一种圆环疫苗免疫效果评估方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及疫苗评估领域，特别是指一种圆环疫苗免疫效果评估方法。
【背景技术】
[0002]在疫苗评估领域，通常采用的是使用血清学检测方法评估猪群免疫后抗体水平，从而评估疫苗是否质量可靠、免疫方式是否确实有效、免疫程序是否合理等方法。该技术的具体步骤为:(I)采集母猪前腔颈静脉血3-5毫升。(2)放置4度冰箱过夜析出血清。(3)分离血清，使用血清学检测方法检测PCV2型抗体水平。其工作原理:一般采用猪圆环病毒2型0RF2基因的工程表达产物包被微孔板。在试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后，若样品中含有抗猪圆环病毒2型0RF2蛋白特异性抗体，则将与包被板上抗原结合。经洗涤除去未结合的抗体和其他成分，再加入酶标二抗，与包被板上抗原抗体复合物发生特异性结合。再经洗涤除去未结合的酶结合物，在孔中加TMB底物液，与酶反应形成蓝色产物，加入HF溶液终止反应后，用酶标仪630nm波长测定各反应孔中的OD值。
[0003]传统的方法直接采集母猪的前腔颈血作为样品，采用血清学检测技术检测得到结果是接种圆环疫苗的母猪免疫情况，圆环疫苗是否有效阻断母猪将圆环病毒传染给仔猪无法得知。而且血清学检测技术评价圆环疫苗的免疫效果，灵敏度相对较低，当前猪群处于亚健康状态时，免疫系统抑制现象严重，血清学检测技术不能全面直接反映疫苗是否有效阻断圆环病毒对母猪和仔猪的侵害，较片面、不能直接有效展现阻断效果。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提出一种圆环疫苗免疫效果评估方法，通过PCR技术检测脐带血样品中目标基因片段，能直接有效判断圆环疫苗是否有效阻断圆环病毒通过母猪传染给仔猪，更加准确地评估圆环疫苗的免疫效果，灵敏度高。
[0005]基于上述目的本发明提供的圆环疫苗免疫效果评估方法，选取圆环疫苗免疫后的母猪分娩的所有同窝仔猪的脐带血混合作为样品，利用PCR技术扩增样品中目标基因片段，采用琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。
[0006]具体包括以下步骤:
步骤一:采集经圆环疫苗免疫的同一头母猪分娩的所有同窝仔猪的脐带血，所述所有同窝仔猪的脐带血混合后作为样品，将所述样品密封保存。
[0007]步骤二:提取所述样品中的DNA。
[0008]步骤三:利用PCR技术扩增DNA中的0RF2基因片段。
[0009]步骤四:采用琼脂糖凝胶电泳检测是否存在扩增产物评价圆环疫苗的免疫效果。
[0010]较佳地，所述母猪在产前21~28天接种圆环疫苗。
[0011]可选地，所述步骤一中，每头仔猪采集3~5滴脐带血。
[0012]优选地，所述步骤一中，当仔猪非连续产出时，需要将已采集的仔猪的脐带血在-20~-30°C冰箱内保存。
[0013]所述步骤三中，PCR扩增引物为:
上游引物:CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT下游引物:CGC ACC TTC GGA TAT ACT GTC ；
所述步骤四的检测为检测是否出现493bp的条带。
[0014]所述步骤二提取样品中的DNA步骤包括:
①取样品900 μ L，向样品中加入300 μ L的消化液在45~50 °(:水浴消化3~4小时，接着加入等体积的酚仿混匀后在12000r/分钟条件下离心10~15分钟，取上清液，反复抽提3~4次。
[0015]②向上清液中加入体积为上清液2倍的无水乙醇，室温放置10~15分钟沉淀DNA，接着在12000 r/分钟条件下离心10~15分钟，沉淀用70 %乙醇清洗I次，继续在12000r/分钟条件下离心10~15分钟，沉淀自然干燥10~15分钟；提取的DNA采用20 μ L的缓冲液TE溶解备用。
其中，所述300 μ L的消化液由255 μ L TNE缓冲液、15 μ L 10 % SDS聚丙烯酰胺和30yL 2 mg/ mL蛋白酶K组成的混合溶液；所述酚仿为苯酚:氯仿:异戊醇按照质量比为25: 24: I混合的溶液。
[0016]所述步骤三中的PCR技术检测方法包括以下步骤:
Cl)按如下比例配制PCR反应体系:
PCR缓冲液:2.5 μ LdNTP:2 yL上游引物:1 yL下游引物:iyL样品 DNA: 4 μ LTaq 酉每:0.5 μ L
其中，样品DNA浓度为100-200ng/ μ L，上游引物及下游引物浓度为10~20umol/L ;所述上游引物为:CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT，所述下游引物为:CGC ACC TTC GGA TAT ACTGTC0
[0017](2) 95°C预变性5分钟进行30个PCR循环，循环完毕后72°C延伸10分钟，最后4°C保护。
[0018]所述PCR循环参数为:94°C变性I分钟，57 °C退火I分钟，72 °C延伸I分钟。
[0019]从上面所述可以看出，本发明提供的圆环疫苗免疫效果评估方法，具有以下积极有益效果:(I)脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，脐带是连接母体和胎儿的器官，正常的脐带血是不含病原体和抗体物质，通过选取脐带血作为样品研究圆环病毒的垂直传播来评价圆环疫苗的免疫效果更加直接有效。(2)当猪群处于亚健康状态时，免疫系统抑制现象严重，采用血清学检测技术不能直接有效评价免疫效果。本发明通过PCR技术检测脐带血中0RF2基因片段来评价圆环疫苗是否有效阻断圆环病毒通过母猪传染给仔猪，灵敏度更高。
【附图说明】
[0020]图1为本发明实施例圆环疫苗免疫效果评估方法流程图； 图2为本发明实施例A厂家DNA样品扩增产物琼脂糖电泳图；
图3为本发明实施例B厂家DNA样品扩增产物琼脂糖电泳图；
图4为本发明实施例C厂家DNA样品扩增产物琼脂糖电泳图。
【具体实施方式】
[0021]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
[0022]实施例1
选取A厂家十头母猪在产前21天接种圆环疫苗，并对母猪进行圆环疫苗免疫效果评价，参照图1所示，其为本发明实施例圆环疫苗免疫效果评估方法流程图，包括以下步骤:预处理步骤:取干净的青霉素瓶和瓶塞清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用。
[0023]步骤一，选取经圆环疫苗免疫的同一头母猪分娩的所有同窝仔猪的脐带血作为样品，将所述样品收集在同一个灭菌的青霉素瓶内并盖上瓶塞密封，共收集10组样品。用标签纸或者医用白胶带在青霉素瓶做标记，注明采集时间，母猪耳号，胎次信息。需要说明的时，当仔猪非连续产出时，需要将已采集的仔猪的脐带血在-20°C冰箱内保存，在该温度条件下能够维持病毒稳定存活，减少实验误差。
[0024]步骤二，提取样品中的DNA。
[0025]①取样品900 μ L，向样品中加入300 μ L的消化液在50 °(:水浴消化4小时，接着加入等体积的酚仿混匀后在12000r/分钟条件下离心15分钟，取上清液，反复抽提4次。
[0026]②向上清液中加入体积为上清液2倍的无水乙醇，室温放置15分钟沉淀DNA，接着在12 000 r/分钟条件下离心15分钟，沉淀用70 %乙醇清洗I次，继续在12000 r/分钟条件下离心15分钟，沉淀自然干燥15分钟。
[0027]其中，所述300 μ L的消化液由255 μ L TNE缓冲液、15 μ L 10 % SDS聚丙烯酰胺和30 μ L 2 mg/ mL蛋白酶K组成的混合溶液；所述酚仿为苯酚:氯仿:异戊醇按照质量比为25: 24: I混合的溶液。
[0028]步骤三，采用PCR技术检测DNA中的0RF2基因片段。
[0029](I)以步骤二提取的DNA为模板，采用20 μ L的缓冲液TE溶解DNA模板配制成浓度为200ng/ μ L的样品DNA，与浓度为20umol/L的PCR引物配成如下反应体系:
10XPCR 缓冲液:2.5yL dNTP:2 yL 上游引物:1 yL 下游引物:iyL 样品 DNA: 4 μ L Taq 酉每:0.5 μ L
其中，上游引物为:CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT，下游引物为:CGC ACC TTC GGA TATACT GTCo
[0030](2)按照上述体系混合之后，将PCR管放入PCR仪器进行扩增。PCR程序如下:
1.预变性95°C 5分钟 2.变性94°C I分钟
3.退火57 °C I分钟
4.延伸72 °C I分钟 2至4循环30次
5.延伸72°C 10分钟最后4°C保护
步骤四，琼脂糖电泳检测。取出PCR终产物10 μ L，0.8%琼脂糖电泳30分钟，在凝胶电泳成像仪下紫外观察。结果见图2所示，其中，泳道M为marker，泳道+为阳性对照，泳道-为阳性对照，泳道1-10为A厂家样品DNA，可见泳道3、6和7特异性扩增出493bp的条带，泳道1、2、4、5、8、9和10未有目标条带出现。
[0031]评价圆环疫苗的免疫效果。检测结果表明:A厂家选取的接种圆环疫苗的十头母猪中，有三头母猪呈现阳性，其余呈阴性。呈阳性的三头母猪接种的圆环疫苗没有阻断圆环病毒通过血胎屏障侵袭胎儿。A厂家给母猪接种的圆环疫苗不能有效的阻断圆环疫苗病毒的感染，部分母猪仍能通过脐带血传播进而影响胎儿。
[0032]实施例2
选取B厂家十头母猪在产前24天接种圆环疫苗，并对母猪进行圆环疫苗免疫效果评价，参照图1所示，其为本发明实施例圆环疫苗免疫效果评估方法流程图，包括以下步骤:预处理步骤:取干净的青霉素瓶和瓶塞清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用。
[0033]步骤一，选取经圆环疫苗免疫的同一头母猪分娩的所有同窝仔猪的脐带血作为样品，将所述样品收集在同一个灭菌的青霉素瓶内并盖上瓶塞密封，共收集10组样品。用标签纸或者医用白胶带在青霉素瓶做标记，注明采集时间，母猪耳号，胎次信息。需要说明的时，当仔猪非连续产出时，需要将已采集的仔猪的脐带血在-25°C冰箱内保存，在该温度条件下能够维持病毒稳定存活，减少实验误差。
[0034]步骤二，提取样品中的DNA。
[0035]①取样品900 μ L，向样品中加入300 μ L的消化液在45 °(:水浴消化3小时，接着加入等体积的酚仿混匀后在12000r/分钟条件下离心10分钟，取上清液，反复抽提3次。
[0036]②向上清液中加入体积为上清液2倍的无水乙醇，室温放置10分钟沉淀DNA，接着在12 000 r/分钟条件下离心10分钟，沉淀用70 %乙醇清洗I次，继续在12000 r/分钟条件下离心10分钟，沉淀自然干燥10分钟。<