1)选择两个中国地方品种(梅山猪和清平猪)和一个外来品种(大白猪)为试验材料，从猪血液中提取DNA;(2)根据猪MMP23基因的部分基因组序列(GeneBank登录号EU360790)，设计引物(F:5'-ACGCCGCTACACGCTGAC-3'禾卩R:5'-CGCTGTCGTCAAAGTGGATG隱3');(3)PCR扩增；(4)PCR产物纯化、克隆、测序。(5)序列比对分析。本发明提供了鉴定上述序列269bp处C/T变异的限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)基因型分型方法。其步骤包括(l)在猪基因组DNA中进行PCR扩增；(2)PCR扩增片段Sau3AI酶切分型及检测。本发明进一步提供了利用Sau3AI-RFLP方法确定的不同基因型个体与产仔数性状间的相关关系。根据本发明的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，进而达到较好的选择效果。(四)图l为本发明三个猪种MMP23基因序列比对结果和SNP位点；图2为本发明包括猪MMP23基因第2，3，4外显子和第2，3内含子的基因片段琼脂糖凝胶电泳图谱；图3为MMP23基因Sau3AI-RFLP检测结果。(五)具体实施方案下面举例对本发明做进一步说明。实施例1:基因片段的获得及多态性检测方法的建立猪MMP23基因部分DNA序列扩增(1)引物设计选择一个外来猪种(大白猪)和两个中国猪种(梅山猪、清平猪)为试验材料，根据猪MMP23基因基因组序列(GeneBank登录号EU3607卯)，设计引物，引物序列如下正向引物F:5'-ACGCCGCTACACGCTGAC-3'反向引物R:5'-CGCTGTCGTCAAAGTGGATG匿3'用此引物在三个猪种(大白猪、梅山猪和清平猪)基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系为25^1，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为200(amol/L，每条引物浓度为0.4^imo1/L，2U的TaqDNA聚合酶(BiostarInternational,Canada),2.5|ilGCbuffer,加去离子水至总体积25^1;PCR反应程序:94。C预变性4min;然后94。C变性50s、60。C退火45s、72。C延伸lmin，共35个循环；最后72'C延伸10min。不同猪种的PCR产物经纯化、克隆后，进行序列测定。(2)PCR产物的纯化、克隆和测序具体操作步骤如下PCR产物的纯化在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mLEpendorf滑中，然后用PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，按照该试剂盒说明书操作，具体步骤是每100mg的凝胶中加300pL的S1液，于65。C温育10min至凝胶完全融化，将S1/DNA混合物转入回收柱，9200g离心30s，使浆液通过Minicolumn挤出。将下面管子中的废液倒掉，再加入500pL的Wl液至管中，9200g离心15s，倒掉管中的废液。再加入500(iL的Wl液，静置lmin，9200g离心30s，取下Minicolumn装入1.5mlEpendorf滑中，加入25^L的灭菌水或者TE液，静置lmin之后，9200g离心1min，以洗脱DNA存于Ependorff管中。连接反应将纯化PCR产物与pMD18-TVector连接，连接反应总体积是10pL，其中包括2xR叩idLigationBufer,2.5(iL;Vector(50ng)，0.5|_iL;回收DNA,7-8^L。稍微弹打混合均匀，于16。C连接lh以上或者4匸连接过夜。感受态细胞的制备从37。C培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5ct单菌落接种于2mLLB中，于37'C振荡培养3h，转接1mL菌液于含有30mLLB的盐水瓶中，继续在37。C振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4。C4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4。C4,000g离心10min—次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4'C保存备用。转化在灭菌的1.5mL离心管中加入lOOiiL感受态细胞，于冰上加入连接产物5pL，用移液枪吸打均匀，冰浴30min;将离心管置于42'C的循环水浴中(勿震动)，热激卯s后迅速冰浴2min;再往离心管中加入400)iLLB培养液，在37。C摇床(200rpm/min)温浴复苏45-60min;离心，去除部分上清液，取lOO)iL复苏后的菌液布于含Amp的平板上，铺平；待液体充分吸收后，倒置平皿，于37'C培养14-16小时，观察有无菌落长出；阳性克隆子的鉴定及测序从平板上挑取转化好的菌斑接入含lmLLB的1.5mL离心管中并于37。C振摇培养约8h左右。以此菌液为模板，选用M13(上海生物工程有限公司提供)测序通用引物(退火温度58-6(TC)进行PCR扩增。电泳检测，挑取阳性克隆子的菌液送去测序，序列测定由大连宝生物工程有限公司完成。(3)DNA序列比对不同猪种的PCR产物序列经ClusterW软件进行序列比对，序列比对结果见图l。上述扩增片段大小为482bp，共存在两个碱基变异，其中位于该片段的269bp处的C/T变异引起了Sau3AI酶切位点(IGATC)多态性。据此，采用Sau3AI—RFLP方法进行SNP分型。PCR-RFLP诊断方法建立取8.5^ilPCR产物加入0.5^(10U/|al)限制性内切酶和lpl10xbuffer(含10xBSA)，37°CSau3AI酶切4h，取5|al酶切产物用琼脂糖电泳检测，在紫外灯下观察并记录酶切结果。此扩增片段大小为482bp，Sau3AI酶切多态性位点位于该片段的269bp处，当269bp处变异位点为T碱基时，会产生限制性内切酶Sau3AI的酶切位点(^GATC)，由于在扩增片段139bp处存在另外一个Sau3AI酶切位点，所以Sau3AI消化PCR产物后会产生3个片段(139bp，127bp和216bp)，将其命名为BB基因型；当269bp处变异位点为C碱基时(GACC)，则不存在Sau3AI，Sau3AI消化PCR产物后会产生2个片段(139bp和343bp)，将其命名为AA基因型；当269bp处变异位点位点为T/C杂合时，Sau3AI消化PCR产物后会产生4个片段(139bp，127bp，216bp和343bp)，将其命名为AB基因型。实施例2:分子标记在生产性状中的应用为了确定MMP23基因多态性与猪表型差异是否相关，选择黑龙江省兰西种猪场的40头民猪(207窝)和47头长白猪(215窝)为试验材料，整理各胎次的产仔性状记录(2001-2006)。采用实施例1所建立的Sau3AI-RFLP方法进行多态性检测，并分析猪MMP23基因Sau3AI-PFLP不同基因型与猪产仔数的相关关系。采用SAS统计软件(SASInstituteInc,Version8.0)GLM程序进行单标记方差分析，同时采用REG程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为^为性状表型值，w为平均值，G,为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用-1，0和1分别代表AA、AB和BB基因型，显性效应用1，-1和1分别代表AA、AB和BB基因型)；A、R、5)为固定效应，分别为胎次、年度、季节效应；％为残差效应。统计时，头胎和经产分别统计。不同基因型与繁殖性状间的统计分析结果总结于表1和2。可以看出，Sau3AI-RFLP基因型不同时，经产产仔数、经产产活仔数性状存在显著差异。从表1可看出，在经产民猪群体中，BB型个体的经产产仔数比AB型个体多1.43头(PO.05);BB型个体的经产产活仔数比AB型个体多1.46头(PO.Ol)。从表2可看出，在长白群体中，BB型个体的经产产仔数比AA型个体多1.88头，比AB型个体多1.91头(P0.05)，基因加性效应显著(PO.05);BB型个体的经产产活仔数比AB型个体多1.51头(PO.01),加性效应显著(P<0.05)。统计结果表明，在民猪和长白猪这两个具有不同遗传背景的群体中，BB型个体均具有较高的经产产仔数和产活仔数。因此在育种中选择BB基因型的个体能改善繁殖性状。关于图2的说明琼脂糖凝胶浓度为1.5%;M泳道DNAMarkerDL2,000;泳道l代表引物扩增片段，片段大小为482bp。9关于图3的说明琼脂糖胶浓度为2.5%;泳道M为DL2000Markers;1泳道为AA基因型，139bp和343bp;2、3、4、6、8、9泳道为AB基因型，139bp，127bp，216bp和343bp;5、7泳道为BB基因型，139bp，127bp和216bp。表l基因&3AI-RFLP基因型与民猪经产产仔数的统计分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注以上数值为最小二乘均值士标准误，数值上标的字母相同表示差异不显著，字母不同时，大写字母表示差异极显著，小写字母表示差异显著；加性效应负值表示B等位基因降低性状表型值，其上标*表示p<0.05，**表示p<0.01.(下表同)表2^filfi^J基因^"3AI-RFLP基因型与长白猪经产产仔数的统计分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>序列表及说明序列表SEQIDNO.l:是外来猪种"大白猪"的核苷酸序列；序列表SEQIDN0.2:是中国猪种"梅山猪"的核苷酸序列；序列表SEQIDN0.3:是中国猪种"清平猪"的核苷酸序列；序列表SEQIDN0.4:是实施猪MMP23基因C/T变异Sau3AI—RFLP基因型分型方法的特异核苷酸序列；序列表SEQIDN0.5:是实施猪MMP23基因C/T变异Sau3AI—RFLP基因型分型方法的特异核苷酸序列；。SEQUENCELISTING<110>东北农业大学<120>用MMP23基因预示和鉴定猪产仔数的分子标记方法<130>无<160>5<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>482<212>DNA<213>Susscrofa<220><221>gene<222>(1)..(482)<400>1acgccgctacacgctgacccccgccaggctgcgttgggaccactttaacctcacgtacag60gtgcgaccctggccctggggagcagtgcggggccgcctggccgccagccctgaccttgac120cagccaccccgctccccaggatcctctccttcccgaggaacctgctgagccccagcgaaa180cccggcggggcctggccgccgcctttcgcatgtggagcgacgtgtcccccttcagcttcc240gcgaggtggcccccgagcagcccagcgacctccgcataggtgggcgacctccgcagagat300gggcactgcgcccctgccccgccccggggccgcctctcagccctgtgctcccctaggctt360ctaccccgtcaaccacaccgactgcctggtctccccgctgcaccactgcttcgacggccc420cacgggcgagctggcccacgccttcttccccccgcacggcggcatccactttgacgacag480eg482<210>2<211>482<212>DNA<213>Susscrofa<220><221>gene<222>(1)..(482)<400>2acgccgctacacgctgacccccgccaggctgcgttgggaccactttaacctcacgtacag60gtgcgaccctggccctggggagcagtgcggggccgcctggccgccagccctgaccttgac120cagccaccccgctccccaggatcctctccttcccgaggaacctgctgagccccagcgaaa180cccggcggggcctggccgccgcctttcgcatgtggagcgacgtgtcccccttcagcttcc240gcgaggtggcccccgagcagcccagcgatctccgcataggtgggcgacctccgcagagat300gggcactgcgcccctgccccgccccggggccgcctctcagccctgtgctcccctaggctt360ctaccccgtcaaccacaccgactgcctggtctccccgccgcaccactgcttcgacggccc420cacgggcgagctggcccacgccttcttccccccgcacggcggcatccactttgacgacag480eg482<210>3<211>482<212>DNA<213>Susscrofa<220><221〉gene<222>(1)..(482)<400>3acgccgctacacgctgacccccgccaggctgcgttgggaccactttaaccteaegtacag60gtgcgaccctggccctggggagcagtgcggggccgcctggccgccagccctgaccttgac120cagccaccccgctccccaggatcctctccttcccgaggaacctgctgagccccagcgaaa180cccggcggggcctggccgccgcctttcgcatgtggagcgacgtgtcccccttcagcttcc240gcgaggtggcccccgagcagcccagcgatctccgcataggtgggcgacctccgcagagat300gggcactgcgcccctgccccgccccggggccgcctctcagccctgtgctcccctaggctt360ctaccccgtcaaccacaccgactgcctggtctccccgctgcaccactgcttcgacggccc420cacgggcgagctggcccacgccttcttccccccgcacggcggcatccactttgacgacag480eg482<210>4<211>18<212>DNA<213>Susscrofa<220〉<221〉gene<222>(1)..(18)<400〉4acgccgctacaegctgae18<210>5<211>20<212>DNA<213>Susscrofa<220><221>gene<222>(1)..(20)<400>5cgctgtcgtcaaagtggatg20权利要求1.一种用MMP23基因预示和鉴定猪产仔数的分子标记方法，其特征在于提供了大白猪、梅山和清平猪包括猪MMP23基因第2，3，4外显子和第2，3内含子的482bp的基因组核苷酸序列，SEQIDNO.1如下ACGCCGCTACACGCTGACCCCCGCCAGGCTGCGTTGGGACCACTTTAACCTCACGTACAGGTGCGACCCTGGCCCTGGGGAGCAGTGCGGGGCCGCCTGGCCGCCAGCCCTGACCTTGACCAGCCACCCCGCTCCCCAGGATCCTCTCCTTCCCGAGGAACCTGCTGAGCCCCAGCGAAACCCGGCGGGGCCTGGCCGCCGCCTTTCGCATGTGGAGCGACGTGTCCCCCTTCAGCTTCCGCGAGGTGGCCCCCGAGCAGCCCAGCGACCTCCGCATAGGTGGGCGACCTCCGCAGAGATGGGCACTGCGCCCCTGCCCCGCCCCGGGGCCGCCTCTCAGCCCTGTGCTCCCCTAGGCTTCTACCCCGTCAACCACACCGACTGCCTGGTCTCCCCGCTGCACCACTGCTTCGACGGCCCCACGGGCGAGCTGGCCCACGCCTTCTTCCCCCCGCACGGCGGCATCCACTTTGACGACAGCGSEQIDNO.2如下ACGCCGCTACACGCTGACCCCCGCCAGGCTGCGTTGGGACCACTTTAACCTCACGTACAGGTGCGACCCTGGCCCTGGGGAGCAGTGCGGGGCCGCCTGGCCGCCAGCCCTGACCTTGACCAGCCACCCCGCTCCCCAGGATCCTCTCCTTCCCGAGGAACCTGCTGAGCCCCAGCGAAACCCGGCGGGGCCTGGCCGCCGCCTTTCGCATGTGGAGCGACGTGTCCCCCTTCAGCTTCCGCGAGGTGGCCCCCGAGCAGCCCAGCGATCTCCGCATAGGTGGGCGACCTCCGCAGAGATGGGCACTGCGCCCCTGCCCCGCCCCGGGGCCGCCTCTCAGCCCTGTGCTCCCCTAGGCTTCTACCCCGTCAACCACACCGACTGCCTGGTCTCCCCGCCGCACCACTGCTTCGACGGCCCCACGGGCGAGCTGGCCCACGCCTTCTTCCCCCCGCACGGCGGCATCCACTTTGACGACAGCGSEQIDNO.3如下ACGCCGCTACACGCTGACCCCCGCCAGGCTGCGTTGGGACCACTTTAACCTCACGTACAGGTGCGACCCTGGCCCTGGGGAGCAGTGCGGGGCCGCCTGGCCGCCAGCCCTGACCTTGACCAGCCACCCCGCTCCCCAGGATCCTCTCCTTCCCGAGGAACCTGCTGAGCCCCAGCGAAACCCGGCGGGGCCTGGCCGCCGCCTTTCGCATGTGGAGCGACGTGTCCCCCTTCAGCTTCCGCGAGGTGGCCCCCGAGCAGCCCAGCGATCTCCGCATAGGTGGGCGACCTCCGCAGAGATGGGCACTGCGCCCCTGCCCCGCCCCGGGGCCGCCTCTCAGCCCTGTGCTCCCCTAGGCTTCTACCCCGTCAACCACACCGACTGCCTGGTCTCCCCGCTGCACCACTGCTTCGACGGCCCCACGGGCGAGCTGGCCCACGCCTTCTTCCCCCCGCACGGCGGCATCCACTTTGACGACAGCG。2.根据权利要求1所述的用MMP23基因预示和鉴定猪产仔数的分子标记方法，其特征在于所述的DNA序列，序列表SEQIDNO.l、SEQIDN0.2、SEQIDN0.3序列269bp处有一个碱基突变C269—T269，并导致Sau3AI—RFLP多态性。3.根据权利要求2所述C269—T269碱基突变，用于检测该突变的方法包括以下步骤从猪血液中提取基因组DNA，设计引物，PCR扩增，PCR产物Sau3AI—RFLP(RestrictionFragmentsLengthPolymorphism)基因型分型。4.根据权利要求3所述，用于PCR扩增的引物序列为SEQIDN0.4:ACGCCGCTACACGCTGAC;SEQIDN0.5:CGCTGTCGTCAAAGTGGATG。全文摘要本发明的目的在于提供一种寻找猪MMP23基因突变位点以及基因多态性的检测方法，也就是用MMP23基因预示和鉴定猪产仔数的分子标记方法。本发明提供了大白猪、梅山和清平猪包括猪MMP23基因第2，3，4外显子和第2，3内含子的482bp的基因组核苷酸序列，通过3个猪种(大白猪、梅山猪和清平猪)的基因组核苷酸序列进行ClusterW比对提供了位于该482bp扩增片段内部的两处单核苷酸多态性(SNP)。根据本发明的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，进而达到较好的选择效果。文档编号C12N15/11GK101440399SQ200810137260公开日2009年5月27日申请日期2008年10月7日优先权日2008年10月7日发明者崔世泉,熊远著,牛步月,王希彪申请人:东北农业大学