专利名称：一种检测变异基因的pcr方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及聚合酶链式反应的方法。
背景技术：
经典PCR方法根据目标基因的顺序设计一对与之互补的引物，通过25-30个包括变性，退火和延伸三个步骤的循环完成扩增，其中，选择适宜的退火温度是扩增成功的关键之一。退火温度随目标基因和引物的设计不同而有所改变，但设定的退火温度在不同的循环中固定不变。不同来源的样本所含的目标基因的顺序往往因发生突变而有些区别，如果在与引物匹配的位置上有一个或多个碱基突变，则在引物和野生型模板能顺利退火的温度下，同一引物往往与变种模板不能退火使扩增失败造成检测假阴性。由于病毒基因极易突变由此导致的假阴性问题尤其显得严重。为了避免假阴性需要在病毒基因的保守区寻找引物已成为共识。但是由于病毒顺序的资料相当有限等原因在实际操作上往往难以做到这一点。例如，根据流行病情况科学家和临床医生都推测SARS病毒变异极快，但是从不同地区感染者样本中已分离到病毒并测定其基因组全顺序的数量相当有限，至今尚不清楚基因组的保守区和变异规律。这种情况下仅仅根据引物严谨性而选择的引物就存在出现严重的假阴性的潜在危险。而那些已测定上千个变种顺序的病毒如乙型肝炎病毒的同源性分析则表明，病毒基因组突变如此频繁而变化多端以至于在整个病毒基因组内难以找一对既有高严谨性又能与所有已知变种顺序完全匹配的引物。要找到引物使之与尚未测序的所有变种都完全匹配的可能性就更小。这就需要考虑在病毒基因的相对活跃区去寻找引物，这种情况下如何既要保持检测专一性又要避免假阴性是一个重要而至今未得到解决的问题。如果在引物与野生模板的最高允许或接近最高允许温度下退火，引物能专一地扩增野生模板，但在规定的退火温度下引物不能扩增与引物有几个碱基甚至一个碱基错配的变种模板从而造成漏检。反之，如果在比最高允许退火温度低许多度的温度下退火，引物能与有1个，2个，3个，4个，5个或更多错配的变种模板退火完成扩增，减少或消除了假阴性。但是在低退火温度下引物也可能与寄主基因组DNA中有较高匹配的非目标基因模板退火而形成非专一扩增产物。非专一扩增产物不仅对PCR产物的检测带来干扰，也可能通过竞争引物等机制抑制目标产物扩增从而造成目标基因检测的假阴性。至今尚无一种二全其美的方法既能专一地扩增产物同时假阴性又较低。本发明则提供了一个简单有效的解决之道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题本发明就是提供一种检测变异基因的PCR方法，以克服现有PCR方法不能够在扩增各种有突变的模板的同时又保持扩增的高度专一的缺陷，解决了PCR检测难以同时满足扩增专一性和检测假阴性的问题。
发明构思根据PCR的原理，形成最初扩增产物是完成扩增的必要条件，而最初扩增产物的形成需要经过二个循环。一个循环是从正和负模板链分别得到半扩增负和正链，另一个循环从半扩增正和负链得到最初的扩增产物。本发明通过调节引物的顺序和降低起初循环特别是第1或第2循环的温度使目标基因能得到最初扩增产物，而非目标基因的最初扩增产物流产。另一方面，尽管病毒基因非常容易突变但总能找到一个或许多个高度保守的约20个碱基长的片段，要在距该片段几百碱基的区域内再找一个高度保守的引物与之配对相当困难，但如果把另一个引物扩展至基因的相对活跃区域，则选择到高严谨性引物对的结会就大大增加。
技术方案本发明提供一种检测变异序列的聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括DNA模板变性解链；引物与模板退火；在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；然后按上述步骤循环进行合成反应，在PCR反应的起初1-10个循环中有一个循环的退火温度比其他循环低5-40℃。其优选方案为第一或第二循环的退火温度比其他循环低5-40℃，优选低15-30℃。
在本发明中，起初循环指PCR反应的最初1-10个循环。
上述的聚合酶链式反应方法的优选方案为第一或第二循环的退火温度范围为35-68℃，其余循环的退火温度为50-80℃；优选第一或第二循环的退火温度为45-60℃，其余循环的退火温度为65-75℃。
上述的聚合酶链式反应方法的另一种优选方案为，正、反引物之一设计在目标基因顺序的高度保守区域，称为保守引物，其与各种变异序列的错配碱基数＜4，且解链温度在65-92℃之间；优选错配碱基数＜2，且解链温度在68-85℃之间。
上述的聚合酶链式反应方法的另一种优选方案为，正、反引物中另一引物设计在目标基因顺序的变异相对活跃区域，称为可变引物，其与变异序列的错配碱基数＜15，且与完全匹配模板的解链温度在65-92℃之间；优选错配碱基数＜15，且与完全匹配模板的解链温度在68-85℃之间。
上述的聚合酶链式反应方法的另一种优选方案为当模板是正链DNA且正引物设计在变异序列，或者，当模板是负链DNA且反引物设在变异序列时，则采用低温退火的为第二循环。
设计可变引物时可从众多的变种中选择某一个变种的顺序作为模板，引物顺序与该模板完全匹配，而与其他变种顺序有1-15个碱基错配，最大允许错配碱基数取决于引物的长度、引物的解链温度、错配碱基在引物中位置、错配碱基的种类和错配碱基是否连续等等。也可根据目标基因的各种变种的顺序资料、出现频率和检测具体要求，调节引物的碱基使其虽然与所有已知的基因变种均有错配，但又与所有基因变种的错配碱基数较少。
保守引物可以是正引物也可以是反引物，可变引物同样可以是正引物也可以是反引物。设计引物时按常规方法考虑引物的严谨性。
如果模板是基因组DNA，可在PCR的起初循环的任何一个循环采用低温退火，优选在第一循环低温退火。
如果模板是正链DNA，正引物在第一循环“轮空”不起扩增作用。如果此时正引物设计在基因突变活跃区，可在起初循环中选一个循环采用低温退火，优选第二循环，但不能是第一循环。
如果模板是负链DNA(如由RNA得到的cDNA)，反引物在第一循环“轮空”不起扩增作用。如果此时反引物设在基因突变活跃区，可在起初循环中选一个循环采用低温退火，优选第二循环，但不能是第一循环。
低温循环的选择方法可用表1表示。
表1.低温循环的选择
下面以基因组DNA为模板和正引物为可变引物即位于基因的相对活跃区为例来说明发明的原理和过程。例如在第一循环采用低温退火，反引物即保守引物与目标基因正链退火形成半扩增负链，也可能与一些非目标基因退火形成非专一半扩增负链。同样，正引物与目标基因的各种变种和一些非目标基因退火形成各种半扩增正链。
由于在第二和以后的所有循环中均使用高温退火，反引物只与目标基因的各种变种的半扩增正链退火而形成最初的目标扩增产物；在高退火温度下反引物不与非目标基因的半扩增正链退火，从而使非专一扩增产物流产。在高退火温度下正引物不与非目标基因的半扩增负链退火，也使非专一扩增产物流产。正引物也可能不与目标基因的某些变种的半扩增负链退火，但是，在第一循环中由正引物退火延伸得到的目标基因的各种变种的半扩增正链，均能在第二循环中形成最初扩增产物，并将在随后的高温退火循环中不断扩增。
反之，按经典PCR每一循环的退火温度固定不变的方法，就不能同时满足假阴性低和专一性强。如选择高退火温度，正引物不能与目标基因某些变种的顺序退火导致假阴性；如选择低退火温度则正引物与非目标基因退火形成的非专一半扩增正链，可能在第二循环和随后的循环与反引物退火而形成非专一扩增产物。
需要注意的是，如果以cDNA为模板应用本发明，必须以Oligo(dT)或随机引物组作为反转录引物来合成cDNA。如果用基因专一引物进行反转录，则所得到的cDNA对目标基因扩增而言已不是原始模板而是半扩增负链。
有益效果本发明提供的检测变异基因的PCR方法，通过选择保守引物和可变引物以及应用特定的扩增程序，即起初1-10个循环中有一个循环的退火温度比其他循环低5-40℃的方法，使PCR能在既扩增各种变异模板的同时又保持扩增的高度专一，同时满足了增加扩增专一性和减少检测假阴性的双重要求，为多变异的基因序列模板的检测提供了工具。
此外，在实际应用中其有益效果也显而易见1.在缺乏目标基因变种顺序资料的情况下，应用本发明的一个循环低温退火，其余循环高温退火的方法，能减少可能的因基因突变导致的假阴性。
2.在有大量目标基因变种顺序资料的情况下，应用本发明方法可以扩展搜寻引物的区域，有更多机会找到高严谨性的引物对。
具体实施例方式
实施例1实施例1以人beta肾上腺素受体基因作为目标基因，观察分析第一和第二循环低退火温度对非专一产物形成的影响。正反引物都与目标基因完全匹配，引物顺序和特性示于表2。
表2.实施例1引物顺序
表3.实施例1引物的特性
PCR反应采用用ClonTech公司Advantage-2-PCR试剂盒，每管反应液体积5微升，正反引物浓度各0.4uM，首次变性95℃1分钟，循环变性95℃10秒钟。低温退火为60℃30秒，延伸72℃1分钟；高退火温度为72℃，退火延伸合为一步共1分半钟。总循环数32。人基因组DNA系Clontech产品，每100微升加0.5微克；cDNA由人组织总RNA以Oligo(dT)为引物，按Clontech反转录试剂盒推荐方法合成。每100微升PCR反应液加cDNA5微升。试验结果示于表4。
表4.实施例1试验结果
试验结果说明无论以cDNA还是基因组DNA为模板，如果在第一或第二循环采用低温退火与始终采用高温退火一样都只形成目标产物而没有非专一产物形成。说明一个循环低温不会导致非专一扩增产物形成。反之，如果第一和第二循环都采用低温退火则就有非专一扩增条带出现，其结果与所有循环都采用低温退火相似。说明经过二次低温退火循环最初的非专一产物已形成，再提高退火温度已为时过晚。
实施例2
实施例2以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因作为目标基因，观察分析在引物中引入错配碱基后最高允许退火温度的变化。正反引物顺序和特性示于表5和表6。其中GW正和GW反为与模板完全匹配的正反引物，GM正为与模板有8个碱基错配的正引物，GM反为与模板有9个错配碱基的反引物，错配碱基均以下划线表示。
表5.实施例2引物顺序
表6.实施例2引物的特性
PCR反应所用试剂和方法与实施例1相同，但应用梯度退火温度测试最高允许退火温度，退火时间30秒钟，延伸步骤为73℃1分钟。试验结果示于表7。
表7.实施例2试验结果
结果表明如引物与模板完全匹配，引物能在73℃高温下退火完成扩增。当正引物含8个错配碱基后，最高允许退火温度降低至约55℃。
实施例3实施例3也以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因作为目标基因，观察分析在正引物中引入错配碱基后第一或第二循环低温退火对完成目标扩增产物的作用。所用引物，试剂和反应条件与实施例2相同。试验结果示于表8。
表8.实施例3试验结果
结果表明如果一个引物与模板有大量错配不能在高退火温度条件下完成扩增，但只要有一个循环是在低温退火就能在其余循环均是高温退火的条件下完成扩增。如果正反引物均与模板有大量错配碱基，就必须有二个循环是低温退火才能在其余循环均是高温退火的条件下完成扩增。但根据上述的说明和实施例1的结果，经历二个低温循环非专一扩增就可能形成。
实施例4.
实施例4为用一个循环低温退火方法减少或消除乙型肝炎病毒检测假阴性的设计方案和实施条件。正引物引自文献但在5’端延长几个碱基，对基因库的HBV顺序的同源性分析表明该引物相当保守，借助引物设计软件的帮助很容易在正引物下游几百碱基的范围内找到与正引物匹配的有高严谨性的反引物。表9和10例举其中扩增产物长度约为200，350和700的三个反引物的顺序和特性。引物位置以基因库编号为E00010的乙肝病毒变株顺序为准。
表9.实施例4引物顺序
表10.实施例4引物的特性
同源性分析表明HBV反1，HBV反2和HBV反3引物与部分变种的顺序完全匹配，但与部分变种分别在引物的5’端，第8和15位碱基，5’端，第8和14位碱基或第5和16位有错配。第一循环的退火温度可低至40℃，其余循环退火温度可高至74℃。正引物和表10中任一个反引物配对，均能专一地扩增顺序与之完全匹配的模板，也能专一地扩增与之有上述若干错配的模板。
权利要求
1.本发明提供一种检测变异序列的聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)DNA模板变性解链；(2)引物与模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；按步骤(1)-(3)循环进行合成反应，其特征在于在PCR反应的起初1-10个循环中有一个循环的退火温度比其他循环低5-40℃。
2.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于第一或第二循环的退火温度比其他循环低5-40℃。
3.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于第一或第二循环的退火温度比其他循环低15-30℃。
4.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于第一或第二循环的退火温度为35-68℃，其余循环的退火温度为50-80℃。
5.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于第一或第二循环的退火温度为45-60℃，其余循环的退火温度为65-75℃。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于正、反引物之一与各种变异序列的错配碱基数＜4，且解链温度在65-92℃之间。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于正、反引物之一与变异序列的错配碱基数＜2，且解链温度在68-85℃之间。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于正、反引物中另一引物与变异序列的错配碱基数＜15，且与完全匹配模板的解链温度在65-92℃之间。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于正、反引物中另一引物与变异序列的错配碱基数＜10，且与完全匹配模板的解链温度在68-85℃之间。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于当模板是正链DNA且正引物设计在变异序列，或者，当模板是负链DNA且反引物设在变异序列时，则采用低温退火的为第二循环。
全文摘要
本发明提供一种检测变异基因的PCR方法，通过选择保守引物和可变引物以及应用特定的扩增程序，即起初1－10个循环中有一个循环的退火温度比其他循环低5－40℃的方法，使PCR能在既扩增各种变异模板的同时又保持扩增的高度专一，解决了现有方法难以同时满足扩增专一性和检测假阴性的问题，适合多变异的基因序列模板的扩增反应，特别是病毒基因的检测。
文档编号C12P19/00GK1580279SQ0314198
公开日2005年2月16日 申请日期2003年7月31日 优先权日2003年7月31日
发明者徐定邦, 朱德芬, 程光胜, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧