专利名称：具有细胞保护作用的10肽的制作方法
一、发明领域本发明属于生物技术领域，具体地说涉及人工合成的具有细胞保护作用的10肽(BW8)。
背景技术：
缺氧和某些化学物质可引起神经细胞、心肌细胞和肾系膜细胞损伤。氧是在细胞内呼吸氧化还原反应中电子的最终接受体，对于细胞的代谢活动以及生存是必需的。组织缺氧是经常发生的病理现象，从组织水平上讲，缺氧的原因很多，包括中风引起的血管栓塞、慢性炎症引起的组织纤维化以及微血管的破裂所致的局部组织缺血、休克、低血压或载氧量下降等。缺氧破坏细胞的有氧呼吸，损害线粒体的氧化磷酸过程，使ATP的产生减少甚至停止，从而引起一系列的改变。高钾可激活细胞膜上电压依赖性钙通道，使细胞外钙大量内流，造成钙超载，引起细胞损伤甚至死亡。过氧化氢(H2O2)使体内自由基产生增加，增加的自由基可破坏细胞膜结构、抑制膜蛋白功能，并可使线粒体功能受损，造成DNA断裂和染色体畸变等，引起细胞损伤和死亡。
在脑缺血、心肌梗塞、肾功能衰减和某些病理状况下，细胞外钾浓度升高、氧自由基生成增加，因此除了增加血供氧外，防止细胞损伤也是治疗的目的之一。目前使用的细胞保护药物有钙通道阻断剂、氧自由基清除剂、DNA修复剂等，各有优缺点。寻找到具有细胞保护作用的多肽，可为疾病的防治提供新的选择，也对细胞损伤和保护机制的研究具有重要意义。
PC12细胞是从大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤分离而得的细胞株，对于缺氧非常敏感，其形态、结构和功能类似于交感神经细胞，具有神经元的性质，广泛应用于神经毒理及神经生物学方面的研究。培养的心肌细胞和肾系膜细胞，也是研究心脏和肾脏保护药物的常用材料。
氯化钴(CoCl2)因其使用简便，条件易控制，试验结果与缺氧基本一致，常被用作模拟缺氧的工具药。普遍认为，大多数细胞的氧感受器可能是细胞内的一种类血红素蛋白，根据其中的铁离子是否与氧结合，分为氧合状态和脱氧合状态。当缺氧时，它通过转变为脱氧合状态来感受缺氧，然后经其信息传递环节引起与缺氧相关的基因的转录。而钴离子可以取代氧感受器—血红素蛋白中的铁离子，使血红素蛋白不能和氧结合而保持还原状态，从而模拟缺氧。氯化钾(KCl)和过氧化氢引起细胞损伤模型也广泛用于细胞保护药的研究。
发明内容
本发明研究了一种人工合成的10肽(BW8)对化学缺氧、高钾和过氧化氢等引起的PC12细胞、心肌细胞和肾系膜细胞损伤的作用，还研究了BW8对PC12细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力及谷胱苷肽(GSH)的含量影响。
本发明的目的是提供一种人工合成的10肽，鉴于该肽为本发明人所发现的具有细胞保护作用的多肽，因此目前对该肽的认识仅限于我们的研究。
本发明所述BW8具有如下的多肽系列Gly Leu Ala 3Hyp Tyr IleGly Pro His His，其中3Hyp为3-羟基脯氨酸。
化学缺氧、高钾和过氧化氢等可引起PC12细胞、心肌细胞和肾系膜细胞损伤，BW8可明显抑制化学缺氧和高钾引起PC12细胞生存率的下降，可抑制化学缺氧引起的心肌细胞生存率的下降，也可抑制高钾和过氧化氢等引起的肾系膜细胞生存率的下降，还可浓度依赖性升高化学缺氧后PC12细胞GSH含量，明显提高SOD的活力，表明多肽BW8对于PC12细胞、心肌细胞和肾系膜细胞损伤具有保护作用。
四
图1是BW8肽高效液相色谱图。
图2是BW8肽质谱图。
图3是BW8肽对化学缺氧损伤后PC12细胞生存率的影响。
组1正常对照组；组2500μmol/L CoCl2损伤模型组；组30.02μmol/L BW8+500μmol/L CoCl2；组40.2μmol/L BW8+500μmol/L CoCl2；组52μmol/L BW8+500μmol/L CoCl2；组620μmol/L BW8+500μmol/L CoCl2；组720μmol/L Nimodipine+500μmol/L CoCl2.x±SD，n＝6.##P＜0.01，与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01与CoCl2模型组比较。
图4是BW8肽对高钾诱导的PC12细胞生存率下降的影响。
组1正常对照组；组2200mmol/L KCl损伤模型组；组30.2μmol/L BW8+200mmol/L KCl；组42μmol/L BW8+200mmol/L KCl；组520μmol/L BW8+200mmol/L KCl；组620μmol/L Nimodipine+200mmol/L KCl；组7200μmol/LGenistein+200mmol/L KCl.x±SD，n＝6.##P＜0.01，与正常对照组比较，**P＜0.01与KCl模型组比较。
图5是BW8肽对化学缺氧损伤后心肌细胞生存率的影响。
组1正常对照组；组2500μmol/L CoCl2损伤模型组；组32μmol/L BW8+500μmol/L CoCl2；组420μmol/L Nimodipine+500μmol/L CoCl2；组5200μmol/L Genistein+500μmol/LCoCl2.x±SD，n＝6.##P＜0.01，与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01与CoCl2模型组比较。
图6是BW8肽对高钾诱导的肾系膜细胞生存率下降的影响。
组1正常对照组；组2200mmol/L KCl损伤模型组；组30.2μmol/L BW8+200mmol/L KCl；组4200μmol/L Genistein+200mmol/L KCl.x±SD，n＝6.##P＜0.01，与正常对照组比较，**P＜0.01与KCl模型组比较。
图7是BW8肽对过氧化氢诱导的肾系膜细胞生存率下降的影响。
组1正常对照组；组250μmol/L H2O2损伤模型组；组32μmol/L BW8+50μmol/L H2O2，x±SD，n＝6.##P＜0.01，与正常对照组比较，**P＜0.01与H2O2模型组比较。
图8是BW8肽对PC12细胞化学缺氧损伤后GSH的影响。
组1正常对照组；组2125μmol/L CoCl2损伤组；组3125μmol/L CoCl2+0.2μmol/L BW8.x±SD，n＝6.##P＜0.01，与正常对照组比较；**P＜0.01与CoCl2模型组比较。
图9是BW8肽对PC12细胞化学缺氧损伤后SOD活力的影响。
组1正常对照组；组2125μmol/L CoCl2损伤模型组；组3125μmol/L CoCl2+0.2μmol/L BW8；组4125μmol/L CoCl2+2μmol/L BW8；组5125μmol/L CoCl2+20μmol/L BW8.x±SD，n＝6.##P＜0.01，与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01与CoCl2模型组比较。
具体实施例方式
。
1、材料和方法。
(1)材料。
大鼠PC12细胞和肾系膜细胞购自中科院上海细胞所。DMEM培养基为美国GIBCOL公司产品；胎生牛血清购自上海浦东高桥兽医站；胰蛋白酶为美国AMRESCO公司产品；尼莫地平(Nimodipine)、CoCl2、二甲亚砜(DMSO)和大豆异黄酮(genistein)购自美国Sigma公司；MTT购自上海迅特灵生物技术公司；Sunrise Romote/Touch Screen酶联免疫检测仪，奥地利TECAN公司产品；倒置相差显微镜(TS-100)及数码相机(cooplix-5000)，日本尼康公司产品；TY80B型脱色摇床，南京大学生物技术开发公司产品；微量可调移液器，德国eppendorf公司；分光光度计(752N型)，购自上海精密科学仪器公司；24孔培养板和96孔培养板购自丹麦NUNC公司。高效液相色谱仪Varian Prostar HPLC系统，制备柱为20×25mm，分析柱为反相C18柱。质谱仪Voyager Elite，为Perseptive Biosystem产品。
(2)方法。
多肽合成。
按照文献(陶慰孙，李惟，姜涌明.蛋白质分子基础.北京高等教育出版社，1995)，采用固相化学合成法合成多肽。
细胞培养。
取出生1天的乳鼠心室肌，无菌条件下剪碎，0.25％胰蛋白酶消化，按文献(张均田.《现代药理实验方法学》，北京医科大学-中国协和医科大学联合出版社，1998)方法进行培养。PC12细胞和肾系膜细胞培养均参照上述文献进行，于37℃、95％空气和5％CO2的培养箱中孵育培养，待细胞长满瓶底后，用D-Hanks液冲洗两次，加入0.25％胰蛋白酶消化，传代，接种于24孔培养板上，每孔体积2ml，留做损伤指标的检测。接种于96孔培养板上，每孔体积200μl，留做细胞生存率测定。
实验分组。
96孔板上细胞进入对数生长期后，吸去培养液，用D-Hanks液洗2次，每组6孔细胞，分别为空白对照组和加入终浓度为500μmol/L的氯化钴(或KCl或H2O2)及不同浓度多肽BW8的实验组，置于37℃孵箱内继续培养12小时(h)，用于细胞生存率检测。
24孔板上细胞覆盖率90％左右时，吸去培养液，用D-Hanks液洗2次，每组6孔细胞，分别为空白对照组和加入终浓度为125μmol/L的氯化钴及不同浓度多肽BW8的实验组，置于37℃孵箱内继续培养8h，用于SOD活力、GSH含量测定。
细胞生存率检测。
甲基四唑蓝(MTT)是一种四唑盐显色剂，它可以被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为难溶性蓝紫色结晶物，用DMSO溶解结晶物后测定吸光度(OD)值，可以间接测定活细胞数量。一定范围内，结晶物形成的量与细胞数成正比。该方法灵敏度高，作为药物活性的筛选重复性好，结果可靠。本实验利用MTT法观察了BW8对细胞生存率的影响。96孔板上细胞CoCl2化学缺氧处理(或KCl或H2O2处理)12h后，每孔加入终浓度为5mg/ml的MTT溶液20μl，37℃避光孵育4h后终止培养。吸去孔内上清后每孔加入150μl DMSO，脱色摇床振荡10分钟(min)，充分溶解后于酶联免疫检测仪570nm处测定各孔吸光度(OD)值。以对照组细胞生存率为100％，实验组细胞生存率按公式(实验组的吸光度/对照组的吸光度)×100％计算。
SOD活力、GSH含量测定。
24孔板细胞化学缺氧处理8h后加入含有0.05μmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、0.05％Triton X-100的PBS细胞裂解液，室温静置5min，脱色摇床振荡1min，将细胞裂解液吸出于干净的离心管中，离心2500rpm×15min，取上清冻存于-20℃，留做检测SOD的活力及GSH含量。GSH采用Mizuno法测定；SOD活性测定根据亚硝酸盐形成法进行；蛋白定量采用考马斯亮兰G250(CBBG250)法。
统计学方法。
所有计量资料均用x±SD表示，差异显著性用双尾t-检验，P＜0.05为有统计学意义。
2、结果。
(1)多肽合成。
按照文献(陶慰孙，李惟，姜涌明.蛋白质分子基础.北京高等教育出版社，1995)，采用固相化学合成法，用fmoc氨基酸为原料，采用固定羧基端向氨基端递增的方式。高效液相制备柱为20×25mm，分析柱为反相C18柱，流动相A相为0.1％三氟醋酸水溶液，B相为0.1％三氟醋酸乙氰溶液，梯度洗脱，1ml/min，20min内A相逐渐减少，由100％降至0％，B相逐渐增加，由0％增至100％，HPLC分析结果见图1。质谱仪进行分子量鉴定，分子量为1077，结果见图2。
(2)BW8肽对化学缺氧损伤后PC12细胞生存率的影响。
与正常对照组相比，500μmol/L CoCl2作用12h后显著降低PC12生存率。用0.02μmol/L、0.2μmol/L、2μmol/L和20μmol/L多肽BW8预处理15min后，可以浓度依赖性的减轻CoCl2的毒性作用，提高PC12细胞的生存率，用尼莫地平预处理15min后，也可以显著提高PC12细胞的生存率(图3)。20μmol/L多肽BW8与尼莫地平作用相当。
(3)BW8肽对高钾诱导的PC12细胞生存率下降的影响。
与正常对照组相比，氯化钾作用后显著降低PC12生存率。多肽BW8可减轻氯化钾的毒性作用，提高PC12细胞的生存率，尼莫地平和genistein也可以显著提高PC12细胞的生存率(图4)。20μmol/L多肽BW8与尼莫地平作用相当。
(4)BW8肽对化学缺氧损伤后心肌细胞生存率的影响。
与正常对照组相比，500μmol/L CoCl2作用后显著降低心肌细胞生存率。多肽BW8可减轻CoCl2的毒性作用，显著提高心肌细胞的生存率，尼莫地平和genistein也可以显著提高心肌细胞的生存率(图5)。20μmol/L多肽BW8与尼莫地平作用相当，优于200μmol/Lgenistein的作用。
(5)BW8肽对高钾诱导的肾系膜细胞生存率下降的影响。
与正常对照组相比，200mmol/L KCl作用后显著降低PC12生存率。多肽BW8可以显著提高肾系膜细胞的生存率(图6)。
(6)BW8肽对过氧化氢诱导的肾系膜细胞生存率下降的影响。
与正常对照组相比，50μmol/L H2O2作用后显著降低肾系膜生存率。多肽BW8可减轻H2O2的毒性作用，显著提高肾系膜细胞的生存率(图7)。
(7)BW8肽对PC12细胞化学缺氧损伤后GSH的影响。
选择125μmol/L CoCl2作为诱导氧化应激损伤的浓度，模拟缺氧8h后，未给予多肽BW8的模型组与正常空白对照组比较，模型组的GSH含量明显减少。0.2μmol/L BW8可以显著抑制CoCl2诱导的GSH含量下降(图8)。
(8)BW8肽对PC12细胞化学缺氧损伤后SOD活力的影响。
经过氯化钴模拟缺氧8h后，未给予多肽BW8模型组的SOD活力明显下降。不同浓度的BW8组与模型组比较，SOD的活力随着BW8的浓度的增加而明显升高，作用呈浓度依赖性(图9)。
<110>南京医科大学<120>具有细胞保护作用的10肽<160>1<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>1Gly Leu Ala 3Hyp Tyr Ile Gly Pro His His15 10
权利要求
1.一种具有细胞保护作用的10肽，其特征在于该肽的序列为GlyLeu Ala 3Hyp Tyr Ile Gly Pro His His，其中3Hyp为3-羟基脯氨酸。
2.一种具有细胞保护作用的10肽，其特征在于该肽用于保护PC12细胞、心肌细胞和肾系膜细胞。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种具有细胞保护作用的10肽，其特征在于该肽序列为Gly Leu Ala 3Hyp Tyr Ile Gly Pro His His，其中3Hyp为3－羟基脯氨酸。化学缺氧、高钾和过氧化氢等可引起PC12细胞、心肌细胞和肾系膜细胞损伤，所述10肽可明显抑制化学缺氧和高钾引起PC12细胞生存率的下降，可抑制化学缺氧引起的心肌细胞生存率的下降，也可抑制高钾和过氧化氢等引起的肾系膜细胞生存率的下降，还可浓度依赖性升高化学缺氧后PC12细胞谷胱苷肽含量，明显提高超氧化物歧化酶的活力，表明所述10肽对于PC12细胞、心肌细胞和肾系膜细胞损伤具有保护作用。
文档编号A61K38/08GK1605590SQ20041001466
公开日2005年4月13日 申请日期2004年4月16日 优先权日2004年4月16日
发明者王斌, 严虹, 李华, 肖继皋 申请人:南京医科大学