棉花的内生真菌cef-642及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及植物病理学，具体地涉及可以防治棉花黄萎病的棉花内生真菌CEF-642。CEF-642能够在人工培养基上培养，培养条件无特殊要求，以利于工厂化生产和推广应用。室内抑菌试验表明，对黄萎病控制效果好。对峙培养结果显示，CEF-642对棉花黄萎病菌的抑制率可达83.8%；挥发性代谢产物对黄萎病菌菌丝生长的抑制率为81.6%；非挥发性代谢产物可以完全抑制黄萎病菌的生长。温室试验结果显示，用CEF-642的培养滤液浸泡棉种可以较好的控制黄萎病的发生，最佳防效可达75.%；CEF-642培养物基质育苗法对黄萎病的防治效果也比较突出，防治效率可以达到73.1%。使用黄色蠕形霉CEF-642作为生防制剂，不影响棉花的正常生长，无毒副作用，对对人畜安全，环境友好。
【专利说明】棉花的内生真菌CEF-642及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物病理学，具体地涉及棉花内生真菌CEF-642及其应用。
【背景技术】
[0002]棉花黄萎病(Verticillium Wilt)是影响世界各大产棉区棉花(Gossypiumhirsutum L.)优质高产的首要病害,在我国，年发生面积达4500万亩,产量损失在10%~35%，年直接经济损失约23亿人民币，已经成为发展我国棉花生产的主要障碍。由于棉花黄萎病是一种全生育期的土传维管束病害，利用化学药剂进行黄萎病防治效果差，且对环境不友好。
[0003]生物防治是利用一种或多种生物或其代谢产物来降低植物病原物的数量或抑制其致病能力而减轻植物病害的一类措施。防治的主体集中在有益微生物，用来对抗植物病原菌的生长定殖。生物防治不仅能减少化学农药的使用，减轻其造成的环境污染，而且具有效果稳定、防效持久、对环境中有益微生物无影响等优点，是现代可持续农业系统中的重要组成部分。目前防治土传病害的主要方法是培育抗病品种、使用化学药剂和利用农业措施等，但防病效果都不理想。因此，以生物防治为主导的综合防治措施的研究，尤其对土传病害的防治具有非常重要的意义。
[0004]植物内生菌是继从土壤微生物中寻找抗菌物质后的另一类待开发的微生物类群。一些来源于植物的内生真菌越来越受到研究者的青睐，有研究表明部分内生真菌的天然代谢产物有抑制和杀灭许多病原微生物的作用，这些微生物包括感染人和动物的细菌、真菌、病毒等病原体以及植物病原菌等。但是在棉花中有关内生真菌的研究还处于初级阶段，特别是其生防潜能的研究鲜见报道。
[0005]本发明从棉花内生真菌入手，通过室内抑菌试验和温室接种试验综合评估，筛选对黄萎病菌具有较高抑制活性的菌株，获得对该病控制效果好的生防菌株CEF-642。在温室试验中，用稀释4倍的CEF-642培养滤液浸泡棉种12h，对棉花黄萎病的防治效果达75.0%，说明该内生真菌对黄萎病的防治具备巨大潜能。并且本发明采用滤液浸种，操作简单，防效稳定，推广性强。
【发明内容】
[0006]本发明的发明人为开发棉花内生真菌的生防潜力，评估其对棉花生产上的主要病害一黄萎病发生的控制能力，完成本发明。
[0007]本发明从棉花的内生真菌入手，通过分离、鉴定、室内筛选、温室的防效测定，获得对棉花黄萎病具有显著控制作用的菌株CEF-642 (Talaromyces flavus),其保藏编号为:CGMCC N0.8303。
[0008]该菌株是一株棉花的内生真菌，由于其对棉花不致病、无毒害作用。因此在分离时，首先要选择健康的棉株，对分离组织进行彻底的表面消毒，确保分离到的是棉花的内生真菌。[0009]选用了传统形态学鉴定和分子生物学鉴定相结合的方法，得知该棉花内生真菌菌株是一株黄色蠕形霉。
[0010]植物内生真菌是一类可以生活于健康植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的一类真菌，由于植物内生真菌在植物体内具有自主繁殖和传递的特性，生存状态稳定，不易受外界环境影响，因此可以与寄主植物长期共存、协同进化。此外，内生真菌具降解农药的潜能，可提高农田生态系统的生物多样性，维持生态平衡。因此来源于棉花健康叶部的内生真菌CEF-642可以在棉花体内大量定殖和生长，从而能够有效的抵御棉花黄萎病菌在维管束内的繁殖、扩展和蔓延。由于CEF-642的挥发性和非挥发性代谢产物均可以显著抑制棉花黄萎病菌菌丝的生长，尤其是非挥发性代谢产物可以完全抑制黄萎菌的生长，本发明选用了培养滤液浸种法和培养物玉米沙子基质育苗法来评估内生菌CEF-642对黄萎病的控制作用。综合考虑防治效果和可操作性，本发明推荐使用CEF-642培养滤液浸种法防治黄萎病。 [0011]利用棉花的内生真菌CEF-642来控制棉花黄萎病在以下三方面产生有益效果。
[0012]UCEF-642能够在人工培养基上培养，对培养条件要求宽泛，10_3(TC均可生长，该菌株在PDA、查氏及玉米沙粒培养基上生长良好，有利于大量繁殖和推广应用。此外，黄色蠕形霉在土壤中也普遍存在，可以广泛定殖。
[0013]2、在室内试验中，CEF-642对棉花黄萎病菌具有较好的抑制效果。在PDA培养基上，CEF-642和棉花黄萎病菌对峙培养时，对黄萎病菌抑菌效果达到83.8% ;挥发性代谢产物对黄萎病菌的抑菌率为81.6% ;非挥发性代谢产物可以完全抑制黄萎病菌的生长。
[0014]3、温室试验中，CEF-642可以稳定高效控制黄萎病的发生。将CEF-642的查氏培养滤液稀释4倍后，浸泡感病棉花品中冀棉11的种子(光子)12小时，将棉花种子播种于蛭石沙土制作的无底纸钵中，于棉苗一片真叶平展时接种棉花黄萎病强致病力菌株Vd080，棉苗2-3片真叶期调查黄萎病的发病情况。用CEF-642培养滤液处理再接种Vd080的棉花病情指数为15.2，未经CEF-642培养滤液处理直接接种Vd080的棉花病情指数为56.6，CEF-642对棉花黄萎病的控制效果为73.1%。将CEF-642玉米沙子培养物按照1%的质量比混入土壤沙子基质，对棉花黄萎病的发生控制率达73.1%。在温室采用滤液浸种法和培养物基质育苗法评估内生真菌CEF-642对黄萎病的生防效果，试验可重复性好，防效稳定。
[0015]4、CEF-642为环境友好型生防菌株，CEF-642分离自棉花，在棉花体内可以很好的定殖，土壤中也广泛存在，对多数的作物不致病，解决了具有生防潜力的微生物可能转变为致病菌的问题，因此对人畜、昆虫和作物安全，环境友好。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为CEF-642在PDA培养基上的菌落形态及显微形态；
[0017]图2CEF-642培养滤液浸种法对棉花黄萎病的控制作用:A，清水不接菌对照；B，清水浸泡棉种对照；C，稀释4倍的培养滤液浸种处理。
[0018]内生真菌CEF-642，于2013年10月10日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是:CGMCC N0.8303。【具体实施方式】
[0019]实施例1菌株的分离鉴定和培养
[0020](一)样品采集
[0021]于2012年6月份，在河南省安阳市中棉所试验田中，从健康的海岛棉植株上，采集数片真叶。
[0022](二)菌株的分离
[0023]先将采集到的海岛棉叶片用清水洗净，去皮，置于直径为9cm的灭菌的培养皿中，用75%的酒精消毒lmin。再用5.0%的次氯酸钠进行消毒30s，用灭菌水洗3次，。然后用灭菌的吸水纸沾干表面水分，用消毒剪刀剪成0.5cm2长的组织块，置于9cm的PDA培养基中，25°C培养。将最后一遍清洗液涂布于PDA培养基上，用于检验表面消毒是否彻底。每天观察皿内内生真菌的生长情况，发现有菌落长出，及时转移至新鲜的PDA培养基中培养，然后描述其菌落大小、颜色、表面特征、质地。
[0024](三)CEF-M2的特征
[0025]1、形态特征在PDA平板上，菌落致密，边缘有不规则褶皱，菌丝粗短，生长缓慢且分泌橙色色素；在菌落中部出现松散的白色气生菌丝(图1A);菌落背面呈米黄色(图1B)。400倍显微镜下，其分生孢子梗呈扫帚状，分生孢子卵圆形且串生(图1C)。
[0026]2、生理特征CEF-642对温度不敏感，在10_3(TC条件下均能生长，最适生长温度是28。。。
[0027]采用真菌通用引物ITS4/5扩增CEF-642的基因组，获得包含有部分18S、转录间隔区(ITS1)、5.8S、转录间隔区(ITS2)和部分28S的序列，依据CEF-642的生物学特征和分子鉴定结果，将其归属为Talaromyces flavus。
[0028](四)培养基及培养条件
[0029]1.PDA培养基马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15-20克，水I升，自然pH。称取削皮的200g马铃薯，切成小块置于锅中加水煮烂(煮沸20-30分钟)，用纱布过滤后，滤液中加入葡萄糖和琼脂继续加热搅匀，稍冷却后再补水至1L，分装到锥形瓶，加塞包扎后120°C灭菌20分钟。分装倒入培养皿中，接种CEF-642于中央，28°C，黑暗培养14d。
[0030]2.查彼(Czapek)液体培养基 KNO3, 2.0Og ；K2HPO4,1.0Og ；KCI,0.50g ；MgS04.7H20,
0.50g ；FeS04.7H20, 0.01g ;蔗糖，30.0Og ;加水至1L，分装到锥形瓶，加塞包扎后120°C灭菌20分钟。从固体培养基上挑取CEF-642的新鲜菌丝块接种至查氏液体培养基，置28°C恒温摇床，150rpm,黑暗条件震荡培养10d。
[0031]3.玉米粉沙子培养基将体积比为玉米粉:沙子=2:1的基质，加适量水(以潮湿且无渗水为易)混匀，放入克氏瓶中，120°C灭菌30分钟。接种CEF-642于克氏瓶中，25°C，黑暗静置培养14d。
[0032]实施例2CEF-642对棉花黄萎病菌的拮抗作用(室内)
[0033]1、试验方法
[0034]对峙培养法。挑取直径约为5_的棉花黄萎病强致病力菌株Vd080 (分离自河北沧州重病田)新鲜菌丝块，于PDA培养基上的一侧，与此同时接种同样大小的CEF-642菌丝块于另一侧，置于28°C温箱中黑暗培养。只接种VdOSO的平板为对照，每个处理设置4个重复。共培养14天后，测量大丽轮枝菌Vd080的菌落直径，利用公式计算抑菌率(GI)。[0035]%GI= R|r x_，其中Ri为对照中Vd080的菌落直径，R2为对峙培养中的Vd080的菌落直径。
[0036]对扣培养法。在两个直径90mm培养皿的皿底分别倒入一定量的培养基。凝固后，在其中一个皿盖的中心接入5μ I的黄色蠕形霉CEF-642的菌液(查彼液体培养7d)，在另一个皿盖中心接种5μ I的黄萎病菌Vd080的菌液(查彼液体培养7d)，然后用不透气的保鲜膜密封，放入28°C恒温培养箱中。以仅接种病原菌的培养皿为对照，每个处理重复4次。每天观察病原菌及生防菌的生长状况，对扣培养14d后采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算黄色蠕形霉CEF-642挥发性代谢产物对病原菌生长的抑制率。
[0037]圆盘滤膜法。在直径为9cm的PDA平板上，平铺上直径略大于9cm的双层玻璃纸(硝酸纤维素膜)，在平板中央接种5 μ I的黄色蠕形霉CEF-642菌液(查彼液体培养7d)，每个处理重复4次，25°C恒温培养箱内培养7d后去玻璃纸，再在平板中央接种接种5μ I的黄萎病菌Vd080菌液(查彼液体培养7d)，28°C恒温培养箱内再培养7d。以只接种Vd080的PDA平板为对照。用十字法测定菌落直径，计算抑制率。
[0038]2、试验结果
[0039]对峙培养结果显示，内生真菌CEF-642可以明显的抑制棉花黄萎病菌Vd080的菌丝生长。对照Vd080的菌落直径为6.1cm,而和黄色蠕形霉对峙培养的黄萎病菌的菌落直径仅为1.0cm, CEF-642对黄萎病菌的抑制率高达83.8±3.0% (表1)。
[0040]对扣培养法结果显示，CEF-642的挥发性代谢产物也可以抑制棉花黄萎病菌的生长。和CEF-642对扣培养的黄萎菌Vd080的菌落直径为1.LCEF-642对其生长的抑制率为81.6±0.8% (表 I)。
[0041]圆盘滤膜法培养结果表明，经CEF-642处理的棉花黄萎病菌停止生长，CEF-642分泌的代谢产物可以完全抑制黄萎菌生长，抑制率为100% (表1)。
[0042]表1CEF-642对棉花黄萎病菌生长的拮抗作用(室内试验)
【权利要求】
1.棉花的内生真菌(Talaromycesflavus)CEF_642,其特征在于,其保藏编号为:CGMCCN0.8303。
2.权利要求1所述棉花的内生真菌(Talaromycesflavus) CEF-642用于抑制黄萎病菌的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用稀释4倍的CEF-642的培养滤液浸泡棉种。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，使用1%的CEF-642培养物基质进行育苗。
5.权利要求1所述内生真菌CEF-642的培养方法，其特征在于，在PDA培养基、查彼液体培养基和玉 米沙子培养基上，28°C黑暗培养14天。
【文档编号】C12R1/645GK103834580SQ201410089971
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2014年3月12日
【发明者】李志芳, 朱荷琴, 冯自力, 赵丽红, 师勇强 申请人:中国农业科学院棉花研究所