新的猪圆环病毒及其共培养细胞株的制作方法

本发明属于细胞工程与病毒培养技术领域，具体地说，本发明涉及猪圆环病毒,及可与猪圆环病毒共培养的PK15细胞株，大量培养制备PCV2病毒的方法及应用。

背景技术：

目前国内正在使用的猪圆环病毒疫苗主要有2种----亚单位苗和全病毒疫苗。亚单位苗虽安全性较好，但生产成本高昂，免疫期短。因此国内绝大部分猪场仍以全病毒疫苗为主。但全病毒疫苗生产亦有其技术瓶颈：（现有的）圆环病毒体外培养的细胞感染能力不高，感染速度慢，病毒在不同细胞个体中的复制速度差异极大，病毒培养效价很难在短时间内上升到理想状态，为解决该难题，所有生产者都在其培养工艺中增加一个用D-氨基葡萄糖处理，使细胞停留于细胞分裂的S期，以此保证病毒扩增的程序（严伟东《猪病专题2010年学术年会论文集》1184-1188）。但该程序不仅增加了原材料投入，而且增多了生产环节和人力投入，增加了废弃物排放量，使生产成本至少增加1倍以上，即便如此，国内许多厂家用此方法生产的生产的圆环病毒疫苗，其病毒效价在10⁴以下，免疫效果较差。也有人采取筛选对圆环病毒高度敏感细胞系培养圆环病毒其病毒含量均在10⁶以上，免疫效果较好，但生产成本依然高昂。因此如何提高圆环病毒的培养效价是国内厂家目前改良工艺的主攻方向。

此外，由于普通圆环病毒在培养过程中不能使细胞发生病变表现（严伟东《猪病专题2010年学术年会论文集》1184-1188），病毒的收获时间确定具有很大的盲目性，这也是造成目前疫苗质量较差的原因之一。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种新的猪圆环病毒PCV2，该病毒在宿主细胞PK15可大量扩增，且可使宿主细胞PK15发生可视轻微病变，但不致细胞凋亡。

本发明的一个目的是提供一种与猪圆环病毒共培养的PK15细胞株，该细胞携带PCV2病毒，能稳定培养并产生PCV2病毒，细胞株发生可视轻微病变，但能稳定传代培养并产生PCV2病毒。

本发明的另一个目的是提供一种大量制备PCV病毒的方法。

本发明的再一个目的是提供新的细胞株在培养猪圆环病毒中的应用

本发明的再一个目的是猪圆环病毒PCV2在预防和治疗猪圆环病毒病毒中的应用。

本发明公开了一株新的猪圆环病毒PCV2突变株，其特征在于：PCV2突变株至少有9个位点的碱基突变，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，该病毒是猪圆环病毒GY-PCV2株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201660。

猪圆环病毒GY-PCV2株是从表现猪圆环病毒病症状的病猪体内分离的，分离方法包括下列步骤：

（1）无菌操作取下已有明显临床症状的为患猪圆环病毒病的病猪的腹股沟淋巴结，用含2万单位/ml的青霉素和200ug/ml的链霉素混合液洗涤7次以上，并捣成均浆，离心，过虑除菌获得病料液；

（2）将病料液与含2%血清的DMEM维持培养基1:1混合；

（3）接种混合液至对数生长期的PK-15细胞上进行感染；

（4）感染并培养24小时后弃去接种液，加少许3mM的D-氨基葡萄糖铺盖细胞，继续培养2小时，PBS洗涤5次，加入2%血清的DMEM维持液继续培养。

（5）培养72小时后，取上清液，用PCV2专用PCR检测试剂盒检测，留下阳性表现最强的细胞继续盲传5代，收获第5代上清液，4000转/分离心30分钟，再次病毒测定确证为强阳性后收集，冻干保存或直接液氮冻存；

（6）将步骤（5）收获的病毒液送商业化测序公司进行测序鉴定。

测序结果显示，该病毒基因组与所有现已报道的毒株基因组序列99%吻合，与最接近的基因组比对发生了至少9个碱基突变。证明其为PCV2的一个新突变株，命名为GY-PCV2。

（7）将步骤（5）收获的病毒液进行攻毒检测

攻毒结果显示：GY-PCV2能够使被攻毒猪只发生典型的猪圆环病毒病的症状，从共度猪病料组织分离的病毒经测序验证，与GY-PCV2基因序列完全吻合。

（8）将步骤（5）收获的病毒液进行PCV2免疫荧光检测

免疫荧光试验结果显示：GY-PCV2显示PCV2免疫荧光强阳性反应，说明其具有PCV2抗原性。

（9）对已获得的病毒连续培养20代，收获第20代病毒液，送基因测序公司测定病毒的全基因组序列。测定结果与步骤（6）的全基因组序列100%吻合，说明该PCV2突变株有较强的遗传稳定性。

本发明将猪圆环病毒GY-PCV2株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201660。保藏日是2016年12月5日。

本发明公开了一株携带PCV2病毒的PK15细胞株，其特征在于，该细胞是PK15细胞经PCV2突变株感染筛选获得，该细胞可稳定培养，在对数生长期后更换维持液继续培养2-5天后细胞发生可视轻微病变，但不致细胞凋亡，该细胞是GY-PCV2-PK15细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2016201。

GY-PCV2-PK15细胞株是将猪圆环病毒突变株PCV2与猪肾细胞PK15共培养筛选获得，该细胞具有稳定培养的生长特征；进入对数生长期后，更换维持液继续培养2-5天后细胞发生可视轻微病变，但不致细胞凋亡；可连续产生病毒PCV2.

本发明公开了筛选获得GY-PCV2-PK15细胞株的方法，该方法包括下列步骤：

（1）将从CCTCC购买的GDC061猪肾细胞系PK15至对数生长期；

（2）接种PCV2突变株至猪肾细胞系PK15，培养24小时后，弃去上清液，用3mmol的D-氨基葡萄糖PBS溶液处理细胞2小时，弃去D-氨基葡萄糖PBS溶液，用PBS洗涤细胞5次。换维持液培养染毒后的细胞72小时后，取上清，用PCV2特异性荧光定量PCR检测试剂盒测定其中PCV2，当测定CT值低于或等于阳性对照的CT值时，证明此时的PK-15细胞已经携带PCV2的PK-15混合细胞；

（3）用胰蛋白酶消化，加培养基中和，离心，用培养基调细胞密度在1-10个/ml的细胞悬液，将该细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔200ul细胞悬液，培养3日后，在显微镜下观察，留下只有单个细胞克隆生长的培养孔，继续培养；

（4）将培养基更换成维持液，以单个细胞克隆培养过程中是否出现“拉网式”病变作为病毒是否出现感染的选择指标进行目标克隆筛选。单个细胞克隆长满培养孔后，按照1：2比例传代细胞，新传代的细胞分别接种于2块不同的新培养板中，做好对应编号标记，当2块培养板中的细胞均已长满细胞孔，其中1块板的细胞继续传代，另1块板，将其细胞培养基更换成维持液，继续培养72小时后，观察细胞是否出现拉网式病变，将那些出现病变的细胞连同上清液冻融3次，反复吹吸均匀后取样，用病毒DNA提取专用试剂盒提取DNA，以PCV2荧光定量PCR检测试剂盒作PCV2的定量PCR检测，留下CT值最小的对应编号的细胞继续传代，直至选择到CT值最小而细胞又能稳定传代的细胞克隆，其中一株细胞株可稳定传代，且可大量产生PCV2病毒，此细胞株命名为GY-PCV2-PK15细胞株。本发明将GY-PCV2-PK15细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2016201。保藏日是2016年12月5日。

本发明还公开了大量制备猪圆环病毒的方法。该方法包括下列步骤：

1)用常规方法接种培养GY-PCV2-PK15细胞株至对数生长期，细胞长满单层

2)用维持液更换培养液继续培养2-5天；

3)在显微镜下或逆光下观察，细胞出现拉网式病变；

4)收集细胞培养上清液，即为PCV2病毒液；

5)对贴壁细胞消化传代，重复1-4，再次获得PCV2病毒液。

本发明还公开了新的猪圆环病毒和细胞株在培养猪圆环病毒中的应用。

本发明也公开了猪圆环病毒PCV2在预防和治疗猪圆环病毒病毒中的应用。

本发明的优点：于现有技术相比，本发明有如下优点：

1、病毒效价的大幅度提高：现有报道的培养PCV2技术较高水平，在使用D-氨基葡萄糖处理的情况下，其病毒效价也只达到10^-5.5-10^-6，本发明只需直接培养GY-PCV2-PK-15细胞，即可获得效价为10^-6.5-10^-7的病毒效价。

2、产毒细胞有明显可视的病变特征，这是我们判断培养物中是否已经开始产生病毒提供了极大的方便，传统培养方法由于产毒状态和不产毒状态细胞外型无区别，只有依靠反复取样检测才能确定收毒时间，这将大大增加成本，也增加污染风险。

3、培养工艺的大幅度简化。本发明只需直接培养细胞就可获得高效价病毒，而现行技术，每批次培养病毒必须经历接种病毒、D-氨基葡萄糖的产毒诱导剂处理等一系列繁琐的程序，每个程序，都需要将培养体系中的培养液体更换掉。因此本发明不仅减少了操作环节，而且大幅度降低原料投入和废弃物的产生量，具有极显著的降低生产培养的优势。

附图说明

图1是GY-PCV2-PK15细胞株形态图

图2 是正常猪肾细胞PK15形态图

图3是GY-PCV2-PK15细胞株免疫荧光显示图

图4是GY-PCV2-PK15 细胞生长曲线

图5是GY-PCV2-PK15培养时病毒PCV2生产曲线

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1 生物材料来源，保藏及培养基

猪肾细胞系PK15 来源于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC GDC061，研究者可从CCTCC购买

PCV2病毒来源于自主分离，筛选的猪圆环病毒GY-PCV2株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201660。保藏日是2016年12月5日。

GY-PCV2-PK15保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO：C2016201，保藏日期是2016年12月5日。

培养基MEM+10%FBS+1%双抗, 维持液MEM+2%FBS+1%双抗

实施例2：猪圆环病毒GY-PCV2株的分离和测序

（1）无菌操作取下已有明显临床症状的为患猪圆环病毒病的病猪的腹股沟淋巴结，用含2万单位/ml的青霉素和200ug/ml的链霉素混合液洗涤7次以上，并捣成均浆，离心，过虑除菌获得病料液；

（2）将病料液与含2%血清的DMEM维持培养基1:1混合；

（3）接种混合液至对数生长期的PK-15细胞上进行感染；

（4）感染并培养24小时后弃去接种液，加少许3mM的D-氨基葡萄糖铺盖细胞，继续培养2小时，PBS洗涤5次，加入2%血清的DMEM维持液继续培养。

（5）培养72小时后，取上清液，用PCV2专用PCR检测试剂盒检测，留下阳性表现最强的细胞继续盲传5代，收获第5代上清液，4000转/分离心30分钟，再次病毒测定确证为强阳性后收集，冻干保存或直接液氮冻存；

（6）将上述收获的病毒液送商业化测序公司进行测序，所用引物是

SEQ NO：2 AGGCCTACGTGGTCTACATTTC（pcv2-F1）

SEQ NO：3 GACTCAGTAATTTATTTCATAT（pcv2-R1）

SEQ NO：4 CTACTCCTCCCGCCATACAA（pcv2-F）

SEQ NO：5 TACTCCTCAACTGCTGTCCC（pcv2-F）

测序结果见SEQ ID NO:1所示，从SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列与现有PCV2基因序列相比以现，该病毒基因组与所有现已报道的毒株基因组序列99%吻合，与最接近的基因组比对发生了至少9个碱基突变。9个碱基突变点位分别是08C>G，365T>C ， 465T>C，1132T>C，1192G>A，1457A>G，1547C>T，1588T>G，1720C>T

证明其为PCV2的一个新突变株，命名为GY-PCV2。

GY-PCV2株基因序列与经典株比对的突变位点

89A>T 110G>T 152G>T 155C>T 161C>A 167G>A 224T>C

254A>G 308C>G 317T>A 338T>C 365T>C 368A>G 381C>A

389A>G 551C>T 716G>C 725C>T 872C>T 1018T>G 1035T>A

1106G>T 1157C>T 1165T>C 1168A>C 1169G>A 1178C>T 1187A>C

1195C>T 1196C>T 1205A>G 1232G>A 1235A>T 1238A>G 1241G>A

1250T>G 1253G>A 1259A>G 1280T>C 1285G>T 1286G>T 1289T>G

1316T>G 1328T>G 1329T>A 1334A>T 1335T>G 1338A>G 1345G>T

1374G>C 1391A>G 1406G>C 1436T>C 1458A>G 1463T>C 1465T>C

1470A>C 1471T>G 1472T>G 1473T>G 1474T>G 1478G>T 1480T>A

1481C>G 1490C>T 1498C>G 1505G>A 1507C>T 1510G>T 1514A>G

1548C>T 1549C>T 1558A>T 1559G>C 1560C>G 1567C>T 1625A>G

1631G>A 1709T>C 1721C>T 1737G>T

（7）GY-PCV2突变株攻毒检测

选取6头体重约为20kg的杜长大仔猪，分为2组，攻毒组每注射5mlGY-PCv2病毒液，对照组每头注射5ml的生理盐水，在本所净化实验动物房分栏饲养观察2个月，实验结束后，所有参试猪均取腹股沟淋巴结，按照步骤（5）进行病毒分离培养，并分别将培养收获物送基因测序公司进行PCV2的全基因组测序

结果：观察28天后，攻毒组3头猪只相继出现典型的猪圆环病毒病症状，其腹股沟淋巴结分离培养物经PCV2测序，其全基因组序列与GY-PCV2完全吻合。而对照组3头猪只既无疫病症状，其培养物测序也未测出PCV2的存在。

具体结果见表1

（8）GY-PCV2突变株免疫荧光试验检测

将步骤（5）收获的GY-PCV2病毒液按照同步接种方法接种于PK-15细胞，铺板于96孔培养板中，未接种的PK-15细胞做对照，培养24小时后用D-氨基葡萄糖处理2小时，洗涤后用维持液培养72小时，固定细胞，用猪抗PCV2抗体做为一抗、羊抗猪荧光标记抗体作为二抗，进行免疫荧光试验

结果：接种GY-PCV2突变株的细胞孔呈强免疫荧光反应，具体结果见图3，而对照细胞无免疫荧光反应，说明GY-PCV2具有PCV2免疫源性。

（9）对已获得的病毒连续培养20代，收获第20代病毒液，送基因测序公司测定病毒的全基因组序列。测定结果与步骤（6）的全基因组序列100%吻合，说明该PCV2突变株有较强的遗传稳定性。

本发明将猪圆环病毒GY-PCV2株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201660。保藏日是2016年12月5日。

实施例3.产PCV2病毒的PK15细胞筛选与获得

（1）将从CCTCC购买的GDC061猪肾细胞系PK15至对数生长期；

（2）接种PCV2突变株至猪肾细胞系PK15，培养24小时后，弃去上清液，用3mmol的D-氨基葡萄糖PBS溶液处理细胞2小时，弃去D-氨基葡萄糖PBS溶液，用PBS洗涤细胞5次。换维持液培养染毒后的细胞72小时后，取上清，用PCV2特异性荧光定量PCR检测试剂盒测定其中PCV2，当测定CT值低于或等于阳性对照的CT值时，证明此时的PK-15细胞已经携带PCV2的PK-15混合细胞；

（3）用胰蛋白酶消化，加培养基中和，离心，用培养基调细胞密度在1-10个/ml的细胞悬液，将该细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔200ul细胞悬液，培养3日后，在显微镜下观察，留下只有单个细胞克隆生长的培养孔，继续培养；

（4）将培养基更换成维持液，以单个细胞克隆培养过程中是否出现“拉网式”病变作为病毒是否出现感染的选择指标进行目标克隆筛选。单个细胞克隆长满培养孔后，按照1：2比例传代细胞，新传代的细胞分别接种于2块不同的新培养板中，做好对应编号标记，当2块培养板中的细胞均已长满细胞孔，其中1块板的细胞继续传代，另1块板，将其细胞培养基更换成维持液，继续培养72小时后，观察细胞是否出现拉网式病变，将那些出现病变的细胞连同上清液冻融3次，反复吹吸均匀后取样，用病毒DNA提取专用试剂盒提取DNA，以PCV2荧光定量PCR检测试剂盒作PCV2的定量PCR检测，留下CT值最小的对应编号的细胞继续传代，直至选择到CT值最小而细胞又能稳定传代的细胞克隆，其中一株细胞株可稳定传代，且可大量产生PCV2病毒，此细胞株命名为GY-PCV2-PK15细胞株。本发明将GY-PCV2-PK15细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2016201。保藏日是2016年12月5日。

实施例4 GY-PCV2-PK15细胞生长与产毒性能测试：

（1）常规方法解冻GY-PCV2-PK15细胞，传代培养至所需数量，取其中部分细胞用于细胞生长曲线测试，部分细胞用于产毒性能测试。

（2）对照组细胞处理：常规方法解冻PK-15细胞，传代培养至所需数量，取其中部分细胞用于细胞生长曲线测试，部分细胞用于产毒性能测试。

细胞生长曲线测试：GY-PCV2-PK15和对照PK15细胞均按常规方法进行。

产毒能力测试：

GY-PCV2-PK15细胞组：随机抽取步骤（1）培养的GY-PCV2-PK15细胞3批次，取用维持液培养72小时的上清液进行病毒效价测定。

普通PK细胞D-氨基葡萄糖处理组：随机抽取步骤（2）培养的PK-15细胞3批次，常规方法接种病毒24小时后，用3mM的D-氨基葡萄糖PBS溶液处理细胞2小时，用PBS洗涤5次，维持液培养72小时，取上清液，进行病毒效价测定。

普通PK细胞无D-氨基葡萄糖处理组：随机抽取步骤（2）培养的PK-15细胞3批次，常规方法接种病毒24小时后，更换维持液培养72小时，取上清液，进行病毒效价测定。

产毒曲线测试：取步骤（1）培养的GY-PCV2-PK15细胞3瓶，将其培养基更换为维持培养基继续培养，分别在第12、24、36、48、60、72、84、96、108小时取200ul上清，提取病毒DNA，荧光定量PCR试剂盒测定个时间段病毒DNA的相对含量，并以取样时间为横坐标、定量PCR测得的CT值为纵坐标制作产毒曲线。

免疫荧光测试：以猪抗PCV2高免血清为一抗，以兔抗猪免疫球蛋白荧光标记抗体为为二抗，按常规方法对固定于96孔培养板中的GY-PCV2-PK15细胞进行免疫荧光测试

结果：

①GY-PCV2-PK15细胞拉网式病变显微照片见图1，正常生长的PK细胞显微照片见图2

②免疫荧光测定效果见图3

③GY-PCV2-PK15生长曲线见图4，

④三组细胞的产毒能力比较，见表2

⑤GY-PCV2-PK15细胞的产毒曲线见图5

实施例5：GY-PCV2-PK-15细胞批量培养PCV2的应用

（1）按常规方法分三批次解冻GY-PCV2-PK15细胞，传代培养至所需数量

（2）所有细胞最后一次传代后培养24小时，更换培养基为含2%血清的维持液，继续培养72小时

（3）显微镜下观察细胞，当发现细胞出现明显拉网式病变时，收集上清液，4000转/分离心5分钟，取上清液，此上清液即为GY-PCV2病毒液。

（4）测定病毒效价，作好记录，留存病毒液备用。

结果

三批次培养的病毒液，其病毒效价见表3

实施例6：GY-PCV2-PK15细胞培养PCV2制备疫苗的应用

（1）将实施例4中培养的PCV2病毒液，按照常规方法灭活并配制成三批次PCV2灭活疫苗。

（2）选取市售公认品质较好的某品牌PCV2灭活疫苗三个批次样作为对照疫苗。

（3）另以注射用水作为空白组

（4）上述实验组合对照组个批次疫苗分别免疫3头PCV2阴性猪，空白组也同步注射3头猪，共21头参试猪。

（5）免疫21天后，前腔静脉采血，分离血清，用市售PCV2抗体E-Lisa检测试剂盒测定各血清样品PCV2抗体效价

结果

各组免疫猪21天，血清抗体水平见表4

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉市工程科学技术研究院

武汉市工程科学技术研究院

武汉市工程科学技术研究院

<120> 新的猪圆环病毒及其共培养细胞株

<130> 新的猪圆环病毒及其共培养细胞株

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1767

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒PCV2

<400> 1

accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60

agaagaatgg aagaagcgga ccccaacccc ataaaaggtg ggtgttcact ctgaataatc 120

cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg atcttccaat atccctattt gattatttta 180

ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240

ttgtgaagaa gcagactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccacatcg 300

agaaagcgaa aggaacagat cagcagaata aagaatactg cagtaaagaa ggcaacttac 360

tgatcgagtg tggagctcct agatctcagg gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420

gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480

tcagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540

attggaagac taatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg 600

ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg 660

atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccctggg 720

atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agagactaaa ggtggaactg 780

tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840

cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tttatcggag gattacttcc ttggtatttt 900

ggaagaatgc tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960

catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020

ttttattatt cattaagggt taagtggggg gtctttaaga ttaaattctc tgaattgtac 1080

atacatggtt acacggatat tgtattcctg gtcgtatata ctgttttcga acgcagtgcc 1140

gaggcctacg tggtctacat ttccagcagt ttgtagtctc agccacagct gatttctttt 1200

gttgtttggt tggaagtaat caatagtgga atctaggaca ggtttggggg taaagtagcg 1260

ggagtggtag gagaagggct gggttatggt atggcgggag gagtagttta cataggggtc 1320

ataggtgagg gctgtggcct ttgttacaaa gttatcatct agaataacag cactggagcc 1380

cactcccctg tcaccctggg tgatcgggga gcagggccag aattcaacct taacctttct 1440

tattctgtag tattcagagg gcacagagcg ggggtttgag ccccctcctg ggggaagaaa 1500

gtcattaata ttgaatctca tcatgtccac cgcccaggag ggcgttttga ctgtggttcg 1560

cttgatagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg aagatgccat ttttccttct 1620

ccagcggtaa cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg cggcggagga tctggccaag 1680

atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctccg gtaacgcctt cttggatacg tcatatctga 1740

aaacgaaaga agtgcgctgt aagtatt 1767

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒PCV2

<400> 2

aggcctacgt ggtctacatt tc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒PCV2

<400> 3

gactcagtaa tttatttcat at 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒PCV2

<400> 4

ctactcctcc cgccatacaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒PCV2

<400> 5

tactcctcaa ctgctgtccc 20