猪nr1h4基因的分子克隆及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于家畜分子分子生物学【技术领域】，具体涉及猪NR1H4基因的分子克隆及应用。本发明所述的分子标记由NR1H4基因克隆得到，其NR1H4分子标记的序列如SEQ?ID?NO：1所示。NR1H4基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的NR1H4基因序列设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用测序筛选SNP，并利用PCR－RFLP进行基因分型，发现第709bp处有一个A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-Mwo?I多态性，并利用该标记检测了中外猪种的情况。本发明为猪标记辅助选择提供了新的分子标记。
【专利说明】猪NR1H4基因的分子克隆及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于家畜分子生物学【技术领域】，涉及一种包含如SEQ ID NO:1所示猪基因核苷酸的核酸分子。本发明还涉及如SEQ ID N0:1所示的NR1H4基因的分子克隆方法及多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点以及检测所述单核苷酸多态性位点的方法。
【背景技术】
[0002]猪肉是动物性蛋白的主要来源，随着人们对肉需要量的增加，对肉质的要求也相应提高。影响猪肉质的因素有遗传和非遗传的，猪肌内脂肪含量对肉质性状有很大的影响，一般来说，肌内脂肪含量越高，猪肉质越嫩，从而肉质越好。肉质性状大多属于数量性状，由微效多基因控制。许多肉质性状只能在动物屠宰后才能测定，所以常规选育只能进行同胞或半同胞测定，这样必加大选育成本，且遗传进展缓慢。猪基因组草图的构建，使得寻找影响肉质性状的主基因或与其紧连锁的分子标记成为可能，这些分子标记一经确认，就可进行标记辅助选择育种。利用分子标记进行辅助选择(MAS)进行肉质性状改良是一种有效的途径。
[0003]NR1H4 (Nuclear Receptor subfamily I, group H, member4,NRlH4)基因，也称为法尼酯衍生物X受体(Farnesoid X receptor, FXR),是核受体的超家族成员之一,属核激素受体超家族，高于生理浓度的法尼酯衍生物轻度激活该蛋白，故又称为法尼酯衍生物X受体或“孤儿”核受体，人和小鼠NR1H4蛋白有α 1、α 2、β I和β 2几种亚型。该蛋白氨基端为配体非依赖的转录活化域、DNA结合域、铰链区和配体结合域，羧基端为配体依赖的转录活化域，具有典型的核受体结构。配体与配体结合域的结合改变了核受体空间构象，与靶基因启动子结合调节靶基因 的转录。初级鹅脱氧胆酸是NR1H4天然配体，人工合成的NR1H4配体有6-乙基鹅脱氧胆酸衍生物，其结合力比天然配体强数倍。次级胆汁酸石胆酸和脱氧胆酸可激活NR1H4。NR1H4蛋白对甘油三酯的形成有重要调节作用，而甘油三酯是脂肪的重要组成成分，NR1H4上调脂蛋白脂肪酶活化辅助因子载脂蛋白C-1I，下调脂肪酸合成的主要转录因子留醇反应元件结合蛋白-lc，使有调节脂质形成的乙酰辅酶A合成酶、脂肪酸合成酶等表达下降，从而减少脂肪酸，下调抑制因子脂蛋白C-1II，诱导极低密度脂蛋白受体表达，使富含甘油三酯的脂蛋白分解。NR1H4基因可诱导原代培养肝细胞过氧化物酶体增殖物激活受体α和其靶基因丙酮酸脱氢酶激酶4，促进脂肪酸氧化。
[0004]NR1H4基因位于人染色体12q23.1，小鼠10号染色体C2 | 10，遗传位置为44.98cM,大鼠(Rattus norvegicus)染色体 7ql3,斑马鱼(Danio rerio)18 号染色体CH211-264E16.3,恒河称猴(Macaca mulatta)ll 号染色体,牛(Bos taurus)5 号染色体,家鸡(Gallus gallus) I号染色体,家猪(Sus Scrofa) 5号染色体上。
[0005]NR1H4基因在脂肪形成中发挥重要作用，是胆汁盐受体，通过调控靶基因调节脂类形成，从而影响猪肌内脂肪的沉积，进而影响猪肉质性状。但是，目前国内外关于猪NR1H4基因的研究很少。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克隆猪NR1H4基因cDNA分子，寻找NR1H4基因的突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪肉质标记辅助育种提供一种有用的分子标记。
[0007]本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种克隆和检测猪NR1H4基因的分子标记及其应用，为猪肉质性状标记辅助选择提供有用的分子标记。
[0008]为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是:以人的NR1H4基因序列(GenBank 收录号为 NM_001206993)为种子序列，在 GenBank 中利用 BLASTN (Basic LocalAlignment Search Tool Nucleotide),参照其同源性在 80% 以上的猪 EST (ExpressionSequence Tags)设计特异引物,利用 RACE(Rapid Amplification of cDNA End),克隆出猪NR1H4基因cDNA全长，该猪NR1H4基因的DNA序列如SEQ ID N0:1所示。NR1H4基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的NR1H4基因序列设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用测序筛选SNP，并利用PCR - RFLP进行基因分型技术，发现第709bp处有一个A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-Mwo I多态性，并利用该标记检测了中外猪种的情况。
[0009]试验材料:25日龄沙子岭猪由湖南省湘潭市沙子岭猪资源场提供，取背最长肌-80 °C 保存，5 ' -RACE Version2.0 试剂盒购于 Invitrogen 公司，3 ' -RACESMARTer?RACE cDNAAmplification Kit 试剂盒购于 Clontech 公司。
[0010]总RNA提取与cDNA第I链的合成:用SUPERSCRIPT II RT酶和特异性引物GSP-1对总RNA进行基因第一链cDNA的合成，使用RNase Mix对合成的cDNA进行去RNA处理，最后对cDNA进行纯化。
[0011]引物设计:据GenBank人NR1H4基因(登录号:NM_001206993)序列保守区设计引物，引物设计的软件为Premiere5.0,引物设计的原则是特异性引物长度在23-28个核苷酸，GC含量在50%-70%，退火温度在65-70°C，使用巢式PCR进行扩增。
[0012]编码序列PCR扩增:以合成的猪cDNA为模板，在保守区设计引物经过克隆测序，获得该基因部分 CDS (coding domain sequence)序列。
[0013]5' -RACE扩增:使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA末端加上多聚C，使用弓丨物GSP5 (Gene-Specific Primers)和试剂盒中的桥连铆钉引物AUAP (表1)对已经加dC尾的cDNA进行PCR第一轮扩增；使用引物GSP-3和试剂盒里中的桥连通用扩增引物AUAP进行巢式PCR第二轮扩增，将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，纯化后的PCR产物与pMD18-T进行连接，转化后对阳性克隆进行测序，获得684bp的目的序列。
[0014]3' -RACE扩增:使用合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。将第一轮PCR扩增产物稀释50倍，然后用引物GSP3和UPM (Universal Primer A Mix)(表1)进行第二轮PCR扩增。将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化。纯化后的PCR产物与pMD18-T进行连接，转化后挑取阳性克隆测序。
[0015]将扩增得到的5' -RACE长度为684bp、3' -RACE扩增得到的长度420bp和扩增的长度为965bp的编码序列的序列拼接得NR1H4基因的全长cDNA序列，从而完成本发明的NR1H4基因的克隆的内容。
[0016]表1本发明中使用的引物序列
[0017]
【权利要求】
1.一种猪NR1H4基因序列如序列表SEQ ID NO:1所述；在序列表SEQ ID N0:1的709bp处有1个G/A的碱基突变，导致PCR-RFLP-Mwo I多态性。
2.检测权利要求1所述的一种猪NR1H4基因，扩增该片段的正向引物为5'-AGA GTGAAT GAC CAC AAG TT-3'，反向引物为 5' -ACT GGA ATT ATC TGC GTA CT-3'。
3.制备如权利要求1所述的猪NR1H4基因的方法，按照以下步骤: 利用权利要求2所述的引物进行PCR扩增，PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，利用限制性内切酶Mwo I对PCR产物进行酶切鉴定，最后用2%琼脂糖凝胶电泳检测GG、GA和AA基因型的分布。
4.权利要求1所述猪NR1H4基因在猪分子标记辅助选择中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103898120SQ201410090508
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2014年3月12日
【发明者】马海明, 杨虎, 蒋隽, 何俊, 贺长青 申请人:湖南农业大学