专利名称：人pct的b细胞表位肽段及其单克隆抗体的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫分析医学领域，特别涉及细胞表位肽段抗原及其单克隆抗体的应用。
背景技术：
细菌性感染只要能够早期发现、早期诊断、针对性的早期治疗，大多预后良好。否贝U，可能发展成为重度菌血症或/和严重脓毒症。根据美国CDC的报告，目前脓毒症已经成为非心脏ICU死亡的主要原因OV Engl J Med. 2003;348: 1546-1554),因此感染性炎症的早期诊断极为重要。另外，随着细菌耐药性、重症感染患者的增加，如何指导临床用药也显得愈发重要。 降I丐素原(procalcitonin, PCT)是上世纪九十年代才发现的细菌、真菌性感染的特异性标志物，是一种无激素活性的降钙素前肽，有116个氨基酸组成，I 57为N-残端，60 91为降钙素，96 116为降钙蛋白。分子量为13kD，由位于11号染色体(11ρ1514)上的CALC-I基因编码，半衰期为25 30小时，在体内外稳定性好，不会降解为降钙素，亦不受体内激素水平的影响，实验室检测快速简便，有利于临床特别是急诊广泛开展应用。在严重全身性细菌、真菌、寄生虫、急性疟疾感染、系统炎性反应综合症(SIRS)、多器官功能衰竭综合症(MODS)的诊断方面，PCT是一个具有高灵敏度、特异性的新指标。PCT主要是在细菌毒素和炎性细胞因子的刺激下产生，而在非感染性炎症状态下血清PCT —般不升高，感染性炎症过程中，PCT的生成非常快，对内毒素刺激反应2 6小时内即升高，严重全身感染者血PCT在24 h内可升高达1000倍。PCT作为一种新的感染性炎性标志物目前已被广泛认可。不仅能早期鉴别细菌与非细菌感染，更是败血症的预警和诊断指标，且PCT与细菌感染的程度成正相关，它的上升或下降直接反应疾病恶化或好转的趋势，因此，PCT的检测在细菌性感染、败血症、MODS的鉴别诊断、预后判断、疗效观察及合理指导应用抗菌药等均有重要参考价值。现有技术对PCT的制备方法多直接取自组织细胞，如甲状旁腺组织，成本高，制备过程复杂，获得产品量低，制约了对PCT的研究及应用开发。利用基因工程方法制备PCT重组蛋白是一种简单、经济、可靠的方法，可大量制备PCT蛋白，并且在此基础上可进一步制备抗PCT抗体，以进行PCT免疫检测。免疫检测的首要关键问题是如何获得特异性针对PCT的抗体，而且最好获得针对不同抗原决定簇的特异性抗体，所以进行预测选择PCT的B细胞免疫表位尤为重要。目前还没有相应的研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供B细胞表位肽段及其衍生物，其能作为降钙素原单克隆抗体的抗原。本发明的目的之二在于提供一种杂交瘤细胞，其能特异性的分泌降钙素原单克隆抗体。同时，本发明还提供所述一种单克隆抗体，其可作为加检测降钙素原的试剂。为实现上述目的，本发明的技术方案为I、人PCT的B细胞表位肽段，人PCT的B细胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。2、含有I所述人PCT的B细胞表位肽段的衍生物，所述人PCT的B细胞表位肽段的衍生物为所述人PCT的B细胞表位肽段偶联有载体蛋白BSA或KLH。3、根据I所述人PCT的B细胞表位肽段，所述人PCT的B细胞表位肽段在N末端引入半胱氨酸。4、1-3任一项所述人PCT的B细胞表位肽段制备的单克隆抗体杂交瘤细胞。5、根据4所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞，单克隆抗体的杂交瘤细胞的生物保藏号为 CCTCC NO C201138o6、5所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。 本发明的目的还在于提供上述单克隆抗体的制备方法，该方法操作简单，适用于大规模生产该单克隆抗体。为实现上述目的，本发明的技术方案在于
所述的单克隆抗体的制备方法用如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的人PCT的B细胞表位肽段为抗原，免疫所得的血清效价大于1:3200的动物的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株分泌得单克隆抗体。本发明的另一目的在于提供所述单克隆抗体的应用，该应用为检测降钙素原提供了新思路。为实现上述目的，本发明的技术方案在于
所述的单克隆抗体在制备用于检测降钙素原的诊断试剂中的应用。进一步，所述单克隆抗体与PCT重组蛋白的特异性多克隆抗体联合用于制备检测降钙素原的诊断试剂中的应用。进一步，所述PCT重组蛋白为如SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列所编码的蛋白。本发明的有益效果在于本发明制备的人降钙素原是高纯度的PCT重组蛋白(rhPCT)，该蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为建立PCT定量检测时的校准品；
通过PCT蛋白序列的B细胞表位肽段免疫小鼠制备的单克隆抗体具有纯度高(SDS-PAGE检测纯度>98%)、效价高(ELISA效价达I :512000)、特异性好、可大批量制备等优点；
人PCT蛋白中B细胞表位肽段化学合成时在其N端引入半胱氨酸，提高了其与KLH或BSA交联率(>50%)，可获得优质免疫原；
通过本发明制备的单克隆抗体、多克隆抗体可用于病人血液PCT含量的检测，如可采用“双抗体夹心"ELISA反应模式，即酶标记人抗PCT单抗、酶标板包被抗PCT多抗和被测样品PCT抗原形成“双抗体夹心”结构进行测定。
图I为抗PCT单克隆抗体的纯化色谱图，其中UV :紫外吸收光谱；cond:电导率。培养物保藏本发明中杂交瘤细胞株4-PCT 1-F2送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC N0:C201138，地址位于中国武汉武汉大学，保存日期为2011年7月3日，保藏的培养物名称为杂交瘤细胞株4-PCT 1-F2。
具体实施例方式下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如分子克隆实验手册(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)和现代免疫学实验技术(沈关心周汝麟主编)中所述的条件或制造商建议的条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。实施例I PCT重组蛋白的制备 从GENBANK获取PCT编码基因的基础上，进行密码子偏嗜性改造，化学合成编码基因片段，克隆入原核表达载体经DNA测序鉴定后诱导蛋白表达，经性质鉴定后，大量纯化制备PCT重组蛋白，该蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为后续实验中建立PCT定量检测时的校准品，具体的
一 PCT重组蛋白基因克隆
从GENBANK获得人PCT蛋白的基因序列(登录号为NM_004102)，将其递交于Graphicalcodon usage analyzer (http://guca. schoedl. del),分析其密码子偏性情况；具体的,将人PCT基因密码子在大肠杆菌中使用率〈10%的同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子，使其更加各易在大肠杆囷中表达，优化后的核昔Ife序列为如SEQ ID NO: I所不
gcaccattca ggtctgccct ggagagcagc ccagcagacc cggccacgct cagtgaggacgaagcgcgcc tcctgctggc tgcactggtg caggactatg tgcagatgaa ggccagtgag ctggagcaggagcaagagag agagggctcc agcctggaca gccccagatc taagcggtgc ggtaatctga gtacttgcatgctgggcaca tacacgcagg acttcaacaa gtttcacacg ttcccccaaa ctgcaattgg ggttggagcacctggaaaga aaagggatat gtccagcgac ttggagagag accatcgccc tcatgttagc atgccccagaatgccaacta atag
相应的多肽序列如SEQ ID N0:2所示，具体为
Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr Leu Ser GluAsp Glu Ala Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Gln Asp Tyr Val Gln Met Lys Ala SerGlu Leu Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu Gly Ser Ser Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys ArgCys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe HisThr Phe Pro Gln Thr Ala He Gly Val Gly Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Met Ser SerAsp Leu Glu Arg Asp His Arg Pro His Val Ser Met Pro Gln Asn Ala Asn上述胺基酸的中英文对照如下
谷酰胺gin Q;甘氨酸gly G ;丝氨酸ser S ;丙氨酸ala A ;苏氨酸thr T ;缬氨酸vaI V ;异亮氨酸ile I ;亮氨酸leu L ;酪氨酸tyr Y ;苯丙氨酸phe F ;组氨酸his H ;脯氨酸pro P ;天冬酰胺asn N ;甲硫氨酸met M ;谷氨酸glu E ;色氨酸trp W ;赖氨酸IysK ;半胱氨酸cys C ;精氨酸arg R;天冬氨酸Asp D为进行有效表达及纯化，在该序列的5'-及:T-端分别添加Sal I、BamH I酶切位点，其中BamH I位点后加入GATGATGATGATAAG序列，其编码Asp-Asp-Asp-Asp-Lys多肽序列为EK酶的识别位点。然后委托上海英骏生物工程有限公司进行全基因合成。合成的过程为常规基技术，可参考分子克隆实验手册一书。二 pET42a_PCT重组质粒构建
将pET42a载体与合成基因经Sal I、BamH I酶切4小时后用T4DNA连接酶4°C过夜连接。将制备好的感受态DH5a菌200 μ 1，冰浴，吸取1μ I连接产物加入管中，转化DH5 a菌，轻拍混匀，冰浴30分钟，42°C水浴90秒，取出离心管再冰浴2分钟，加入800 μ I室温的2ΧΥΤ培养液混匀，37°C摇床220rpm振荡培养I小时，分别将50μ 1、200μ I及剩下的全部转化菌涂于3个含卡那霉素抗性的2 X YT培养板上，37 °C恒温培养箱过夜培养，次日挑去白素菌落接种于LB培养基扩大培养，用碱裂解法提取质粒，取质粒用Sal I、BamH I双酶切4 小时，酶切体系为pET42a-PCT 质粒 DNA 10 μ 1，Sal I I μ I, BamH I I μ 1，IOX 缓冲液 K
2μ 1，ddH20 6 μ 1，并取酶切产物10 μ I行I. 5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见与设计值378bp一致的片段。三PCT重组蛋白诱导表达
将转化pET42a-PCT的细菌扩大培养及诱导表达，测细菌OD值达O. 6-0. 8时加入IPTG(至终浓度I mmol/L)诱导表达6 h。培养后每克湿菌以10倍体积的PBS缓冲液(pH
7.3)重悬，混匀后超声破菌，破菌完全后于4 V 10,000 rpm离心15 min，上清以O. 45 μ m微孔滤膜过滤。分别取少量上清与沉淀SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白可溶性，经鉴定表达蛋白破菌后几乎都存在上清中，为可溶性表达。四PCT重组蛋白纯化
上清经过滤后用Amersham的AKTAprime上柱纯化,Binding buffer平衡后用Elutionbuffer线性洗脱，收集主洗脱峰，用His-Binding buffer稀释10倍后进行HisTrap HP再次纯化，纯化后的产物用PBS平衡过的分子筛，收集蛋白。将获得的蛋白用HiTrap Desalting置换缓冲体系为EK切割buffer(50 mmol/L Tris-HCl，PH8. 0)，按EK酶与蛋白I :1000的质量比加入EK酶,4°C摇床60rpm切割24h。切割后用His- Binding buffer稀释后HisTrapHP纯化，15% SDS-PAGE电泳鉴定，PCT重组蛋白分子量为13Kda左右。IPTG未诱导的重组菌作阴性对照，诱导6h的重组菌为阳性对照，纯化后目的蛋白纯度达到95%以上。五PCT重组蛋白浓度、纯度测定
ILowry法测定PCT蛋白含量 制备标准曲线
权利要求
1.人PCT的B细胞表位肽段，其特征在于 人PCT的B细胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
2.含有权利要求I所述人PCT的B细胞表位肽段的衍生物，其特征在于所述人PCT的B细胞表位肽段的衍生物为所述人PCT的B细胞表位肽段偶联有载体蛋白BSA或KLH。
3.根据权利要求2所述人PCT的B细胞表位肽段，其特征在于所述人PCT的B细胞表位肽段在N末端引入半胱氨酸。
4.权利要求1-3任一项所述人PCT的B细胞表位肽段制备的单克隆抗体杂交瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，单克隆抗体杂交瘤细胞的生物保藏号为CCTCC NO :C201138。
6.权利要求4所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
7.权利要求5所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤用如SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的B细胞表位肽段为抗原，免疫所得的血清效价大于1:3200的动物的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株分泌得单克隆抗体。
8.权利要求6所述的单克隆抗体在制备用于检测降钙素原的诊断试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述单克隆抗体与PCT重组蛋白的特异性多克隆抗体联合用于制备检测降钙素原的诊断试剂中的应用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述PCT重组蛋白为如SEQID NO: I所示的核苷酸序列所编码的蛋白。
全文摘要
本发明属于医学中的免疫学领域，特别涉及人PCT(降钙素原)的B细胞表位肽段及其单克隆抗体的应用，所述表位肽段如SEQ ID NO:3所示，其可用于制备杂交瘤细胞并分泌相应的单克隆抗体；该单克隆抗体可用于制备检测降钙素原的诊断试剂；本单克隆抗体具有纯度高>98%，效价高达1512000，且特异性好、可大批量制备等优点；通过本发明制备的单克隆抗体、多克隆抗体可用于病人血液PCT含量的检测，如可采用双抗体夹心ELISA反应模式，即酶标记人抗PCT单抗、酶标板包被抗PCT多抗和被测样品PCT抗原形成“双抗体夹心”结构进行测定。
文档编号C07K19/00GK102643332SQ20111027339
公开日2012年8月22日 申请日期2011年9月15日 优先权日2011年9月15日
发明者姚静, 张宪, 易维京, 石延宾, 胡伟, 陈安, 魏勇, 黄洪涛 申请人:重庆业为基生物科技有限公司