一种仔猪腹泻病毒变异株部分s基因及其原核表达载体的构建方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，具体涉及一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因及其原核表达载体的构建方法，该构建方法由以下步骤组成：(a)以F1与R1为引物，F1：5’-GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3’；R1：5’-GTCGACTTAATTAAATGATGG-3’；利用PCR反应扩增得到如SEQ ID NO.1所示的编码仔猪腹泻病毒变异株部分S基因的基因序列；(b)将上述编码的仔猪腹泻变异株部分S基因序列连接至pET32a载体上，得重组表达载体pET32a-bs1；(c)将重组表达载体pET32a-bs1质粒转入大肠杆菌BL21菌株，250rpm震荡培养至对数期OD600＝0.6～0.7，加入1mmol/L IPTG，37℃诱导6h表达目的蛋白即仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体的构建，完成。
【专利说明】—种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因及其原核表达载体的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因及其原核表达载体的构建方法。
【背景技术】
[0002]猪流行性腹泻是由病毒引起的以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种急性、高度接触性肠道传染病。猪流行性腹湾病毒(porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)，只有一个血清型，属于冠状病毒科冠状病毒属，能感染各种年龄的猪都发病。
[0003]PEDV临床表现为水样腹泻，并伴有呕吐；所有日龄猪均可发生，其中出生10日龄以内哺乳仔猪，常常在维持腹泻2-4天后，脱水大量死亡(50% -100% )。一些地方的养猪场几乎整窝发病，呈水样腹泻，发病率高，病死率高，不死的仔猪成为弱仔和僵猪。日龄较大的哺乳仔猪的发病率和病死率相对较低一些。PEDV以感染乳猪、造成严重损失为特征；自2000年左右韩国大流行以来，周边地区均有暴发，我国一直处于地方性流行状态；PEDV在局部地区首先暴发后，未能及时有效控制，逐渐蔓延后，出现大流行。
[0004]自PEDV发现以来，各国学者使用多种方法尝试使病毒适应细胞，进行体外培养扩增。1988年瑞典Hoffman等首次在Vero传代细胞的培养液中加入胰酶，通过细胞上连续盲传成功获得病毒的细胞培养。随后日本和韩国也相继有培养成功的报道。但不同来源的Vero细胞、不同毒株和培养条件都是影响病毒分离的重要因素。PEDV的体外细胞培养适应难度大，繁殖条件复杂，病毒在细胞中繁殖滴度低，细胞病变不明显，一直是PEDV体外增殖过程的一个重要技术瓶颈。要分离到一株该病毒需要时间较长，工作量大，相关疫苗的发展也受到影响与限制。
[0005]目前，虽然商品化PEDV疫苗已普遍使用，有多个厂家的灭活苗和弱毒苗供选择，但免疫效果一直不理想，该病在我国仍有流行，并引起严重的经济损失。通过对病毒的分析，猪流行性腹泻病毒的结构蛋白与其他冠状病毒相似，糖基化纤突(spike)蛋白为主要结构蛋白。2010PED野毒在纤突蛋白基因区域出现插入性突变，该区域为病毒的抗原决定区域。经典毒株CV777制备的疫苗以及变异前毒株(与经典毒株处于同一进化分支的)制备的疫苗，在病毒S蛋白发生变异后，疫苗治疗效果大打折扣，治疗效果不明显。为了对已变异的仔猪腹泻病毒PEDV进行有效的治疗，研制一种新的有效的PEDV疫苗十分必要。
【发明内容】
[0006]本发明的目的:(I)提供一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因；(2)提供一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体的构建方法；(3) —种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因在大肠杆菌中的表达方法。
[0007]本发明的技术方案:(1) 一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因，所述S基因由序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列组成。(2) —种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体的构建方法，其特征在于:该构建方法由以下步骤组成:
(a)以Fl 与 Rl 为引物，Fl:5’ -GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3 ’ ；R1:5’ -GTCGACTTAATTAAATGATGG-3’ ；利用PCR反应扩增得到如SEQ ID N0.1所示的编码仔猪腹泻病毒变异株部分S基因的基因序列；所述PCR反应体系为:2XEx Taq PCR premix10 μ l，cDNA 2 μ 1，引物混合物I μ 1，双蒸水7 μ I ;反应参数分为3步，第I步为95°C 5min，第 2 步为 95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 2min，35 个循环，第 3 步为 72°C延伸 1min ；
(b)将上述编码的仔猪腹泻变异株部分S基因序列连接至pET32a载体上，得重组表达载体 pET32a-bsl ；
(c)将重组表达载体pET32a-bsl质粒转入大肠杆菌BL21菌株，250rpm震荡培养至对数期OD6tltl = 0.6?0.7，加入lmmol/L IPTG，37°C诱导6h表达目的蛋白即仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体的构建，完成。
[0008](3) 一种仔猪腹湾病毒变异株部分S基因在大肠杆菌中的表达方法,该表达方法有如下步骤组成:(I)挑取权利要求2中所述的大肠杆菌BL21菌落，接入含有抗生素的LB培养基，培养过夜；(2)取过夜培养物转接入含有抗生素的新鲜LB培养液中，250rpm震荡培养至对数期OD6tltl = 0.6?0.7 ; (3)在培养物中加入浓度为lmmol/L的IPTG，37°C，诱导表达6h后，8000rpm，20min离心处理收集含有重组仔猪腹泻病毒变异株部分S基因的大肠杆菌菌体沉淀。
[0009]所述的质粒载体是含有SEQ ID N0.1基因，通过插入pET32a载体构建成的。所述的重组工程菌是由上述质粒载体转化原核宿主细胞株得到的。该重组工程菌的原核宿主细胞株是大肠杆菌。所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。在合适的条件下于培养基中培育上述大肠杆菌。
[0010]本发明构建了仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体。通过应用PCR技术合成了仔猪腹泻变异株部分S基因序列，将该基因序列克隆至pET32a中，得到重组表达载体pET32a-bsl，再通过CaCl2转化大肠杆菌，根据生长情况快速筛选出表达量较高的阳性克隆转化子bsI，该表达蛋白目前可以通过大肠杆菌发酵生产，具有良好的应用前景。
[0011]有益效果:S蛋白是在PEDV的重要结构蛋白，可诱导机体产生中和抗体，是研究PEDV基因工程疫苗的主要目的基因。本发明成功构建了一株重组原核表达蛋白，能够稳定表达PEDV部分S基因蛋白。通过western-blotting试验证明重组蛋白具有反应原性；仔猪免疫试验证实，免疫激发了机体产生了针对仔猪流行性腹泻病毒变异株部分S蛋白的特异性的抗体，抗体中和效价达到>1:32，所构建重组蛋白具有免疫原性。本发明所构建部分S基因包含纤突蛋白基因区域出现的插入性突变部分，为PEDV新型变异株基因工程疫苗的研究奠定了重要基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0013]图1为本发明的构建流程图；
图2重组蛋白在E.coli BL21中的表达产物电泳图。其中，条带1:pET_32a空载体诱导；条带2:重组表达载体pET-32a_bsl未诱导；条带3:重组表达载体pET_32a bsl诱导4h ;条带4:重组表达载体pET-32a bsl诱导5h ;条带5:重组表达载体pET_32a bsl诱导6h ;条带6:重组表达载体pET_32a bsl诱导7h ；M:标准蛋白Marker
【具体实施方式】
[0014]实施例1.仔猪腹泻病毒变异株部分S基因序列的获得，根据仔猪腹泻病毒变异株的基因序列，设计以下引物:F1:5’ -GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3’ ；R1:5， -GTCGACTTAATTAAATGATGG-3，；
利用PCR反应扩增编码腹泻病毒变异株部分S基因序列，PCR反应体系为(20 μ I):2XEx Taq PCR premix 10μ l,cDNA 2 μ 1，引物混合物I μ 1，双蒸水7 μ I。反应参数分为3步，第 I 步为 950C 5min,第 2 步为 95V 30s, 57°C 30s, 72°C 2min, 35 个循环，第 3 步为 72°C延伸lOmin。琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，回收产物连接pMD19_T克隆载体，筛选阳性质粒送上海生工生物工程有限公司测序，所得序列例如SEQ ID N0.1所示。
[0015]实施例2.重组大肠杆菌表达载体的构建
用EcoR I和Sal I分别双酶切PCR扩增产物和pET32a质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，用T4DNA连接酶连接回收的目的条带，得到原核表达载体pET32a-bsl，用CaCl2法热激90秒将其转化到大肠杆菌BL 21(DE3)。利用Amp抗性筛选单菌落。所选转化克隆经PCR，酶切鉴定证明克隆正确后送北京博迈德生物工程有限公司测序。具体构建流程见图1.实施例3.重组大肠杆菌表达载体的转化和筛选
将鉴定正确的重组表达载体pET32a-bsl质粒转入大肠杆菌BL21菌株，加入lmmol/L的IPTG诱导表达6h，加入磷酸缓冲液重悬细胞。
[0016]实施例4.变异株部分S基因在大肠杆菌中的表达
在1ml含100 μ g/ml Amp的LB液体培养基中，按1:1000接种BL21_pET32a_bsl菌液，370C，250rpm震荡培养过夜；次日按1:50接种培养过夜的菌液至含100 μ g/ml的新LB液体培养基中，37°C，250rpm震荡培养至OD6tltl = 0.6?0.7 ;每管分别加入IPTG至终浓度为lmmol/L，37°C诱导表达；分别在诱导4h，5h，6h，7h后收集菌液，4°C，8000rpm离心收集菌体；加入1ml 0.0lM的磷酸盐缓冲液(简称PBS,pH 7.4)重悬菌体。4°C,8000rpm离心20min，弃上清。重复洗涤菌体一次。加入5ml上述缓冲液重悬菌体。SDS-PAGE电泳检测，如图2所示。在69kDa位置附近出现一条高表达量的特异性条带，分子量大小约69kDa，与理论值相符。
[0017]本发明的重组载体pET32a_bsl可以表达获得重组蛋白，小量制备蛋白免疫仔猪，免后2周检测抗体，可产生特异性抗体。本发明的成果将为PEDV基因工程疫苗的研究奠定基础。
【权利要求】
1.一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因，其特征在于:所述S基因由序列表中SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列组成。
2.—种仔猪腹湾病毒变异株部分S基因原核表达载体的构建方法,其特征在于:该构建方法由以下步骤组成: (a)以Fl 与 Rl 为引物，Fl:5’ -GAATTCGATGTCACCAGGTGCT-3 ’ ；R1:5’ -GTCGACTTAATTAAATGATGG-3’ ；利用PCR反应扩增得到如SEQ ID N0.1所示的编码仔猪腹泻病毒变异株部分S基因的基因序列；所述PCR反应体系为:2XEx Taq PCR premix10 μ l，cDNA 2 μ 1，引物混合物I μ 1，双蒸水7 μ I ;反应参数分为3步，第I步为95°C 5min，第 2 步为 95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 2min，35 个循环，第 3 步为 72°C延伸 1min ； (b)将上述编码的仔猪腹泻变异株部分S基因序列连接至pET32a载体上，得重组表达载体 pET32a-bsl ； (c)将重组表达载体pET32a-bsl质粒转入大肠杆菌BL21菌株，250rpm震荡培养至对数期OD6tltl = 0.6?0.7，加入lmmol/L IPTG，37°C诱导6h表达目的蛋白即仔猪腹泻病毒变异株部分S基因原核表达载体的构建，完成。
3.一种仔猪腹泻病毒变异株部分S基因在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于:该表达方法有如下步骤组成:(I)挑取权利要求2中所述的大肠杆菌BL21菌落，接入含有抗生素的LB培养基，培养过夜；(2)取过夜培养物转接入含有抗生素的新鲜LB培养液中，250rpm震荡培养至对数期OD6tltl = 0.6?0.7 ; (3)在培养物中加入浓度为lmmol/L的IPTG，370C，诱导表达6h后，SOOOrpm, 20min离心处理收集含有重组仔猪腹泻病毒变异株部分S基因的大肠杆菌菌体沉淀。
【文档编号】C12N15/70GK104357461SQ201410710763
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】程兰玲 申请人:新疆天康畜牧生物技术股份有限公司