抗动脉粥样硬化核酸疫苗及制备方法

专利名称：抗动脉粥样硬化核酸疫苗及制备方法
技术领域：
在医学领域中，本发明提供的抗动脉粥样硬化核酸疫苗能用于预防和治疗动脉粥样硬化。
背景技术：
动脉粥样硬化(Atherosclersis，AS)是一种由于动脉发生退行性、增生性病变，导致管壁增厚，失去弹性和管腔缩小的常见血管病，其特点是受累的动脉内膜局部有脂质和复合糖类沉着，并伴有平滑肌细胞、纤维组织增生，其后内膜和中膜逐渐退变和钙化。本病主要累及大型肌弹力型动脉(如主动脉)和中型肌弹力动脉(以冠状动脉以及脑动脉罹患最多)，病变分布多为数个组织器官动脉同时受累，可引起整个循环系统或个别器官的功能紊乱，其中冠状动脉粥化硬化所导致的冠状动脉性心脏病即冠心病是该病导致器官病变中最常见类型。该病在欧美等发达国家发病率极高，其中冠心病已列人群死亡原因的首位。在我国该病发病率也呈上升趋势，现已跃居导致人口死亡的主要原因之列，且有年轻化的倾向。
动脉粥样硬化的发生是多因素作用的结果，其病因尚未完全阐明，目前普遍认为胆固醇及与其代谢密切相关的胆固醇酯转移蛋白和热休克蛋白引起的自免疫在该病的形成中占主导地位。其中大量数据显示血浆胆固醇水平与动脉粥样硬化的形成密切相关。血液中低密度脂蛋白(LDL)是将胆固醇运输到全身器官的主要载体，高浓度的LDL及LDL胆固醇将导致动脉内膜上粥样斑块形成，造成管腔狭窄或阻塞。相反，高浓度的高密度脂蛋白(HDL)胆固醇能降低冠状动脉粥样硬化发病的危险。研究证明，HDL胆固醇每降低1％，冠心病发病的危险就升高2％-3％。在目前使用的降胆固醇的方法中，限制饮食最为常见，但由于部分患者缺乏长期顺应性或是遗传上具有高LDL水平的倾向，节食与运动并不总是有效。现已上市的调节血脂类药物以化学药物为主，这些药物都存在一定的毒副作用，且多需长期服用，使用不便。疫苗作为生物制品，具有完全不同于现有化学药物的本质和作用机制，其通过激活人自身的免疫系统，产生具有保护效力并可在体内维持相当长时间的抗体，或通过其他免疫机制治疗及预防疾病。故抗动脉粥样硬化疫苗的开发为安全有效地防治动脉粥样硬化提供了一个新思路和新方法。
胆固醇酯转移蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)是一个由476个氨基酸组成的糖蛋白，它介导血浆脂蛋白间的脂类交换。通过体外分析证实CETP承担了人体血浆中胆固醇酯(CE)与三磷酸甘油酯(TG)转移的全部活性。CETP能促进中性脂在富含CE的脂蛋白(如HDL)与富含TG的脂蛋白(如LDL)间交换，从而导致HDL上CE的不断消耗与TG的逐渐富集。动物模型研究表明抑制过高的CETP的活性能极大地改变胆固醇在HDL与LDL之间的交换，从而起到抗动脉粥样硬化的作用。研究显示，CETP的C-末端60％形成紧凑结构，该部位可能存在CETP与脂质及脂蛋白结合位点，是其参与中性脂转移所必需的。CETP羧基端26个氨基酸中有16个氨基酸(461-476)是其最主要的B细胞表位，可诱导机体产生抗CETP的抗体，该抗体与内源CETP结合后抑制其活性，从而提高HDL胆固醇/LDL胆固醇比例，减少粥样斑块的形成，起到抗动脉粥样硬化的作用。
另有越来越多的研究表明，异常的免疫反应在动脉粥样硬化的发病过程中起一定作用，特别是热休克蛋白(Heat shock protein，Hsp)引起的自免疫在早期硬化的形成中起着促进作用，因此如能抑制免疫损害则可阻止疾病的进一步发展。动脉粥样硬化斑中含有大量巨噬细胞，其进一步摄取胆固醇酯后形成泡沫样细胞，从而形成脂纹。Hsp是在生物体中普遍表达且有较高同源性的一类蛋白，又称为分子伴侣，其主要功能为帮助新生肽的正确折叠，防止逆境下蛋白的损伤，抵挡其他胁迫导致的细胞损伤和凋亡。由于各种生物体的Hsp同源性很高，机体免疫系统对人自身的Hsp产生交叉免疫反应，从而激活补体系统或依赖于抗体的细胞毒作用，造成对自身组织的免疫损伤，诱发动脉粥样硬化等自身免疫性疾病。在和Hsp相关的硬化斑中存在有巨噬细胞、Th1细胞以及IFN-γ、TNF-α和MCP-1等细胞因子，这些都可加速硬化斑的形成和发展。若通过免疫反应诱导机体产生IL-4、IL-10和TGF-β等细胞因子，就可诱使Th1细胞向Th2细胞转变，从而抑制病斑产生部位的Th1型细胞免疫反应，减轻免疫损伤。
核酸疫苗是指将含有编码抗原蛋白目的基因的质粒载体直接注入体内，通过宿主细胞的转译系统表达目的抗原，并诱导机体产生免疫应答的一项新型疫苗。由于其在体内选择性表达目的产物，并将其以自然加工形式递呈给免疫识别系统，故兼具重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的双重性，与传统的疫苗相比具有免疫原性好，效果持久等特点。另外核酸疫苗可在工程菌中快速复制，制备提纯方法简便，大大降低了成本，已显示出巨大开发潜力和应用前景。
核酸疫苗DNA骨架中除包含有编码抗原基因的区域，在其质粒载体非编码区还含有由未甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)基元组成的免疫刺激序列(immunostimulatorysequences，ISS)。该ISS序列可作用于多种免疫活性细胞，增强非特异性免疫反应，激发淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞扩增、成熟和分泌多种细胞因子、趋化因子以及免疫球蛋白。由于具有免疫刺激作用，ISS序列作为在位疫苗佐剂可极大增强核酸疫苗被细胞摄取后针对目的抗原产生的体液免疫和细胞免疫，在核酸疫苗的开发中具有极大的应用前景。另据最新研究表明，ISS序列在自身免疫性疾病中可直接发挥免疫调节作用，调节发病部位局部的细胞因子水平，促进Th细胞亚型间的相互转换。由于Th1细胞参与许多器官特异性自身免疫疾病，而Th2细胞则起抑制作用，ISS序列通过调节两者之间的平衡可以抑制免疫损伤的发生。另外，ISS序列的免疫刺激作用与其插入位置无关，只要位于质粒载体非编码区而不破坏其编码区的DNA序列，均可以表现出其生物活性。总之，核酸疫苗除可用于预防和治疗传染性疾病，也为治疗自身免疫性疾病及肿瘤提供了新思路，并可在心血管疾病防治领域发挥独特作用。

发明内容
本发明的目的是提供一种抗动脉粥样硬化核酸疫苗。
本发明的另一目的是提供生产该抗动脉粥样硬化核酸疫苗的方法。
本发明的还有一个目的是该抗动脉粥样硬化核酸疫苗的用途。
在本发明的第一个方面，提供了一种抗动脉粥样硬化核酸疫苗。该质粒载体结构框架图如图1所示，除具有真核表达载体基本元件外，还包含有编码乙肝核心蛋白(HBc)的核苷酸序列，该HBc序列中已引入一个限制性内切酶的识别位点，并插入了编码人源胆固醇酯转移蛋白C端多肽(以下简称CETPC)的DNA序列。另外，该质粒骨架中插入免疫刺激序列(以下简称ISS)。由于ISS作用与其插入位置无关，故ISS可插入质粒载体骨架中非编码区的任何位置。
由于人源CETP是人体内固有蛋白，被自身免疫系统所耐受，若采用CETPC直接作为免疫原则无法产生理想的免疫效果。为增强CETPC的免疫原性，打破免疫耐受，我们采用乙肝核心蛋白(HBc)颗粒作为免疫载体。HBc具有在真核细胞大量表达，并自身装配成不具传染性的病毒样颗粒的独特性质。该颗粒由240个HBc单体组成，表面呈现有120个刺突，HBc的主要免疫区(MIR)即位于刺突的尖端。HBc病毒样颗粒易于被专职抗原递呈细胞摄取，有显著刺激B细胞、T辅助细胞及细胞毒T细胞产生免疫反应的能力，无需佐剂便能激发机体产生强烈的免疫应答。而且该颗粒有很强的适应性，对外源表位的插入不十分敏感，外源表位从刺突插入后的重组体仍能装配成纳米级颗粒，并将外源表位高密度地定位与展示于颗粒表面，使得目的表位易于被机体的B细胞表面的受体识别。重组颗粒还能凭借HBc强T辅助表位，诱导T辅助细胞的应答，激发机体产生针对抗原多肽的特异性抗体，极大增强该抗原表位的免疫原性，因此HBc颗粒可作为理想的免疫载体应用于核酸疫苗的研制中。由于HBc的第80-81位氨基酸即位于刺突的尖端，故在本质粒载体中将一限制性内切酶(AgeI)的识别位点引入HBc的第80-81位氨基酸所对应的核苷酸序列中，便可将目的表位(CETPC)方便地插入到该载体中，使得转染后表达的目的多肽理想地呈现于HBc颗粒表面。本核酸疫苗采用的抗原表位CETPC(RDGFLLLQMDFGFPEHLLVDFLQSLS)是人源CETP第451-476位氨基酸，其中包含有CETP的主要B细胞表位。同时在CETPC的N端引入两个柔性氨基酸IT，C端引入三个柔性氨基酸GAT，用以避免CETPC在HBc颗粒上呈现时可能存在的空间位阻。
正如背景技术中所述，ISS序列具有免疫刺激作用，可作为在位佐剂增强核酸疫苗的免疫效果，而且其本身在治疗自身免疫性疾病方面也发挥独特作用，抑制疾病的发生。ISS序列中的CpG基序为包含有未甲基化CpG的六聚物YpA/TpCpGpT/ApT，Y表示G、T、A、C中任意一个。虽然单个的CpG基序就足以表现出活性，但多个CpG基序的组合(特别是这些CpG基序处于轻微不同的框架中)将使得其生物学活性极大增高。本发明中，术语“X”指CpG基序，“Xn”指CpG基序的排列，其中每个基序间可直接相联，也可间隔有若干脱氧核苷酸。n指ISS序列中包含CpG基序的个数，n≥1。由于ISS序列没有位置限制性，故可以插入质粒骨架非编码区的任意位置。
在本发明的第二方面，提供生产抗动脉粥样硬化核酸疫苗的方法，其技术路线详述如下1.真核表达载体pCR3.1-Xn-HBc的构建从乙型肝炎病人血样中通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得编码HBc全基因183个氨基酸的DNA片段，插入市售的真核表达载体pCR3.1 uni(Invitrogen，USA)的多克隆位点中，并在HBc序列中引入限制性内切酶AgeI的识别位点。通过重组PCR扩增获得Xn序列，并将Xn序列插入pCR3.1 uni的骨架的非编码区中，n段CpG序列之间可直接相联，也可以间隔有若干个脱氧核苷酸，且由于ISS序列没有位置限制性，故可以插入质粒骨架非编码区的任意位置，由此构建成目的质粒载体pCR3.1-Xn-HBc。
2.抗动脉粥样硬化核酸疫苗质粒pCR3.1-Xn-HBc-CETPC及相应基因工程菌的构建根据胆固醇酯转移蛋白C端肽段的氨基酸序列设计3条引物，用add-PCR方法扩增得到编码CETPC的DNA片段，插入第一步所构建的质粒载体中的AgeI的酶切位点中，组成融合表达的重组质粒pCR3.1-Xn-HBc-CETPC，重组质粒转化大肠杆菌DH-5α，获得重组基因工程菌。
3.工程菌发酵及抗动脉粥样硬化核酸疫苗重组质粒的获得以LB培养基为基础和发酵培养基，发酵参数如下温度36-38℃，Ph6.8-7.2。发酵后离心收集工程菌。用碱裂解法对工程菌中的质粒DNA进行粗提，粗提液经阴离子交换树脂DEAE纤维素纯化，在TE(pH8.0)中以NaCl进行梯度洗脱，先用0.3mol/L NaCl将杂质(如蛋白质、低分子量RNA)洗脱除去，然后用0.6mol/L NaCl将质粒DNA洗脱收集，并将收集液用两倍乙醇沉淀，离心所得沉淀即为纯化质粒DNA。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯化的重组质粒纯度。
在本文的第三方面是抗动脉粥样硬化核酸疫苗的用途。将抗动脉粥样硬化核酸疫苗重组质粒直接免疫动物，通过宿主细胞的转译系统在机体内表达出表面呈现有CETPC表位的重组HBc病毒样颗粒，激发机体产生针对CETPC的特异性抗体。抗CETPC抗体能与体内内源CETP结合，通过抑制CETP的活性阻断胆固醇从HDL向LDL的转移，使血浆高密度脂蛋白胆固醇酯增加，而低密度脂蛋白胆固醇酯减少，减少粥样斑块的形成，从而起到抗动脉粥样硬化的作用。另外该核酸疫苗DNA骨架上ISS序列一方面作为疫苗佐剂增强由CETPC引发的体液免疫，提高抗CETPC抗体的滴度，另一方面直接作用于动脉粥样硬化斑的形成部位，通过改变局部的细胞因子水平，抑制病斑产生部位的Th1型细胞免疫反应，减轻动脉粥样硬化斑形成过程中的免疫损伤。本核酸疫苗两个方面发挥作用，共同起到抗动脉粥样硬化的作用。


图1.真核表达载体质粒pCR3.1-Xn-HBc(图A)和抗动脉粥样硬化核酸疫苗重组质粒pCR3.1-Xn-HBc-CETPC(图B)图2.核酸疫苗pCR3.1-Xn-HBc-CETPC中的编码区HBc-CETPC的DNA序列(651bp)。
图3.pCR3.1-X8-HBc-CETPC质粒中部分ISS序列测序结果。
图4.pCR3.1-X8-HBc-CETPC质粒中HBc-CETPC基因序列测序结果。
图5.Western blot检测核酸疫苗pCR3.1-X8-HBc-CETPC转染细胞COS-7后特异性表达出HBc-CETPC融合蛋白。1.标准分子量蛋白；2.COS-7细胞裂解物2.转染pCR3.1-X8-HBc质粒后COS-7细胞的细胞裂解物；3.转染pCR3.1-X8-HBc-CETPC质粒后的COS-7细胞的细胞裂解物。箭头显示HBc-CETPC位置。
图6.ELISA测定结果显示只有核酸疫苗pCR3.1-X8-HBc-CETPC能诱发小鼠产生抗CETPC抗体。图例□生理盐水 pCR3.1-X8-HBc ■pCR3.1-X8-HBc-CETPC图7.Western blot检测结果显示核酸疫苗pCR3.1-X8-HBc-CETPC诱发兔产生抗CETPC抗体。1.标准分子量蛋白；2.氧化态rhVEGF-CETPC；3.还原态rhVEGF-CETPC；4.rhVEGF。箭头A显示rhVEGF-CETPC二聚体，箭头B显示rhVEGF-CETPC单体。
图8.兔血清中高密度酯蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度酯蛋白胆固醇(LDL-C)与总胆固醇(TOTAL-C)比率。结果显示核酸疫苗pCR3.1-X8-HBc-CETPC明显升高兔血清中HDL-C/TOTAL-C比率，明显降低LDL-C/TOTAL-C比率。图例□生理盐水 pCR3.1-X8-HBc■pCR3.1-X8-HBc-CETPC图9.兔动脉粥样硬化实验组织病理学检查照片。(1)主动脉切片染色结果。(2)冠状动脉及小动脉切片染色结果。A.pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组；B.pCR3.1-X8-HBc载体对照组；C.生理盐水阴性对照组。结果表明pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组的主动脉、冠状动脉及小动脉均未发生明显病变，而生理盐水阴性对照组的主动脉、冠状动脉及小动脉均发生明显病变。pCR3.1-X8-HBc载体对照组的主动脉病变比pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组明显严重，但好于生理盐水阴性对照组，而pCR3.1-X8-HBc载体对照组的冠状动脉及小动脉也未发生明显病变。
图10.兔主动脉粥样硬化病斑面积与血管内皮总面积比率。结果显示pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组所产生的病斑面积占血管内皮总面积比率明显小于两组对照组，仅为生理盐水阴性对照组的19.87％，而pCR3.1-X8-HBc载体对照组略小于生理盐水阴性对照组，为生理盐水阴性对照组的83.47％。
具体实施例方式
材料(1)菌株，细胞系和质粒宿主菌Escherichia coli DH-5α是基因工程常用工具菌种，与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。
猴肾细胞系COS-7构自中国科学院细胞研究所细胞保藏中心。
质粒pCR3.1 uni购自Invitrogen公司。
(2)乙肝病毒提取自南京市第二医院HBcAg阳性病人血清(3)酶和试剂分子克隆工具酶购自MBI公司试剂PCR纯化试剂盒、胶回收试剂盒为Promega公司产品乙肝病毒基因组提取试剂盒为Qiagen公司产品其它试剂为上海生工生物工程有限公司订购(4)培养基LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular CloningALaboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。该书是基因工程技术的经典著作，在许多高校图书馆都有收藏。
(5)Cellouse-DEAE52为Whatman公司产品。
(6)辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠和羊抗兔Ig二抗为武汉博士德公司产品。
(7)3、3`、5、5`-四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)、过氧化氢尿素和牛血清白蛋白(BSA)为美国西格马(Sigma)公司产品。
(8)96孔酶标板为美国康宁(Corning)公司产品。
(9)硝酸纤维素膜为美国Millipore公司产品。
(10)测定血清中总胆固醇和高密度酯蛋白中胆固醇含量的试剂盒为日本和光(Wako)公司产品。
方法质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
核酸的定量测定参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A LaboratoryManual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法进行。
实施例1真核表达载体pCR3.1-X8-HBc的构建用QIAamp DNA Blood Mini Kit从南京市第二医院HBcAg阳性病人血清中提取乙肝病毒基因组RNA。并用市场销售的随机引物将RNA反转录为DNA，根据乙肝核心抗原基因序列分别合成两对能与该基因互补的引物P1-P4。引物P1、P3和P4的5’端分别含有HindIII、AgeI和XbaI酶切位点，而引物P2的5’端依次含有PstI和AgeI两个酶切位点。第一步以P1和P2为引物，以反转录获得的乙肝病毒DNA为模板进行PCR，94℃，5min；94℃，1min，58℃，1min，72℃，1min，共30轮；72℃，10min。扩增得到的PCR产物即HBc的N端用限制性内切酶HindIII和PstI消化，与用相同限制性内切酶消化的pCR3.1uni质粒连接。再以P3和P4为引物，以反转录获得的乙肝病毒DNA为模板进行PCR，94℃，5min；94℃，1min，58℃，1min，72℃，1min，共30轮；72℃，10min。扩增得到的PCR产物即HBc的C端用限制性内切酶AgeI和XbaI消化，与用相同限制性内切酶消化的第一步构建的质粒连接。这样就在HBcAg序列中的第80、81位氨基酸所对应的核苷酸处引入了AgeI位点。
设计ISS序列，本实施例中选取GACGTT为CpG基序，设计含8段CpG基序的X8序列，每段CpG基序间随机插入1-5个寡核苷酸作为间隔。根据X8序列设计合成两条能互相互补的引物P5、P6。P5和P6按一定比例混合，二者互为引物和模板，94℃，5min；94℃，40s，58℃，40s，72℃，50s，共30轮；72℃，10min。将扩增获得的PCR产物用限制性内切酶DraIII消化，与用相同限制性内切酶消化的第二步构建的质粒连接，即构建组成质粒载体pCR3.1-X8-HBc，转化大肠杆菌Escherichia coli DH-5α后经PCR筛选，得到重组工程菌DH-5α/pCR3.1-X8-HBc，其结构框架图见图1。从该工程菌中抽提的质粒由上海生工公司核苷酸自动测序仪进行测定，进一步验证HBc基因序列和CpG序列的正确性，X8序列测定结果见图3。
6条引物核苷酸序列如下P15’AAAAAGCTTATGGACATTGACACGTATAAAGAA 3’P25’TTTTTCTGCAGACCGGTTGGGTCTTCCAATTACTTCC 3’P35’ATCACCGGTCGGGAATTAGTAGTCGGTTATGTCAATG 3’
P45’TTGTCTAGACTAACATTGAGATTCCCGAGATTG 3’P55’GGTCACGTAGTGACGTTCCTGACGTTTCCAGTGACGTTCCTGACGTTTAGACGTTCTCTG 3’P65’TTTCACTACGTGGATCCAACGTCGAACGTCAAACGTCAGAGAACGTCTAAACGTCAGGA 3’实施例2抗动脉粥样硬化核酸疫苗重组质粒pCR3.1-X8-HBc-CETPC的构建根据胆固醇酯转移蛋白C端肽段的氨基酸序列，在计算机的辅助下设计出胆固醇酯转移蛋白C端多肽基因的全序列。依据该序列设计出3条引物，进行化学合成。首先通过PCR法合成胆固醇酯转移蛋基因的部分序列，再通过第二次PCR扩增获得胆固醇酯转移蛋白C端肽段基因的全序列。具体而言，第一步引物C1和C2按一定比例混合，二者互为引物和模板，95℃，1min，55℃，1.5min，72℃，2min，共10轮；72℃，10min。再以该PCR产物为模板，用C1和C3引物进行PCR扩增，将扩增获得的PCR产物用限制性内切酶AgeI消化，与用相同限制性内切酶消化的pCR3.1-X8-HBc质粒连接，即构建组成质粒载体pCR3.1-X8-HBc-CETPC，转化大肠杆菌Escherichia coli DH-5α后经PCR筛选，得到重组工程菌DH-5α/pCR3.1-X8-HBc-CETPC，其结构框架图见图1，编码区HBc-CETPC的DNA序列见图2。从该工程菌中抽提的质粒由上海生工公司用核苷酸自动测序仪进行测定，进一步验证HBc-CETPC基因序列及其阅读框的正确性，其序列测定结果见图4。
3条引物核苷酸序列如下C15’TCCACCGGTATCACTCGTGACGGTTTCCTGCTGCTG 3’C25’CAGCAGGTGTTCCGGGAAACCGAAGTCCATCTGCAGCAGCAGGAAACCGTCACGGCT 3’C35’CGCACCGGTAGTAGCACCAGACAGAGACTGAAGGAAGT 3’实施例3工程菌发酵及抗动脉粥样硬化核酸疫苗重组质粒的大规模制备含pCR3.1-X8-HBc-CETPC质粒的工程菌培养在1000ml摇瓶中进行。从新鲜转接的平皿中挑取单菌落接入LB液体培养基中，37℃培养8小时至对数期作为一级种子，以1/250接种量接入到含250mlLB液体培养基的1000ml摇瓶中，37℃剧烈振摇继续培养12小时。以5000rpm离心15min收集菌体，将细菌沉淀物充分重悬于9ml溶液I[50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]中，再加入100μlRNase溶液[10mg/ml RNase，10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，15mmol/L NaCl]，混匀后冰浴10min。缓慢加入20ml新配制的溶液II
，轻轻混匀后于室温放置5min。加入10ml用冰预冷的溶液III[5mol/L KAc60ml，HAc 11.5ml，H2O 28.5ml]，充分混匀内容物后冰浴10min。4℃以12000rpm离心30min，取上清，加入0.6体积的异丙醇，室温放置10min。室温以12000rpm离心30min，用70％乙醇洗涤沉淀，用2ml TE(pH8.0)溶解沉淀，即得质粒DNA粗品。将质粒DNA粗品上DEAE纤维素DE52柱(1.6cm×30cm)，在TE(pH8.0)中以NaCl进行梯度洗脱，先用0.3mol/LNaCl将杂质(如蛋白质、低分子量RNA)洗脱除去，然后用0.6mol/L NaCl将质粒DNA洗脱收集，并将收集液用两倍体积的乙醇沉淀，离心所得沉淀即为纯化质粒DNA。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯化的重组质粒纯度并进行定量。
实施例4重组质粒的体外细胞表达以脂质体DOTAP Liposomal Transfection Reagent(Roche，Germany)介导基因转移，按照说明书所示方法，将pCR3.1-X8-HBc-CETPC质粒和pCR3.1-X8-HBc质粒分别转染细胞系COS-7进行瞬间表达。转染48小时后收集细胞，用Western blot法检测被转染细胞裂解物中的特异性表达产物。将转染前COS-7细胞裂解物、pCR3.1-X8-HBc质粒和pCR3.1-X8-HBc-CETPC质粒转染后的COS-7细胞裂解物用15％SDS-PAGE电泳后，于30V电压电泳过夜转移到硝酸纤维素膜上，然后以5％BSA溶液室温封闭2小时。将含抗CETPC抗体的小鼠血清稀释20倍后，与硝酸纤维素膜上的抗原于37℃作用1小时后，以pH7.5 TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；加入稀释400倍的羊抗小鼠IgG(辣根过氧化物酶标记)二抗，于37℃作用1小时，再以以pH7.5 TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；最后，加入二氨基联苯胺(DAB)溶液显色。具体操作方法参考Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A LaboratoryManual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.888-898。Western blot法检测结果见图5。结果表明只有pCR3.1-X8-HBc-CETPC质粒转染的后COS-7细胞裂解物含一约24kd的特异性蛋白，与HBc-CETPC的分子量相符。
实施例5抗动脉粥样硬化核酸疫苗的免疫原性研究选用3-4周龄C57BL/6J小鼠，pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组、pCR3.1-X8-HBc载体对照组和生理盐水阴性对照组各8只。用无菌生理盐水将核酸疫苗或载体质粒稀释成0.5μg/μL，在每只小鼠两后肢四头肌处各分别注射100μL核酸疫苗、载体质粒或生理盐水，即核酸疫苗实验组和载体组接种量均为100μg DNA/只。以后每隔2周加强免疫一次，共进行3次免疫。初次免疫后每隔2周眼眶内眦取血一次，血量为0.5-0.8ml，离心，取血清冷冻保存；末次免疫完16周后处死小鼠，眼球取血，离心取血清冷冻保存。用ELISA检测血清中抗CETPC抗体，ELISA结果见图6，发现pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组能诱发特异的抗CETPC的抗体。
实施例6抗动脉粥样硬化核酸疫苗的药效学研究选用体重平均为3.0g的新西兰大白兔，pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组、pCR3.1-X8-HBc载体对照组和生理盐水阴性对照组各5只。用无菌生理盐水将核酸疫苗或载体质粒稀释成0.5μg/μL。以200μL 0.25％盐酸布比卡因(无菌生理盐水为溶剂)处理兔后肢双侧股四头肌。24h后，在每只兔的处理肌肉处两侧各多点注射500μL核酸疫苗、载体质粒或生理盐水，即核酸疫苗实验组和载体组接种量均为500μgDNA/只。以后每隔4周以相同方法加强免疫一次，共进行6次免疫。每次免疫后2周行活体心脏穿刺取血，离心取血清冷冻保存。用ELISA和Western blot法检测血清中抗CETPC抗体，发现pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组能诱发特异的抗CETPC的抗体。Western blot法检测结果见图7。第三次免疫2周后开始给兔子喂以高胆固醇饲料，其胆固醇摄入量为0.5g/只/天，共饲喂14周，直到兔主动脉中有明显的粥样硬化斑块生成。
实施例7抗人胆固醇酯转移蛋白特异抗体的ELISA检测用纯化的重组人血管内皮生长因子121和CETPC的融合蛋白(rhVEGF-CETPC))4℃过夜包被96孔ELISA酶标板，每孔100μg融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃满孔封闭一小时。实施例6中所得抗血清，用pH7.5的PBS(含5％BSA和0.1％Tween-20)稀释100倍，然后每孔加入100μl稀释后的抗血清于37℃作用1小时。用PBST(含0.1％Tween-20)洗涤6次后加入100μl以1∶20000稀释的羊抗小鼠或羊抗兔IgG二抗(辣根过氧化物酶标记)，每孔100μl，37℃作用1小时。PBST洗涤6次，每孔加入100μl过氧化氢尿素和3、3`、5、5`-四甲基联苯胺(TMB)溶液于37℃显色10分钟后，加入50μl 2MH2SO4终止反应，并于450nm波长下，测定各孔吸光度值。小鼠血清ELISA检测结果见图6，表明pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组能诱发小鼠产生特异的抗CETPC的抗体。
实施例8抗人胆固醇酯转移蛋白特异抗体的Western检测将纯化后的rhVEGF、还原态rhVEGF-CETPC和氧化态rhVEGF-CETPC用15％SDS-PAGE电泳后，于30V电压电泳过夜转移到硝酸纤维素膜上，然后以5％BSA溶液室温封闭2小时。实施例5和例6中所得抗血清稀释20倍后，与硝酸纤维素膜上的抗原于37℃作用1小时后，以pH7.5 TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；加入稀释400倍的羊抗小鼠或兔IgG(辣根过氧化物酶标记)二抗，于37℃作用1小时，再以以pH7.5 TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；最后，加入二氨基联苯胺(DAB)溶液显色。具体操作方法参考Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYColdSpring Harbor Laboratory Press，1989，pp.888-898。兔血清Western blot法检测结果见图7。氧化态rhVEGF-CETPC(泳道2)由于其链间二硫键的作用，部分蛋白质形成二聚体，在PAGE胶上表现为分子量分别为17kD和34kD的双条带，还原态rhVEGF-CETPC(泳道1)为单体，在胶上表现为分子量为17kD的单条带。由于兔血清中有抗CETP抗体的存在，因此可以分别和膜上17kD和34kD的rhVEGF-CETPC蛋白带杂交，但不和rhVEGF杂交(泳道4)，证实了pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组能诱发兔产生特异的抗CETPC的抗体。
实施例9兔血清中总胆固醇、高密度酯蛋白胆固醇和低密度酯蛋白胆固醇含量测定按照日本Wako公司的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及总胆固醇(TOTAL-C)测定试剂盒中的说明书测定兔血清中HDL-C，LDL-C及TOTAL-C的含量，并计算HDL-C/TOTAL-C及LDL-C/TOTAL-C的比率。结果表明pCR3.1-X8-HBc载体对照组和生理盐水阴性对照组的HDL-C/TOTAL-C和LDL-C/TOTAL-C比率相似，无明显差异，而pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组中HDL-C/TOTAL-C显著升高，为生理盐水阴性组的2.78倍；LDL-C/TOTAL-C显著下降，为生理盐水阴性组的86.7％，见图8。
实施例10兔动脉粥样硬化实验组织病理学检查处死兔去出心脏、主动脉，观察心肌及冠状动脉、主动脉组织病理学改变。上述器官经10％甲醛溶液固定，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片(4μm厚)，HE染色，由病理专业人员在光学显微镜下阅片，根据病变轻重程度不同，依次标记为“-”、“+”、“++”、“+++”表示，其中“-”为无明显改变，“+++”为严重的病理改变。详细结果见附表1。结果显示pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组的主动脉未发生明显病变，pCR3.1-X8-HBc载体对照组的主动脉病变略轻于生理盐水阴性组。pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组和pCR3.1-X8-HBc载体对照组均未见发生冠状动脉及小动脉病变，而生理盐水阴性组的冠状动脉及小动脉均发生增厚，并有1例观察到病斑生成。病理学检查照片见图9。
附表1.家兔动脉粥样硬化病理观察结果。
实施例11兔主动脉粥样硬化病斑检测将各组新西兰兔颈动脉放血处死后，从主动脉出心脏处至髂动脉分岔处取主动脉，剔除血管背面的脂肪组织，沿背侧剪开，10％福尔马林固定4天后，以0.2％Sudan III乙醇溶液染色30min，再用70％乙醇充分洗涤后，以扫描仪将染色后的血管内表面扫下，然后使用软件(MapInfo Professional7.0)计算病斑面积和血管内皮总面积，从而计算得出病斑面积占血管内皮总面积的百分率。病斑面积占血管内皮总面积的比率结果见图10。结果显示pCR3.1-X8-HBc-CETPC实验组所产生的病斑明显小于于两组对照组，仅为生理盐水阴性对照组的19.87％，而pCR3.1-X8-HBc载体对照组略小于生理盐水阴性对照组，为生理盐水阴性对照组的83.47％。
权利要求
1.一种抗动脉粥样硬化核酸疫苗，其特征为含有编码乙肝核心蛋白(HBc)的DNA序列，并在该HBc序列中引入编码人源胆固醇酯转移蛋白C端多肽(以下简称CETPC)的DNA序列。该核酸疫苗质粒载体的非编码区中含有免疫刺激序列(以下简称ISS序列)。
2.权利要求1所述的核酸疫苗，其特征为将一限制性内切酶(AgeI)的识别位点引入HBc的第80-81位氨基酸所对应的核苷酸序列中，用于插入外源表位CETPC。CETPC插入后经转染表达的融合蛋白仍能装配成纳米级颗粒，且CETPC高密度地定位与展示于颗粒表面，极大增强CETPC的免疫原性。
3.权利要求2所述的核酸疫苗，其特征为HBc颗粒表面插入的抗原表位CETPC是人源CETP第451-476位氨基酸，其氨基酸序列是ArgAspGlyPheLeuLeuLeuGlnMetAspPheGlyPheProGluHisLeuLeuValAspPheLeuGlnSerLeuSer，其中包含有CETP的主要B细胞表位。同时在CETPC的N端引入两个柔性氨基酸IleThr，C端引入三个柔性氨基酸GlyAlaThr，用以避免CETPC在HBc颗粒上呈现时可能存在的空间位阻。
4.权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于核酸疫苗质粒载体非编码区的DNA骨架中插入由多个CpG基序组成的ISS序列。CpG基序为包含有未甲基化CpG的六聚物YpA/TpCpGpT/ApT，Y表示G、T、A、C中任意一个。该核酸疫苗中CpG基序表示为X，ISS序列结构表示为Xn，ISS序列中每个基序间可直接相联，也可间隔有若干脱氧核苷酸。n指用于ISS序列中包含的CpG基序的个数，n≥1。ISS序列没有位置限制性，插入质粒骨架非编码区的任意位置均可以发挥其免疫刺激作用。
5.一种生产该抗动脉粥样硬化核酸疫苗的方法，包括用化学合成法和PCR法合成编码人胆固醇酯转移蛋白C端多肽、乙肝核心蛋白和ISS序列的DNA，将这些DNA分步插入真核表达载体，构建出重组质粒，转化大肠杆菌获得基因工程菌；经碱裂解法对发酵后工程菌中的质粒DNA进行粗提；粗提液经阴离子交换树脂DEAE纤维素纯化，并用乙醇沉淀收集。
6.根据权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于免疫动物后能激发机体产生抗胆固醇酯转移蛋白抗体，通过该抗体与机体内内源的人抗胆固醇酯转移蛋白结合，调节体内胆固醇的分布与代谢，提高高密度脂蛋白胆固醇与低密度脂蛋白胆固醇的比例，减少粥样斑块的形成，预防和治疗动脉粥样硬化。
7.根据权利要求1所述核酸疫苗，其特征在于载体骨架上的ISS序列可作为在位佐剂增强针对胆固醇酯转移蛋白C端多肽的体液免疫，并且直接作用于动脉粥样硬化斑的形成部位，减轻动脉粥样硬化斑形成过程中的免疫损伤，从而发挥抗动脉粥样硬化的作用。
8.根据权利要求1所述抗动脉粥样硬化核酸疫苗，其特征在于可与药物载体组合制成药物组合。
9.根据权利要求1所述抗动脉粥样硬化核酸疫苗，其特征在于可与其他药物活性成分组合制成药物组合物。
全文摘要
本发明提供一种抗动脉粥样硬化核酸疫苗及其制备方法。该核酸疫苗以乙肝核心蛋白为免疫载体，以增强抗原表位胆固醇酯转移蛋白C端多肽(CETPC)的免疫原性。该质粒载体非编码区中含有由多个未甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)基元组成的免疫刺激序列。该疫苗免疫机体后能激发机体产生抗CETPC抗体，该抗体与内源胆固醇酯转移蛋白结合后抑制其活性，调节体内胆固醇的分布与代谢，减少动脉粥样斑块的形成；同时质粒骨架上的免疫刺激序列既作为在位佐剂增强引发的体液免疫，也直接作用于动脉粥样硬化斑的形成部位，减轻免疫损伤，抑制斑块的形成。该核酸疫苗从两方面共同作用，发挥预防和治疗动脉粥样硬化的效果。
文档编号A61P9/10GK1562349SQ200410014650
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月14日 优先权日2004年4月14日
发明者刘景晶, 茅丹, 朱政, 吴洁, 曹荣月, 宗莉 申请人:中国药科大学