专利名称：一种对猪体核酸疫苗具有免疫增强作用的CpG基序的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域或兽医生物制品领域，具体是一种对猪体 核酸疫苗具有免疫增强作用的CpG基序。
2背景技术：
近年来由于分子生物学的发展，使得疫苗学进入了一个崭新的分子免疫时 代，其标志是各种分子免疫增强剂的研究和应用。如何进一步提高传统疫苗的免 疫效果是今后努力的方向。高效免疫增强剂的应用，能全面提高机体的整体免疫 水平，增强抗病防御和免疫应答能力，提高疫苗保护率。其中，CpG基序(CpG寡聚 脱氧核苷酸)的研究是其中的焦点。CpG序列已被证实能作为疫苗的高效免疫增 强剂，使用得当能够大幅度提高疫苗的免疫保护率和机体的免疫水平。近来大量 免疫学研究证实含CpG序列的DNA分子具有以下免疫效果(l)诱导B细胞增 殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2)抗诱生的细胞凋亡；(3)诱导单核细胞 分泌IL-12及其他细胞因子；(4)活化自然杀伤(NK)细胞的裂解活性和干扰素 (IFN-Y)分泌。
使用CpG寡核苷酸作佐剂要面临的一个较复杂的问题就是对于不同的物种 其最佳的CpG序列不同，比如对鼠免疫刺激效果最好的序列是5' -GACGTT-3'
(Zina et al, 1998)，对人的刺激作用最强的是5， -GTCGTT-3，。目前开发 CpG佐剂要解决的问题是确定不同的DNA疫苗所需要的含CpG寡核苷酸的最合适 的剂量以及对不同物种具有特异性的寡核苷酸序列。
我国是世界养猪大国，2002年以来生猪饲养量在11亿头以上，在畜牧业生 产中占有较大的比重，同时养猪业也是我国部分省区的主要生产支柱和新的经 济增长点。但面对当前养猪业重大疫病发生和流行愈加复杂的形势——旧病未 除，新病又起，疫情不断，这就要求我们必须运用新的科学理论和生产技术来 发展猪用安全、高效疫苗预防和控制各种疫病的发生和流行，而免疫增强剂的 研制是疫苗研究的主要组成部分。
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发明内容
本发明提供一种对猪体核酸疫苗具有免疫增强作用的CpG基序，可使DNA疫苗产生更有效的免疫反应。
本发明的目的是通过以下方式实现的人工合成一种CpG基序，其引物序 列如下
7-A: CTCAT^ATCCTAT，TCCTAT^ATCCTAT靜TCCTAT，TCCTAT^ATGGGCC 7-B: CATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATGAGGGCC 注a、加黑部分需硫代修饰
CpG基序的免疫增强作用检验步骤如下
1 )选择15头健康猪(长白X大白二元杂交)，120日龄左右，体重90 —115kg，
经检疫，健康状况良好。
2)外周血淋巴细胞的分离培养
采集肝素抗凝血，用PBS(ra7.4)稀释液l: l稀释，小心叠加于2倍体积孵 育至室温的淋巴细胞分离液上，以1500rpm水平离心25min。将收集血浆层与淋 巴细胞分离液层之间的淋巴细胞层，放入含PBS(ra7. 4)洗涤液5ml的试管中， 充分混匀后，以1000rpm离心10min。弃上清液沉淀用5mlPBS(PH7. 4)洗涤液以 1000rpm离心10min洗两次，所得即是淋巴细胞。细胞沉淀用5ml含10%犊牛血 清的RPMI1640营养液悬浮。进行活力检测与计数。 3)脾脏免疫细胞的分离
取猪脾脏，剪碎，然后用研磨器匀浆。匀浆液经150目铜网过滤，滤液经 2000rpm离心10 min收集细胞泥。用2ml红细胞裂解液悬浮，室温处理5min， 然后用10ml GKN溶液中和混匀后2000rpm离心10min。将细胞沉淀用PBS离心 洗涤3-4次，至细胞沉淀纯白色。细胞沉淀用5ml含10%犊牛血清的RPMI1640 营养液悬浮，进行活力检测与计数。
4) 活力检测与计数
取10ul细胞悬液加90 1%的台盼蓝溶液，混匀，滴加到血球计数板上， 进行淋巴细胞活力检测及计数。用1(m犊牛血清的RPMI1640细胞营养液调整至 2Xl()7细胞/ml。
5) 外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞增殖试验(MTT法)
将96孔细胞培养板分成12组，每组三孔；将悬浮细胞的细胞培养液加入 细胞培养板(从第一组至阴性对照，每组三个重复，每孔150pL);空白对照孔 加入150^iL无细胞的细胞培养液(三个重复)；将CpG-0DN(100^ig/mL)样品分 别加入第1组至第9组(每组三个重复，每孔lOpL);阳性对照加入ConA(100iiig/mL)(三个重复，每孔lOpL);空白对照加入细胞培养液(三个重复，每孔10|lL); 将细胞培养板放入置37°C， C02培养箱中培养48h，每孔加入10ulMTT(5pg/|LiU ， 继续培养4h。然后每孔加入100^iL的DMS0，使紫黑色结晶完全溶解，测定0049。 的值。同时设不加细胞的营养液对照。以待测样品0D，减去培养液对照孔0D49。， 即为试验孔A值；以刺激指数(SI)作为判断淋巴细胞转化程度的参数。应用方 差分析进行差异显著性检验。 6)数据处理
以刺激指数(SI)作为判断淋巴细胞转化程度的参数。SI大于2具有刺激 效果。应用公式计算如下
SI二( ODs - ODb)/( ODn - ODb) ODs:样品(samole)孔OD值； ODb:空白(blank)孔OD值； ODn:阴性(negative)孔OD值。 实验数据采用SPSS软件对所测的SI值进行方差分析多重比较。 本发明CpG基序作为免疫增强剂的优越性对淋巴细胞增殖能力和对猪脾 脏免疫细胞的刺激作用较好，可以用作核酸疫苗的佐剂进一步提高核酸疫苗的 免疫效果；易规模化生产，成本低廉，易于保存和运输；安全性好。细胞因子 是机体内本身存在的免疫调节分子，对人体无毒副作用，同时也受机体免疫调 节网络的控制；易于构建和改造，利用分子生物学技术在基因水平可实现人们 所期望的免疫应答强度和类型。SEQUENCE LISTING
〈110>.山东省农业科学院畜牧兽医研究所
〈120〉 一种对猪体核酸疫苗具有免疫增强作用的CpG基序
〈160〉 2
〈210〉 1
〈211〉 59
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈222〉 (6， 15， 24， 33， 42， 51) 〈223> s2c
<400> 1
ctcatcgatc ctatcgatcc tatcgatcct atcgatccta tcgatcctat cgatgggcc 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA <213>人工序列
<220>
〈222〉 (4， 13， 22， 31, 40， 49) 〈223〉 s2c
〈400〉 2
catcgatagg atcgatagga tcgataggat cgataggatc gataggatcg atgagggcc 59
权利要求
1、一种对猪体核酸疫苗具有免疫增强作用的CpG基序，用于其合成的引物序列为7-ACTCAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATGGGCC7-BCATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATGAGGGCC。
2、 一种对猪体核酸疫苗具有免疫增强作用的CpG基序，其免疫增强作用的检测步骤如下1) 选择120日龄健康猪15头为原料备用；2) 外周血淋巴细胞的分离培养；3) 脾脏免疫细胞的分离；4) 活力检测与计数；5) 外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞增殖试验，即MTT法；步骤如下a将96孔细胞培养板分成12组，每组三孔；将悬浮细胞的细胞培养液加入 细胞培养板，从第一组至阴性对照，每组三个重复，每孔150(aL; b空白对照孔加入150pL无细胞的细胞培养液，三个重复； c将CpG基序调整为100pg/mL，样品分别加入第1组至第9组，每组三个 重复，每孔10iiL;d阳性对照加入ConA 100pg/ mL，三个重复，每孔lOpL;空白对照加入细 胞培养液，三个重复，每孔10iiiL;e将细胞培养板放入置37°C， C02培养箱中培养48h，每孔加入10ulMTT， 5pgAiL，继续培养4h，然后每孔加入100)LiL的DMS0，使紫黑色结晶完全溶解， 测定OD，的值，同时设不加细胞的营养液对照，以待测样品0D49。减去培养液对 照孔0D49。，即为试验孔A值；以刺激指数"SI"作为判断淋巴细胞转化程度的 参数，应用方差分析进行差异显著性检验；6) 数据处理以刺激指数(SI)作为判断淋巴细胞转化程度的参数，SI大于2具有刺激 效果，应用公式计算如下SI=( ODs - 0Db)/( ODn - ODb) ODs:样品(samole)孔OD值； ODb:空白(blank)孔OD值； ODn:阴性(negative)孔0D值。
全文摘要
本发明提供一种对猪体核酸疫苗具有免疫增强作用的CpG基序。人工合成系列CpG基序免疫猪体，通过测定其细胞免疫水平和体液免疫水平确定了一种对猪最适的CpG基序，该CpG基序可以用作核酸疫苗的佐剂进一步提高核酸疫苗的免疫效果。本发明CpG基序作为免疫增强剂的优越性制备方法简单，易于保存和运输；质量易于控制，易规模化生产，成本低廉，易于保存和运输；安全性好。细胞因子是机体内本身存在的免疫调节分子，对人体无毒副作用，同时也受机体免疫调节网络的控制；易于构建和改造，利用分子生物学技术在基因水平可实现人们所期望的免疫应答强度和类型。
文档编号A61K39/39GK101423832SQ200810014059
公开日2009年5月6日 申请日期2008年1月23日 优先权日2008年1月23日
发明者任慧英, 吴家强, 顺 周, 张秀美, 朱新产, 俊 李, 温建新, 王金宝 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所