Sars冠状病毒的细胞毒性t细胞表位肽及其用途的制作方法

专利名称：Sars冠状病毒的细胞毒性t细胞表位肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及SARS冠状病毒的细胞毒性T细胞表位肽及其用途。
背景技术：
重症急性呼吸系统综合征(SevereAcute Respiratory Syndrome, SARS)是一种由新型SARS冠状病毒(SARS-CoV)引起的致死率高的新发感染性疾病。自2003年在中国爆发以来，已有8000人以上感染，约800人死亡。然而，尚未有有效的预防、治疗方法。SARS 发生以后，已鉴定出作为SARS的致病病毒的SARS病毒(非专利文献1)，并确定了其碱基序列(非专利文献2)。SARS冠状病毒是属于单链(+) RNA病毒的冠状病毒科的新种类的冠状病毒。SARS 冠状病毒基因组非常大，有29. 7kb (非专利文献2、，根据推测编码23个蛋白质。作为主要的结构蛋白，有刺突(Spike、1256aa)、核壳体(Nucleocapsid、423aa)、膜(Membrane、222aa) 和较小的包膜(Envelope,77aa)0作为非结构蛋白，有2个多聚蛋白ppla(4382aa、序列号 31 ；GenBank收录号AAP13439)和pplM2696aa)，利用蛋白酶可以位点特异性地从这些多聚蛋白中切出各个蛋白质。现有技术文献非专利文献非专利文献1 =Ksiazek, T. G. et al.，N. Engl. J. Med. 348 1953-1966 (2003)非专利文献2 =Marra, Μ. A. et al.，Science 300 :1399-1404(2003)非专利文献3 :Yang, Ζ. Y. et al.，Nature 428 :561-564(2004)非专利文献4 :ffang. Y. D. et al.，J. Virol. 78 :5612-5618 (2004)非专利文献5 :Chen, H. et al.，J. Immunol. 175 :591-598 (2005)非专利文献6 :Zhou, Μ. et al.，J. Immunol. 177 :2138-2145(2006)

发明内容
发明所要解决的课题迄今为止，已有利用编码刺突蛋白的DNA疫苗来诱导病毒中和抗体的报道(非专利文献3)。有效的防御反应需要体液免疫和细胞免疫，在涉及SARS冠状病毒的领域中，与体液免疫相比，细胞免疫的研究尚未取得进展。细胞免疫中对于病毒防御发挥重要作用的是细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymph0Cyte、CTL)，SARS冠状病毒特异性CTL活性的调控可能成为针对SARS冠状病毒的新的治疗方法。从该观点出发，希望鉴定SARS冠状病毒蛋白中抗原性强的CTL表位肽。作为SARS冠状病毒特异性的CTL表位肽，到目前为止已经鉴定了几种来自作为结构蛋白的刺突蛋白的部分肽(非专利文献4 6)。但是，关于来自非结构蛋白的CTL表位肽，目前还没有任何报道。本发明的目的在于提供SARS冠状病毒的新的CTL表位肽。更具体而言，本发明的目的在于提供包含来自SARS冠状病毒ppla蛋白的新的CTL表位的肽、肽结合核糖体和抗原呈递细胞。另外，本发明的目的还在于提供以该肽、肽结合核糖体或抗原呈递细胞为有效成分的SARS冠状病毒特异性的HLA-A2限制性CTL的诱导剂、用于治疗或预防SARS冠状病毒感染的疫苗等。解决课题所采用的手段为了鉴定迄今尚未报道过的来自SARS冠状病毒的CTL表位，本发明人进行了以下的研究。首先，着眼于SARS冠状病毒的非结构蛋白ppla蛋白，从预测的表位候选肽中选择 30种肽。然后，确认了肽对作为MHC I类分子的HLA-A2分子具有结合亲和力，并发现了表位候选肽中特别有9种肽具有显著的CTL诱导活性。进而，通过用包含肽的肽结合核糖体进行免疫，可知可诱导CTL以及在体内活化CTL应答。基于上述见解，本发明人使提供包含来自SARS冠状病毒ppla蛋白的新的CTL表位的肽成为可能，从而完成了本发明。即，本发明提供一种肽，其包含选自由序列号10、11、12、13、15、17、18、23和对组成的组中的氨基酸序列。另外，本发明的肽优选包含选自由序列号10、12、15、17和对组成的组中的氨基酸序列，更优选包含序列号M的氨基酸序列。本发明的肽的特征在于，其为包含SARS冠状病毒特异性的细胞毒性T细胞表位的肽，是包含HLA-A2限制性细胞毒性T 细胞表位的肽。本发明提供一种肽结合核糖体，其是在核糖体的表面结合有肽的肽结合核糖体， 其中，核糖体含有磷脂和稳定剂，所述磷脂包含具有ι个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基；肽为选自上述肽中的至少1种。上述磷脂优选为包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基的磷脂，更优选为具有油酰基的磷脂。另外，上述磷脂优选为选自二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酸、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、琥珀酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺-二酰基磷脂酰乙醇胺中的至少1种。通过使核糖体中所含的磷脂具备这样的构成，能够有效地增强用于杀伤病原体感染细胞的CTL，从而能够预防、治疗感染症。上述稳定剂优选为胆固醇。通过该构成，能够使上述核糖体更稳定。上述肽优选结合在上述核糖体所含的磷脂上。由此，能够将肽呈递到核糖体表面， 从而能够更有效地诱导SARS冠状病毒特异性的CTL。另外，本发明的肽结合核糖体中，优选核糖体具有以下的组成。(A)包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的磷脂1 99. 8摩尔％ ；(B)稳定剂:0· 2 75摩尔%。另外，本发明的肽结合核糖体优选以下的组成。(I)包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的酸性磷脂1 85摩尔％ ；(II)包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的中性磷脂0. 01 80摩尔％ ；(III)结合有选自上述肽中的至少1种的、包含具有1个不饱和键的碳原子数为 14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的磷脂0. 2 80摩尔％ ；
(IV)稳定剂0. 2 75摩尔%。本发明提供一种抗原呈递细胞，其是通过使表达细胞表面抗原HLA-A2的细胞在体外与选自上述肽中的至少1种接触而制备的。上述细胞优选为自体来源的细胞，优选为同种来源的细胞。另外，本发明还提供一种SARS冠状病毒特异性的HLA-A2限制性CTL的诱导剂，其含有选自上述肽中的至少1种、上述肽结合核糖体或上述抗原呈递细胞作为有效成分。本发明提供一种用于预防SARS冠状病毒感染的疫苗，其含有选自上述肽中的至少1种、上述肽结合核糖体或上述抗原呈递细胞作为有效成分。此外，本发明提供对需要提供针对SARS冠状病毒的免疫性的对象提供免疫性的方法，其中，包括对上述对象给予选自上述肽中的至少1种、上述肽结合核糖体或上述抗原呈递细胞。本发明提供对需要提供针对SARS冠状病毒的免疫性的对象提供免疫性的方法， 其中，包括从上述对象采集细胞，使细胞在体外与选自上述肽中的至少1种接触而制备抗原呈递细胞，将抗原呈递细胞回输给上述对象。上述细胞优选为淋巴系单核细胞，更优选为树突细胞。发明的效果本发明提供包含来自SARS冠状病毒ppla蛋白的新的CTL表位的肽、肽结合核糖体和抗原呈递细胞。另外，通过该肽、肽结合核糖体或抗原呈递细胞，可诱导CTL以及在体内活化CTL应答，因此，本发明的肽、肽结合核糖体和抗原呈递细胞均可以作为用于排除 SARS冠状病毒的CTL诱导剂和/或疫苗来使用。另外，由于非结构蛋白在病毒感染的过程中比结构蛋白更早合成，因此，通过利用来自非结构蛋白PPla蛋白的CTL表位来活化免疫反应，能够期待在病毒感染初期排除病毒的效果。


图1是利用流式细胞仪获得的用肽结合核糖体免疫的小鼠的CD8和IFN- γ的染色图。图2是利用流式细胞仪获得的用刺突-1203肽结合核糖体免疫的小鼠的CD8和 IFN-Y的染色图。图3是利用流式细胞仪获得的用CFSE标记的抗原呈递细胞加强免疫的小鼠的 CFSE的染色图。
具体实施例方式以下，对用来实施本发明的最佳实施方式进行详细说明。本发明中的肽是包含来自SARS冠状病毒ppla蛋白的CTL表位的肽，具体可以举出包含选自由序列号10、11、12、13、15、17、18、23和24组成的组中的氨基酸序列的肽、以及由选自由序列号10、11、12、13、15、17、18、23和对组成的组中的氨基酸序列构成的肽。另外，优选选自由序列号10、12、15、17和M组成的组中的氨基酸序列，更优选序列号M的氨基酸序列。这些肽包含HLA-A2限制性CTL表位，更具体而言，包含HLA-A*0201限制性CTL 表位。另外，本发明的肽在不损害原来的CTL表位活性的条件下，可以以各种形式(例如未变性、融合体、糖基化、非糖基化等)使用，可以包含C末端修饰(酰胺化、酯化、醛化等)、N 末端修饰(乙酰化、生物素化、荧光标记等)和官能团的化学修饰(磷酸化、硫酸化、生物素
寸乂 O这里，关于肽的合成，可以根据通常的肽化学中使用的方法来进行。作为公知的肽合成方法，可以举出文献(Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；The Proteins, Vol 2，Academic Press Inc.，New York, 1976 ；^ 7° 千卜‘合成，丸善株式会社， 1975；^ 千K合成Q基礎i实验，丸善株式会社，1985 ；医药品的開发続第14卷·《子卜“合成，广川书店，1991)等中记载的方法。以上所述的本发明的肽通过使用一种或将两种以上组合，能够作为SARS冠状病毒特异性的HLA-A2限制性CTL的诱导剂和/或用于治疗或预防SARS冠状病毒感染的疫苗使用。即，本发明的肽能够与HLA-A2分子结合，通过呈递给表达HLA-A2分子的细胞而强烈地诱导CTL，因此，本发明的肽能够作为用于排除SARS冠状病毒的CTL诱导剂和/或疫苗使用。本发明的肽结合核糖体中所用的核糖体是指具有封闭空间的磷脂双层膜。本发明的肽结合核糖体中所用的核糖体含有磷脂和稳定剂，所述磷脂包含具有1 个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基。作为磷脂，优选使用包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基的磷脂。包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基的磷脂中，酰基的碳原子数优选为16 22，更优选为18 22，最优选为18。作为酰基，具体可以举出棕榈油酰基、油酰基、瓢儿菜基(Erucoyl)等，最优选为油酰基。包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 24的烃基的磷脂中，烃基的碳原子数优选为16 22，更优选为18 22，最优选为18。作为烃基，具体可以举出十四碳烯基、十六碳烯基、十八碳烯基、C20单烯基、C22单烯基、C24 单烯基等。磷脂所具有的甘油残基的1-位和2-位上结合的不饱和酰基或不饱和烃基可以相同也可以不同。从工业上的生产率的观点出发，优选1-位和2-位的基团相同。从使CTL活性增强至实用上足够的水平的观点出发，优选磷脂包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基。当酰基的碳原子数少于13时，有时核糖体的稳定性变差、或者CTL活性增强效果不充分。另外，当酰基的碳原子数超过M时，有时核糖体的稳定性变差。作为包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的磷脂，可以举出酸性磷脂、中性磷脂、具有能够结合肽的的官能团的反应性磷脂等种类。这些磷脂可以根据各种要求适当选择其种类和比例。作为酸性磷脂，可以使用磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰肌醇等。从使 CTL活性增强至实用上足够的水平的观点和工业上的供给性、作为医药品使用的品质等观点出发，优选使用包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基的二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酸和二酰基磷脂酰肌醇。酸性磷脂给核糖体的表面提供阴离子性电离基团，因而会赋予核糖体表面负性的ζ电位。因此，核糖体能够获得电荷排斥力，从而在水性溶剂中作为稳定的制剂而存在。这样，酸性磷脂在确保水性溶剂中的核糖体的稳定性的方面是非常重要的。作为中性磷脂，例如可以使用磷脂酰胆碱等。本发明中能够使用的中性磷脂，可以在实现CTL活性增强效果的范围内适当选择其种类和量来使用。与酸性磷脂和结合有肽的磷脂相比，中性磷脂使核糖体稳定化的功能强，能够提高膜的稳定性。从该观点出发，本发明的肽结合核糖体中使用的核糖体优选含有中性磷脂。可以在确保用于实现CTL活性增强效果的酸性磷脂、用于肽结合的反应性磷脂和稳定剂的含量的基础上，确定中性磷脂的使用里。本发明的肽通过与核糖体中所含的、包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M 的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的磷脂结合而结合到核糖体的表面上。作为用于结合该肽的磷脂，可以使用具有肽能够结合的官能团的反应性磷脂。包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 24的烃基的反应性磷脂，可以根据各种要求适当选择其种类和比例。与前述磷脂同样，反应性磷脂中也不优选磷脂中所含的不饱和酰基或不饱和烃基的碳原子数超过M或者少于14 的情况。作为反应性磷脂，可以举出磷脂酰乙醇胺或其末端改性物。另外，磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇和它们的末端改性物也可以作为反应性磷脂使用。从工业上的获得性、与肽的结合工序的简便性、收率等的角度出发，优选使用磷脂酰乙醇胺或其末端改性物。磷脂酰乙醇胺在其末端具有能够结合抗体的氨基。另外，从使CTL活性增强至实用上足够的水平的角度以及在核糖体中的稳定性和工业上的供给性、作为医药品使用的品质等的角度出发，最优选使用包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基的二酰基磷脂酰乙醇胺或其末端改性物。二酰基磷脂酰乙醇胺例如可以通过以二酰基磷脂酰胆碱为原料，使用磷脂酶D使胆碱与乙醇胺发生碱交换反应而得到。具体而言，将溶解有二酰基磷脂酰胆碱的氯仿溶液与溶解有磷脂酶D和乙醇胺的水以适当比率混合，可以得到粗反应物。利用氯仿/甲醇/ 水性溶剂，将粗反应物用硅胶柱纯化，可以得到目标二酰基磷脂酰乙醇胺。本领域技术人员可以适当选择溶剂组成比等柱纯化条件来实施。作为末端改性物，可以举出在二酰基磷脂酰乙醇胺的氨基上结合有二元反应性化合物的一个末端的二酰基磷脂酰乙醇胺末端改性物。作为二元反应性化合物，可以使用在至少一个末端上具有能够与二酰基磷脂酰乙醇胺的氨基反应的醛基或琥珀酰亚胺基的化合物。作为具有醛基的二元反应性化合物，可以举出乙二醛、戊二醛、丁二醛、对苯二甲醛等。优选为戊二醛。作为具有琥珀酰亚胺基的二元反应性化合物，可以举出二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、乙二醇-双(琥珀酰亚胺基丁二酸酯)、双琥珀酰亚胺基丁二酸酯、双琥珀酰亚胺基辛二酸酯或双琥珀酰亚胺基戊二酸酯等。另外，作为一个末端具有琥珀酞亚胺基、另一个末端具有马来酰亚胺基的二元反应性化合物，可以举出N-琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯、磺基琥珀酞亚胺基-4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺苯基)乙酸酯、 N-琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺苯基)丙酸酯、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺乙基)_环己烷-1-羧酸酯、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺乙基)-环己烷-1-羧酸酯、 Ν-(Υ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺、Ν-(ε-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺等。 当使用这样的二元反应性化合物时，能够得到具有马来酰亚胺基作为官能团的二酰基磷脂酰乙醇胺末端改性物。通过将以上所述的二元反应性化合物的一个末端的官能团结合在二酰基磷脂酰乙醇胺的氨基上，能够得到二酰基磷脂酰乙醇胺末端改性物。作为在核糖体的表面结合肽的方法，例如可以举出制备含有上述反应性磷脂的核糖体，然后添加肽使肽与核糖体中的反应性磷脂结合的方法。另外，通过预先使肽与反应性磷脂结合，然后，将所得的肽结合反应性磷脂与除反应性磷脂以外的磷脂和稳定剂混合，也可以得到表面结合有肽的核糖体。在反应性磷脂上结合肽的方法是本技术领域公知的。本发明的肽结合核糖体中使用的核糖体含有至少1种、例如含有2种以上、优选含有3种以上包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的磷脂。例如，本发明的肽结合核糖体中使用的核糖体含有选自二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酸、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、琥珀酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺-二酰基磷脂酰乙醇胺中的至少1种、例如2种以上、优选3种以上的、包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M 的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的磷脂。另外，本发明的肽结合核糖体中使用的核糖体优选分别含有至少1种下述磷脂包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的酸性磷脂、包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的中性磷脂，和包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的反应性磷脂。本发明中，作为核糖体的稳定剂，可以使用固醇类或生育酚类。作为固醇类，只要是一般作为固醇类已知的物质即可，例如可以举出胆固醇、谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇等，从容易获得等观点出发，特别优选使用胆固醇。作为生育酚类，只要是一般作为生育酚已知的物质即可，例如，从容易获得等观点出发，优选举出市售的α-生育酚。此外，只要不损害本发明的效果，本发明的肽结合核糖体中使用的核糖体也可以含有能够构成核糖体的、公知的核糖体构成成分。作为本发明的肽结合核糖体中使用的核糖体的组成，例如可以举出以下组成(A)包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的磷脂1 99. 8摩尔％ ；(B)稳定剂:0· 2 75摩尔%。需要说明的是，各成分的含量以相对于肽结合核糖体的全部构成成分的摩尔百分 t匕来表不。从核糖体的稳定性的观点出发，上述成分㈧的含量优选为10 90摩尔％、更优选为30 80摩尔％、进一步优选为50 70摩尔％。从核糖体的稳定性的观点出发，上述成分(B)的含量优选为5 70摩尔％、更优选为10 60摩尔％、进一步优选为20 50摩尔％。当稳定剂的含量超过75摩尔％时， 核糖体的稳定性受损，因而不优选。上述成分(A)中包含以下物质(a)未结合有肽的、包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1 个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的磷脂，和
(b)结合有肽的、包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的磷脂。上述成分(a)的含量通常为0. 01 85摩尔％、优选为0. 1 80摩尔％、更优选为0. 1 60摩尔％、进一步优选为0. 1 50摩尔％。上述成分(b)的含量通常为0. 2 80摩尔％、优选为0. 3 60摩尔％、更优选为 0. 4 50摩尔％、进一步优选为0. 5 25摩尔%。当含量低于0. 2摩尔％时，肽量减少，因而难以使CTL活化至实用上足够的水平，当超过80摩尔％时，核糖体的稳定性下降。上述成分(a)的磷脂中通常含有上述的酸性磷脂和中性磷脂。另外，上述成分(b) 的磷脂中含有上述的反应性磷脂。酸性磷脂的含量通常为1 85摩尔％、优选为2 80摩尔％、更优选为4 60 摩尔％、进一步优选为5 40摩尔％。当含量低于1摩尔％时，ζ电位减小，核糖体的稳定性降低，另外，难以使CTL活化至实用上足够的水平。另一方面，当含量超过85摩尔％时， 作为其结果，核糖体中的肽结合磷脂的含量下降，难以使CTL活化至实用上足够的水平。中性磷脂的含量通常为0.01 80摩尔％、优选为0. 1 70摩尔％、更优选为 0. 1 60摩尔％、进一步优选为0. 1 50摩尔％。当含量超过80.0摩尔％时，核糖体中所含的酸性磷脂、肽结合磷脂和核糖体的稳定剂的含量下降，难以使CTL活化至实用上足够的水平。结合有肽的磷脂是肽结合在所述的反应性磷脂上而得到的，关于反应性磷脂与肽结合的比例，可以在不妨碍本发明效果的范围内，通过适当应用结合所用的官能团的种类、 结合处理条件等来进行选择。例如，在使用在二酰基磷脂酰乙醇胺的末端氨基上结合二元反应性化合物双琥珀酰亚胺基丁二酸酯的一个末端而得到的二酰基磷脂酰乙醇胺的末端改性物作为反应性磷脂的情况下，通过选择结合处理各条件，能够使10 99%的反应性磷脂与肽结合。此时，未与肽结合的反应性磷脂成为酸性磷脂而含有在核糖体中。作为本发明的肽结合核糖体的优选方式，可以举出以下的组成(I)包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的酸性磷脂1 85摩尔％ ；(II)包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的中性磷脂0. 01 80摩尔％ ；(III)结合有选自上述肽中的至少1种的、包含具有1个不饱和键的碳原子数为 14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的磷脂0. 2 80摩尔％ ；(IV)稳定剂0. 2 75摩尔%。(总计100摩尔％)作为本发明的肽结合核糖体中使用的核糖体的更优选的方式，可以举出以下的组成上述成分(I) 2 80摩尔％上述成分(II) 0. 1 70摩尔％上述成分(III) :0·3 6O摩尔％上述成分(IV) 10 70摩尔％
(总计100摩尔％)作为本发明的肽结合核糖体中使用的核糖体的进一步优选的方式，可以举出以下的组成上述成分(I) 4 60摩尔％上述成分(II) 0. 1 60摩尔％上述成分(III) :0.4 5O摩尔％上述成分(IV) 20 60摩尔％(总计100摩尔％)作为本发明的肽结合核糖体中使用的核糖体的特别优选的方式，可以举出以下的组成上述成分(I) 5 40摩尔％上述成分(II) 0. 1 50摩尔％上述成分(III) :0· 5 25摩尔％上述成分(IV) 25 55摩尔％(总计100摩尔％)虽然肽结合核糖体中使用的核糖体中的磷脂中所含的不饱和酰基或不饱和烃基的特征碳原子数为14 对是本发明的特征，但是在不妨碍本发明效果的范围内，也可以含有包含碳原子数少于14或超过M的不饱和酰基或不饱和烃基的磷脂。相对于本发明的肽结合核糖体中使用的核糖体中的磷脂所含的全部不饱和酰基或不饱和烃基的总数，碳原子数为14 M的不饱和酰基或不饱和烃基数的比例例如为50%以上、优选为60%以上、更优选为75%以上、进一步优选为90%以上、最优选为97%以上(例如实质上为100% )。本发明的肽结合核糖体中使用的核糖体在不妨碍本发明的效果的情况下，可以含有包含碳原子数为14 M的范围的酞基或烃基的除磷脂以外的脂质。该脂质的含量通常为40摩尔％以下、优选为20摩尔％以下、更优选为10摩尔％以下、进一步优选为5摩尔％ 以下(例如实质上为0摩尔％)。本发明中使用的核糖体可以通过使用作为构成成分的磷脂、反应性磷脂、稳定剂、 肽等，适当进行配合或加工，并将其添加到适当的溶剂中等方法而得到。例如可以举出挤压法、涡流搅拌法、超声波法、表面活性剂去除法、反相蒸发法、乙醇注入法、预囊泡法(1 VO夕 >法)、弗氏压碎器法、W/0/W型乳液法、退火法、冻融法等制造方法。核糖体的粒径没有特别限定，从保存稳定性等的角度出发，粒径可以举出20 600nm、优选为30 500nm、更优选为40 400nm、进一步优选为50 300nm、最优选为70 230nm。需要说明的是，本发明中，为了提高核糖体的理化稳定性，在核糖体的制备过程中或制备后，可以在核糖体的内水相和/或外水相中添加糖类或多元醇类。特别是需要长期保存或制剂化过程中需要保存的情况下，优选添加并溶解糖或多元醇作为核糖体的保护剂，并通过冷冻干燥除去水分制成磷脂组合物的冷冻干燥物。作为糖类，例如可以举出葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖等单糖类；蔗糖、乳糖、纤维二糖、海藻糖、麦芽糖等双糖类；棉籽糖、松三糖等三糖类；环糊精等寡糖；糊精等多糖类；木糖醇、山梨糖醇、廿露醇、麦芽糖醇等糖醇等。这些糖类中，优选单糖类或双糖类，其中，从容易获得等的角度出发，更优选举出葡萄糖或蔗糖。
作为多元醇类，例如可以举出甘油、二甘油、三甘油、四甘油、五廿油、六甘油、七甘油、八甘油、九甘油、十甘油、聚甘油等甘油类化合物；山梨糖醇、甘露醇等糖醇类化合物； 乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、五乙二醇、六乙二醇、七乙二醇、八乙二醇、九乙二醇等。其中，从容易获得的角度出发，优选列举甘油、二甘油、三甘油、山梨糖醇、甘露醇、分子量为400 10000的聚乙二醇。核糖体的内水相和/或外水相中所含的糖类或多元醇类的浓度以相对于核糖体溶液的重量浓度计，例如可以举出1 20重量％，优选举出2 10 重量％。制造本发明的肽结合核糖体时，通过在制作肽结合前的核糖体之后使其与肽结合，能够简便地得到肽结合核糖体。例如，制备含有磷脂、稳定剂和用于在膜表面结合肽的反应性磷脂的核糖体、例如核糖体溶液，在其外水相中添加2 10重量％左右的前述糖类之一的蔗糖并溶解。将该糖添加后的制剂转移到IOml的玻璃制小瓶中，置于层式冷冻干燥机内，冷却至_40°C等使试样冻结后，利用常规方法得到冷冻干燥物。这里得到的核糖体的冷冻干燥物已经除去了水分，因此能够长期保存，然后根据需要添加特定的肽而实施后续步骤，由此能够快速简便地得到本发明的肽结合核糖体。在肽与核糖体的相互作用强因而不稳定性强的情况下等，像这样以核糖体的冷冻干燥物的阶段进行保存，并在需要时结合肽来使用是非常简便的。本发明的肽结合核糖体中使用的核糖体可以含有结合有肽的磷脂。作为得到含有结合有肽的磷脂的核糖体的方法，可以举出以下的㈧和⑶的方法。(A)制备含有磷脂、反应性磷脂、稳定剂的核糖体，向其中添加肽和二元反应性化合物，使核糖体中含有的反应性磷脂的官能团与肽的官能团通过二元反应性化合物连接。 这里可使用的二元反应性化合物可以同样地使用在反应性磷脂的末端改性物制备中所用的二元反应性化合物。具体而言，作为具有醛基的二元反应性化合物，可以举出乙二醛、戊二醛、丁二醛、对苯二甲醛等。优选举出戊二醛。另外，作为具有琥珀酰亚胺基的二元反应性化合物，可以举出二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、乙二醇-双(琥珀酰亚胺基丁二酸酯)、双琥珀酰亚胺基丁二酸酯、双琥珀酰亚胺基辛二酸酯或双琥珀酰亚胺基戊二酸酯等。 另外，作为一个末端具有琥珀酰亚胺基、另一个末端具有马来酰亚胺基的二元反应性化合物，可以使用N-琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺苯基)乙酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺苯基)丙酸酯、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺乙基)_环己烷-1-羧酸酯、磺基琥珀酰亚胺基-4- (N-马来酰亚胺乙基)-环己烷-1-羧酸酯、N- ( γ -马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺、Ν-( ε -马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺等。使用所述二元反应性化合物时，能够得到具有马来酰亚胺基作为官能团的反应性磷脂(例如磷脂酰乙醇胺)的末端改性物。(B)制备含有磷脂、反应性磷脂、稳定剂的核糖体，向其中添加肽而使核糖体中所含的反应性磷脂的官能团与肽的官能团连接而结合的方法。作为所述㈧和⑶中的键的种类，例如可以举出离子键、疏水键、共价键等，优选为共价键。进而，作为共价键的具体例子，可以举出席夫碱键、酰胺键、硫醚键、酯键等。以上的2种方法均能够在核糖体中所含的反应性磷脂上结合肽，从而形成核糖体中结合有肽的磷脂。
上述(A)的方法中，作为使原料核糖体与肽通过二元反应性化合物相结合的方法的具体例子，例如可以举出利用席夫碱键的方法。作为通过席夫碱键将核糖体与肽结合的方法，可以举出制备表面具有氨基的核糖体，在核糖体的悬浮液中添加肽，然后，加入作为二元反应性化合物的二醛，使核糖体表面的氨基与肽中的氨基通过席夫碱而结合的方法。作为该结合顺序的具体例子，例如可以举出以下的方法。(A-I)为得到表面具有氨基的核糖体，在核糖体原料脂质(磷脂、核糖体的稳定剂等)中混合包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的反应性磷脂(例如，磷脂酰乙醇胺)，制成核糖体表面存在规定量的氨基的核糖体。(A-2)向上述核糖体悬浮液中添加肽。(A-3)然后，加入戊二醛作为二元反应性化合物，进行规定时间的反应从而在核糖体与肽之间形成席夫碱键。(A-4)然后，为使剩余的戊二醛的反应性失活，在核糖体悬浮液中加入廿氨酸作为含氨基的水溶性化合物并使其反应。(A-5)通过凝胶过滤、透析、超滤、离心分离等方法，除去未结合到核糖体上的肽、 戊二醛与甘氨酸的反应产物和剩余的甘氨酸，得到肽结合核糖体悬浮液。作为上述(B)的方法的具体例子，可以举出在磷脂膜中引入具有能够形成酰胺键、硫醚键、席夫碱键、酯键等的官能团的反应性磷脂的方法。作为这样的官能团的具体例子，可以举出琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、氨基、亚氨基、羧基、羟基、巯基等。作为引入到核糖体中的反应性磷脂的例子，可以使用前述的包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 24的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的反应性磷脂(例如磷脂酰乙醇胺)的氨基末端的末端改性物。作为该结合顺序的具体例子，以使用二酰基磷脂酰乙醇胺的情况为例如下进行说明。(B-I)通过公知的方法，使包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基的二酰基磷脂酰乙醇胺与双琥珀酰亚胺基丁二酸酯仅在一个末端发生反应，得到末端具有琥珀酰亚胺基作为官能团的、结合有双琥珀酰亚胺基丁二酸酯的二酰基磷脂酰乙醇胺。(B-2)通过公知的方法，将上述结合有双琥珀酰亚胺基丁二酸酯的二酰基磷脂酰乙醇胺与其它核糖体构成成分(磷脂、稳定剂等)混合，制成表面具有琥珀酰亚胺基作为官能团的核糖体组合物。(B-3)在上述核糖体组合物悬浮液中加入肽，使肽中的氨基与磷脂膜表面的琥珀酰亚胺基反应。(B-4)通过凝胶过滤、透析、超滤、离心分离等方法除去未反应的肽、反应副产物等，得到含有肽结合磷脂的核糖体悬浮液。使核糖体与肽结合时，以多数情况下作为官能团含有的氨基或巯基为对象在实用上是优选的。以氨基为对象时，通过与琥珀酰亚胺基反应，能够形成席夫碱键。以巯基为对象时，通过与马来酰亚胺基反应，能够形成硫醚键。本发明中的抗原呈递细胞是通过使表达细胞表面抗原HLA-A2的细胞在体外与1 种或2种以上的肽接触而制备的细胞。细胞优选为自体来源和/或同种来源的细胞。另夕卜，作为细胞，可以举出表达细胞表面抗原HLA-A2(例如HLA-A*0201)的细胞。优选为淋巴系单核细胞(T细胞、巨噬细胞、B细胞、树突细胞等)，更优选为树突细胞。本发明的抗原呈递细胞通过给予(注入)对象，能够作为SARS冠状病毒特异性的 HLA-A2限制性CTL的诱导剂和/或用于治疗或预防SARS冠状病毒的感染的疫苗使用。即， 本发明的抗原呈递细胞将本发明的肽呈递到细胞表面，能够强烈地诱导CTL，因此能够作为用于排除SARS冠状病毒的CTL诱导剂和/或疫苗使用。抗原呈递细胞优选每IO7的细胞使用优选1 100 μ Μ、更优选5 50 μ Μ、例如10 μ M的肽而制备的抗原呈递细胞。本发明的肽、肽结合核糖体和抗原呈递细胞能够作为SARS冠状病毒特异性的 HLA-A2限制性CTL的诱导剂和/或用于治疗或预防SARS冠状病毒感染的疫苗使用。对象可以是包括人在内的任何动物。在特定的实施方式中，对象为人。本发明的诱导剂和/或疫苗根据作为有效成分的物质的性状制成一般的医药组合物的形态，组合物的直接递送一般通过非经口的注射(例如皮下注射、腹腔内注射、静脉内注射、肌肉内注射、组织间隙的空间内的注射等)来实现。作为其它给予方法，可以举出粘膜给予(例如，经口、滴鼻或经肺)、经眼的给予、经皮的给予和栓剂。S卩，非经口给予的情况下，可以以注射剂、经鼻剂、局部给予剂(经皮剂等)、直肠给予剂等给予形态给予。经口给予的情况下，可以以本领域中通常使用的给予形态给予。作为注射剂，例如可以举出无菌的溶液或悬浮液、乳剂等，具体可以举出水、水-丙二醇溶液、 缓冲液、0. 4%的生理盐水等。另外，制成液态制剂的情况下，可以冷却保行或者通过冷冻干燥等除去水分后进行保存。冷冻干燥制剂在使用时加入注射用蒸馏水等，再溶解后使用。作为局部给予剂，例如可以举出霜剂、软膏、洗剂、经皮剂等。作为经口剂或直肠给予剂，例如可以举出胶囊、片剂、丸剂、散剂、滴剂、栓剂、液体剂等。以上的剂型通过本领域中通常实施的方法与药学上可容许的赋形剂、添加剂一起制成制剂。作为药学上可容许的赋形剂、添加剂，可以举出载体、结合剂、香料、缓冲剂、增粘剂、着色剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、助悬剂、防腐剂、PH调节剂、渗涨度调节剂、浸润剂等。 另外，作为药学上可容许的载体，例如可以举出碳酸镁、乳糖、果胶、淀粉、甲基纤维素等。含有本发明的肽、肽结合核糖体或抗原呈递细胞作为有效成分的诱导剂、以及含有本发明的肽、肽结合核糖体或抗原呈递细胞作为有效成分的疫苗，为了增强其效果，还可以含有佐剂。作为佐剂，可以举出氢氧化铝凝胶、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、百日咳菌佐剂、聚(I C)、CpG-DNA等。其中，优选CpG-DNA。CpG-DNA是含有非甲基化CpG基序的DNA， 通过活化树突细胞，能够增强本发明的肽、肽结合核糖体或抗原呈递细胞的CTL诱导效应。制剂中的本发明的肽的给予量、制剂的给予次数因症状、年龄、体重、给予形态等的不同而不同，通常为0. Olyg lmg、优选为0. 1 μ g 500 μ g、更优选为l.Oyg 100μ g，优选以该剂量几天至几个月给予1次。例如，在初始免疫(即，治疗性或预防性给予)时对于成人患者给予1. O μ g 500 μ g的肽，根据患者血液中的特异性CTL活性测定所反映的患者的应答和状态，在几周至几个月后按照加强疗法在其后进行1. 0 μ g 100 μ g 的肽的加强给予。另外，本发明的抗原呈递细胞的给予细胞数优选为IO9 IO6个、更优选为IO8 IO7个，可以根据症状、年龄、体重、给予形态等进行适当调整。实施例以下，基于实施例更具体地说明本发明，但本发明不限于以下的实施例。
(实施例1:CTL表位的预测)使用两种表位预测计算机软件BIMAS(URL :http//www-bimas. cit. nih. gov/ molbio/hla_bind/)和 SYFPEITHI (URL :http://www. syfpeithi. de/)对 ppla 的候选表位进行检索。从以HLA分子HLA-A*0201和肽长度9 10氨基酸残基为对象的检索中选出 30种在两种分析方法中均显示高预测分值的表位候选肽。这30种表位候选肽的氨基酸序列如表1所示。对于30种表位候选肽，分别制作合成肽，并对实际能够作为表位起作用的肽进行检索，为进一步分析鉴定出的9种表位肽的功能进行以下的实施例1 6。[表1]
权利要求
1.一种肽，其包含选自由序列号10、11、12、13、15、17、18、23和24组成的组中的氨基酸序列。
2.一种肽结合核糖体，其是在核糖体的表面结合有肽的肽结合核糖体，其中，核糖体含有磷脂和稳定剂，所述磷脂包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基；肽为选自权利要求1所述的肽中的至少1种。
3.如权利要求2所述的肽结合核糖体，其中，所述磷脂为包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基的磷脂。
4.如权利要求2所述的肽结合核糖体，其中，所述磷脂为具有油酰基的磷脂。
5.如权利要求2所述的肽结合核糖体，其中，所述磷脂为选自二酰基磷脂酰丝氨酸、 二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酸、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、琥珀酰亚胺基-二酰基磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺-二酰基磷脂酰乙醇胺中的至少1种。
6.如权利要求2所述的肽结合核糖体，其中，所述稳定剂为胆固醇。
7.如权利要求2所述的肽结合核糖体，其中，在核糖体中所含的、包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的磷脂上结合有选自权利要求1所述的肽中的至少1种。
8.如权利要求2所述的肽结合核糖体，其中，核糖体具有以下的组成(A)包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的磷脂1 99. 8摩尔％ ；(B)稳定剂0.2 75摩尔％。
9.一种肽结合核糖体，其具有以下的组成(I)包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的酸性磷脂1 85摩尔％ ；(II)包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的中性磷脂0. 01 80摩尔％ ；(III)结合有选自权利要求1所述的肽中的至少1种、且包含具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的酰基或具有1个不饱和键的碳原子数为14 M的烃基的磷脂0. 2 80摩尔％ ；(IV)稳定剂；0.2 75摩尔%。
10.一种抗原呈递细胞，其是通过使表达细胞表面抗原HLA-A2的细胞在体外与选自权利要求1所述的肽中的至少1种接触而制备的。
11.如权利要求10所述的抗原呈递细胞，其中，所述细胞为自体来源的细胞。
12.如权利要求10所述的抗原呈递细胞，其中，所述细胞为同种来源的细胞。
13.—种SARS冠状病毒特异性的HLA-A2限制性CTL的诱导剂，其中，含有选自权利要求1所述的肽中的至少1种作为有效成分。
14.一种用于预防SARS冠状病毒感染的疫苗，其中，含有选自权利要求1所述的肽中的至少1种作为有效成分。
15.一种SARS冠状病毒特异性的HLA-A2限制性CTL的诱导剂，其中，含有权利要求2 9中任一项所述的肽结合核糖体作为有效成分。
16.一种用于预防SARS冠状病毒感染的疫苗，其中，含有权利要求2 9中任一项所述的肽结合核糖体作为有效成分。
17.—种SARS冠状病毒特异性的HLA-A2限制性CTL的诱导剂，其中，含有权利要求 10 12中任一项所述的抗原呈递细胞作为有效成分。
18.一种用于预防SARS冠状病毒感染的疫苗，其中，含有权利要求10 12中任一项所述的抗原呈递细胞作为有效成分。
19.如权利要求13或15所述的SARS冠状病毒特异性的HLA-A2限制性CTL的诱导剂， 其中，还含有CpG-DNA。
20.如权利要求14或16所述的用于预防SARS冠状病毒感染的疫苗，其中，还含有 CpG-DNA。
全文摘要
本发明的目的在于提供SARS冠状病毒的新的CTL表位肽。本发明提供包含选自由序列号10、11、12、13、15、17、18、23和24组成的组中的氨基酸序列的肽。
文档编号C07K7/06GK102227442SQ20098014759
公开日2011年10月26日 申请日期2009年11月27日 优先权日2008年11月28日
发明者内田哲也, 小田洋, 松井政则 申请人:国立感染症研究所所长代表的日本国, 学校法人琦玉医科大学, 日油株式会社