专利名称：T细胞表位肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及花粉过敏原的T细胞表位肽及以该肽为有效成分的基于肽的免疫治疗方法中的组合物。该组合物用于治疗和/或预防春天的花粉病。
背景技术：
日本人口中大约10％患有发生于春天的花粉病，例如雪松花粉病。这种情形正在增加并引起了大家的注意。
花粉病发生的时期一般相应于花粉散发的时期。在许多情况下，在雪松花粉散发的季节过后花粉病的症状仍会保持，这是由于大部分雪松花粉病患者同时也对日本扁柏花粉(Hiroki cypress pollens)过敏，其花粉在雪松花粉散发期后即开始。因此，同时对日本扁柏花粉敏感的患者在一年的一长段时间中都患有花粉病的症状。
雪松花粉和日本扁柏花粉具有同样的抗原性(Takeshi Ide等，AllergyClinic 11,174-178,1991)。已经确定了雪松花粉和日本扁柏花粉之间IgE抗体的交叉反应性(Taniai M.等，Mol.Immunol.30,183-189,1993)。患春天花粉病的患者其过敏原特异性Ig E抗体的阳性指数对雪松花粉而言是83.5％，对日本扁柏花粉是80.0％，二者同时则是76.4％(Mitsuhiro Okano等，Allergy 43,1179-1184,1994)。此外，60％患雪松花粉病的患者具有日本扁柏花粉特异性的IgE抗体(Yozo Saito,Chiryo(Therapy)78,1571-1576,1996)。根据这些报道，一般认为患雪松花粉病的患者会患上日本扁柏花粉的花粉病，反之亦然。
花粉病是一种典型的由花粉过敏原(它是引起过敏的抗原因此基本上就是抗原)和特异于该过敏原的IgE抗体之间的抗原-抗体反应诱导的Ⅰ型立即过敏。因此，目前所用的花粉病的预防和治疗方法其理论根据是Ⅰ型过敏的形成机制。下面将简要描述该机制。
被机体排斥的抗原由抗原呈递细胞呈递给辅助T细胞。结果，B细胞在抗体产生细胞中成熟。抗体产生细胞产生抗原特异性的Ig E抗体，该抗体结合到肥大细胞表面。随后被排斥的抗原结合到肥大细胞表面的Ig E抗体上。这种刺激使肥大细胞释放化学介质例如组胺，于是引起过敏症状。
根据上述机制，下面是三种用于预防和治疗过敏的主要方法1)排斥引起过敏的抗原，2)典型地使用抗组胺剂的化学治疗，以及3)使用过敏原的脱敏作用。但是，方法1)在实践中难于操作，而且方法2)仅仅是一种症状性的治疗。方法3)看起来是解决根本问题的唯一途径，但它并非总是有效而且可能会引起严重的副作用例如过敏性休克。
由于这些原因，最近已尝试将使用过敏原的T细胞表位肽的基于肽的免疫治疗来预防和治疗过敏。T细胞表位参加引起过敏的临床症状的蛋白质过敏原的免疫反应的起始和保持。这些T细胞表位结合到抗原呈递细胞表面的Ⅱ类HLA分子上刺激相关的T细胞亚群。据信这种刺激能引发辅助T细胞水平的起始反应。这种起始反应能引起T细胞的增殖，淋巴因子的分泌，局部发炎反应，增殖的免疫反应细胞向发炎部位的迁移，以及在抗体产生前B细胞级联的活化。作为这些抗体的同型的IgE抗体对过敏的发展和保持是至关重要的。另外，其产生会受到上述级联开始时辅助T细胞分泌的淋巴因子的性质影响。T细胞表位是被T细胞受体识别的基本元素和最小单位。过敏发炎可通过控制辅助T细胞的反应来治疗，使用T细胞表位肽构成了免疫抑制的重要部分。
已知对过敏的使用T细胞表位的治疗剂包括由猫源过敏原组成的治疗组合物(日本(JP-WA)No.Hei 7-505365公开的PCT申请)，由雪松花粉T细胞表位肽Cryj1组成的治疗组合物(JP-WA-Hei8-502163)，将雪松花粉T细胞表位肽Cryj1和Cryj2结合而成的多表位肽(日本专利申请号Hei8-80702)。据报道日本扁柏花粉主过敏原Chao1分子量为45KD或50KD。每个分子其等电点都为6.8并且由含有5％糖类的蛋白质组成(Takeshi Ide等，Nippon Kafun Gakkaishi(Joumal ofthe Japanese Pollen Association)34,39,1988)。但并不知道其基本结构从而在过敏原分子表面上还未识别T细胞表位位点。最近，本发明人成功地克隆了日本扁柏过敏原基因，并表明了在Chao1之外还存在另一类型的过敏原，即Chao2。而且还确定了Chao1和Chao2的基本结构(日本专利申请号Hei6-335089)。
本发明的公开雪松花粉散发期与日本扁柏花粉散发期重叠是指花粉散发期的交叉。这两种花粉具有一个相同的抗原性，这使得难以把由雪松花粉引起的症状与由日本扁柏引起的症状区分开来。甚至在雪松花粉散发期过后该症状还会继续并发展。由于该时期空气中的花粉绝大部分是日本扁柏花粉，这些症状看起来似乎是由日本扁柏花粉引起的。由于所种植的日本扁柏要多于雪松，因此雪松花粉的散发量逐年增加并且将来不久将会超过雪松花粉的散发量。因此建立一种方法用于预防和治疗对春天由树木花粉引起的基本的(root)一系列(overall)花粉病的过敏病是有用的，花粉病包括日本扁柏花粉病和雪松花粉病。有希望将使用T细胞表位肽的基于肽的免疫治疗能产生对基本的花粉病的过敏治疗。如上所述，对雪松花粉病而言已有几种这类免疫治疗的方法。然而，对日本扁柏花粉病或由春天树木的花粉，包括雪松和日本扁柏花粉引起的花粉病还没有任何报道。
本发明的一个目的是提供用于日本扁柏花粉病的基于肽的免疫治疗的T细胞表位肽。本发明的另外一个目的是提供T细胞表位肽用于治疗春天由树木花粉引起花粉病的患者包括与日本扁柏花粉具交叉反应性的雪松花粉病患者的基于肽的免疫治疗。
本发明人通过以覆盖了日本扁柏花粉过敏原全部一级结构的人工重叠肽刺激由日本扁柏花粉病患者建立的T细胞系鉴定了日本扁柏花粉过敏原分子上的T细胞表位位点，从而解决了上述问题。
本发明由每一个权利要求中描述的发明组成，并且将在下面进行详细描述。
本发明人确定了以SEQ ID NO:1表示的日本扁柏花粉过敏原主要抗原Chao1(成熟蛋白质)的氨基酸序列(在日本专利申请No.Hei6-335089中有描述)以及以SEQ ID NO:2表示的Chao2的氨基酸序列。Chao1的氨基酸序列与雪松花粉过敏原Cryj1的氨基酸序列具有80％的同源性，Chao2的氨基酸序列与雪松花粉过敏原Cryj2的氨基酸序列具有75％的同源性。
在来自于花粉、螨类和蜂毒的过敏原中有一些氨基酸取代。将这些种类的过敏原称之为同系过敏原。例如从桦树花粉BetvⅠ中分离到了11个同系过敏原，并且其氨基酸序列之间的差异在2％到15％的范围内(Swoboda,I.等，J.Biol.Chem.270:2607-2613,1995)。目前在Cryj2中发现了其成熟蛋白质中有六个氨基酸残基取代的两个同系过敏原(未审
公开日本专利申请(JP-A)No.Hei8-47392及No.7-170986)。本领域的技术人员可以合乎情理地认为Chao1和Chao2中也存在着同系过敏原。本发明中这类同系过敏原也包括Chao1和Chao2。
将雪松树这一科分成9个属，日本扁柏科分成七个属。据报道来自于属于雪松(杉科)科的日本柳杉、北美红杉以及水杉、曾被认为属于一个独立的科、雪松科或松科的金松(或意大利伞松，Umbrella Pine)的过敏原与来自于柏科的日本扁柏、日本花柏、侧柏、杜松及圆柏的过敏原有交叉反应性(TakeshiIde等，Allergy Clinic,11,174-178,1991)。从该报道看来，雪松过敏原与日本扁柏有相当广泛的交叉反应。因此，本发明的肽对日本扁柏花粉病与雪松花粉病都是普遍有效的。
为了得到本发明的T细胞表位肽合成了覆盖Chao1和Chao2整个一级结构的重叠肽；每一个肽含有足够数量的氨基酸残基(12到20个残基)。本发明的肽刺激和/或抑制来源于患由春天时树木花粉引起的花粉病的患者的T细胞活性。也就是说，本发明的肽可以引起T细胞的增值或T细胞的反应，例如淋巴因子分泌和/或可诱导T细胞的无反应性(无反应)。用与JP-A-Hei 8-47392的描述相同的方法以T细胞生长作指数可以鉴定过敏原分子上的T细胞表位位点。尤其是从日本扁柏花粉患者的外周淋巴细胞对每个患者建立了与Chao1和Chao2产生特异反应的T细胞系或T细胞克隆。在重叠肽的每一种肽都存在的条件下培养T细胞系或T细胞克隆。在肽存在的条件下通过测定T细胞的增殖来识别表位位点(例如，细胞对[3H]胸腺嘧啶的吸收)并计算其刺激指数。此处所用的刺激指数(SI)是指在用没有肽时细胞对[3H]胸腺嘧啶的放射性(cpm)吸收水平(对照)的值去除在有肽存在条件下细胞对[3H]胸腺嘧啶放射性(cpm)吸收水平的值而得到的。根据所得的数据，对每个患者组都计算了每种肽的平均刺激指数。将引起T细胞反应和/或T细胞无反应的肽定义为T细胞刺激活性。本发明优选的T细胞表位肽具有T细胞刺激活性因此含有至少一个T细胞表位。Chao1的T细胞表位肽的实例见
图1(具体见图2、图3以及SEQ ID NO:3到SEQ IDNO:37)，包括肽#1-2(SEQ ID NO:4)，肽#1-4(SEQ ID NO:6)，肽#1-5(SEQ ID NO:7)，肽#1-6(SEQ ID NO:8)，肽#1-7(SEQ IDNO:9)，肽#1-8(SEQ ID NO:10)，肽#1-10(SEQ ID NO:12)，肽#1-11(SEQ ID NO:13)，肽#1-12(SEQ ID NO:14)，肽#1-14(SEQID NO:16)，肽#1-15(SEQID NO:17)，肽#1-16(SEQ ID NO:18)，肽#1-19(SEQ ID NO:21)，肽#1-20(SEQ ID NO:22)，肽#1-21(SEQID NO:23)，肽#1-22(SEQ ID NO:24)，肽#1-23(SEQ ID NO:25)，肽#1-24(SEQ ID NO:26)，肽#1-25(SEQ ID NO:27)，肽#1-26(SEQID NO:28)，肽#1-27(SEQ ID NO:29)，肽#1-30(SEQ ID NO:32)，肽#1-31(SEQ ID NO:33)，肽#1-32(SEQ ID NO:34)，肽#1-33(SEQID NO:35)，以及肽#1-34(SEQ ID NO:36)(图4)。Chao2的T细胞表位肽的实例见图5(具体见图6、图7以及SEQ ID NO:38到SEQ IDNO:88)，包括肽#2-5(SEQ ID NO:42)，肽#2-7(SEQ ID NO:44)，肽#2-8(SEQ ID NO:45)，肽#2-9(SEQ ID NO:46)，肽#2-10(SEQID NO:47)，肽#2-11(SEQ ID NO:48)，肽#2-12(SEQ ID NO:49)，肽#2-13(SEQ ID NO:50)，肽#2-14(SEQ ID NO:51)，肽#2-15(SEQID NO:52)，肽#2-16(SEQID NO:53)，肽#2-17(SEQ ID NO:54)，肽#2-18(SEQ ID NO:55)，肽#2-19(SEQ ID NO:56)，肽#2-20(SEQID NO:57)，肽#2-21(SEQ ID NO:58)，肽#2-22(SEQ ID NO:59)，肽#2-23(SEQ ID NO:60)，肽#2-24(SEQ ID NO:61)，肽#2-25(SEQID NO:62)，肽#2-26(SEQ ID NO:63)，肽#2-27(SEQ ID NO:64)，肽#1-2(SEQ ID NO:65)，肽#2-30(SEQ ID NO:67)，肽#2-31(SEQID NO:68)，肽#2-32(SEQ ID NO:69)，肽#2-33(SEQID NO:70)，肽#2-34(SEQ ID NO:71)，肽#2-35(SEQ ID NO:72)，肽#2-36(SEQID NO:73)，肽#2-37(SEQ ID NO:74)，肽#2-38(SEQ ID NO:75)，肽#2-40(SEQ ID NO:77)，肽#2-41(SEQ ID NO:78)，肽#2-42(SEQID NO:79)，和肽#2-43(SEQ ID NO:80)(图8)。更优选地，该T细胞表位的平均刺激指数为2.0或更多。实例包括肽#1-2(SEQ ID NO:4)，肽#1-7(SEQ ID NO:9)，肽#1-8(SEQ ID NO:10)，肽#1-20(SEQ ID NO:22)，肽#1-22(SEQ ID NO:24)，肽#1-24(SEQ IDNO:26)，肽#1-26(SEQ ID NO:28)，肽#1-32(SEQID NO:34)，肽#1-33(SEQ ID NO:35)，以及肽#1-34(SEQ ID NO:36)，如图1所示。以及肽#2-10(SEQ ID NO:47)，肽#2-20(SEQ ID NO:57)，肽#2-21(SEQ ID NO:58)，肽#2-40(SEQ ID NO:77)，肽#2-41(SEQID NO:78)，肽#2-42(SEQ ID NO:79)，和肽#2-43(SEQ ID NO:80)，如图5所示。最优选地，该T细胞表位肽的最小阳性指数为100。其实例包括肽#1-7(SEQ ID NO:9)，肽#1-22(SEQ ID NO:24)，肽#1-32(SEQ ID NO:34)，肽#1-33(SEQ ID NO:35)，如图1所示。以及肽#2-20(SEQ ID NO:57)，肽#2-40(SEQ ID NO:77)，肽#2-41(SEQID NO:78)，肽#2-42(SEQ ID NO:79)，和肽#2-43(SEQ ID NO:80)，如图5所示。此处所用的“阳性指数”是通过将某肽的平均刺激指数乘以对该肽具有T细胞反应的患者的出现频率(％)而得到的。
为了精确地识别该表位，具有T细胞刺激活性因而含有至少一个T细胞表位的肽可通过在该肽的氨基端或羧基端缺失任何氨基酸残基来进行修饰。当两个或多个具重叠区域的肽产生T细胞刺激活性时，可以制备一个含重叠肽的全部或部分的新的T细胞表位肽，并以相同方法测定其T细胞刺激活性。
本发明的T细胞表位肽有可能与T细胞交叉反应中的Cryj1或Cryj2是免疫相关的。尤其是，1)Chao1的氨基酸序列与Cryj1的氨基酸序列有80％的同源性，Chao2的氨基酸序列与Cryj2的氨基酸序列有75％的同源性；2)除两个氨基酸外(Chao1第12位上的丙氨酸相当于CJI-1上的丝氨酸，Chao1第15位上的天冬氨酸相当于CJI-1上的丙氨酸)，本发明实施例5中Chao1的T细胞表位肽#1-2的氨基酸序列(相当于成熟型Chao1的SEQ ID NOS:11-30的氨基酸序列)与Cryj1的T细胞表位肽的CJI-1氨基酸序列(相当于成熟型Cryj1的SEQ ID NOS:11-30的氨基酸序列)是相同的；以及3)雪松花粉与日本扁柏花粉具有相同的抗原性。由于这些原因，本发明T细胞表位肽的来源不限于日本扁柏。本发明的T细胞表位肽不仅对日本扁柏花粉病有效，而且对雪松花粉病也有效。在本发明的T细胞表位肽中，参与识别T细胞受体的氨基酸残基可用已知方法确定(例如测定因氨基酸残基取代而引起的可能的T细胞刺激活性的变化)。用抗原特异性地控制T细胞刺激活性的其它氨基酸残基来取代在与T细胞受体互作中具重要作用的氨基酸残基，这样就可以抑制过敏性发炎(增加T细胞反应性，改变淋巴因子产生形式，无反应性等)。据报道在人过敏模型中，当雪松花粉Cryj1上T细胞表位肽的T细胞识别位点的一个氨基酸残基被另一个氨基酸取代(第339位的苏氨酸被取代为缬氨酸)时，所得类似肽与野生型肽在T细胞生长及IL-4的产生方面是基本相同但却提高了抑制IgE抗体产生的IFN-γ的产生(Ikagawa,S.等，J.Aller.Clin.Immunol.97,54-64,1996)。还进一步表明，HLA第二类分子的结合基元包含了3至5个由通过1至2个中间氨基酸残基安排的氨基酸残基，当这些残基含有几种特定的氨基酸残时，该肽会结合到HLA第二类分子上(Matushita,S.等J.Exp.Med.180:877-883，1994)。因此，用已知的方法通过确定对与HLA第Ⅱ类分子反应中有重要作用的本发明的T细胞表位肽的氨基酸残基，然后用其它氨基酸残基来取代所确定的氨基酸残基就可以防止过敏性发炎。而且，为增加其可溶性可以对本发明的T细胞表位肽进行修饰，于是也就增加了其治疗或预防效应或稳定性。这类修饰包括氨基酸残基的取代、缺失和增加。
本发明中，T细胞表位肽优选不与IgE抗体结合。即使与IgE抗体结合，其结合程度也明显低于与天然日本扁柏花粉过敏原与该抗体的结合，所说的肽由该日本扁柏花粉诱导产生。
本发明的T细胞表位肽优选含有至少7个氨基酸残基。这些区域可通过对酶例如组织蛋白酶或胰蛋白酶的切割敏感的接头例如精氨酸-精氨酸或赖氨酸-赖氨酸连接以增加对抗原呈递细胞的加工的敏感性。由此可得到含有一个或多个T细胞表位的肽区域。本发明的T细胞表位肽可以与其它肽例如Cryj1的T细胞表位肽(JP-A-Hei 8-502163)和/或Cryj2的T细胞表位肽(JP-WA-Hei8-47392)结合使用。
当将含有至少一个本发明的T细胞表位肽的肽向对日本扁柏花粉和/或对日本扁柏及雪松花粉过敏的个体给药时，该肽可控制该个体对过敏原的过敏反应。因此该肽对基于肽的免疫治疗是有效的。尤其是，本发明的T细胞表位肽的与雪松花粉的T细胞表位肽的结合可更加有效地用于由春天以雪松和日本扁柏花粉为代表的树木花粉引起花粉病的患者的基于肽的免疫治疗。
本发明的T细胞表位肽可用作由日本扁柏花粉过敏原或其它与日本扁柏花粉过敏原有免疫交叉反应性的树木花粉引起的花粉病的诊断工具。在这种应用上，将本发明的T细胞表位肽加入到收集自患者的外周淋巴细胞中，其加入量约为0.1微克/毫升到约1毫克/毫升优选约1到300微克/毫升。将混合物温育一周后，测定淋巴细胞中[3H]胸腺嘧啶的吸收并评价其在花粉病诊断中的应用。本发明的T细胞表位肽也可用于T细胞功能或T细胞增殖或二者的评价。当用重组DNA技术合成本发明的T细胞表位肽时，在适于宿主细胞生长的培养基上培养用含有编码该肽的序列的核酸转化的宿主细胞。该肽可用已知技术从培养上清或宿主细胞中收获。大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞都可以用作这类宿主细胞。
当将本发明的T细胞表位肽用于花粉病患者的基于肽的免疫治疗时，该肽可与可药用的稀释物或载体一同给药。此处所指的“花粉病患者”包括与日本扁柏花粉过敏原有免疫交叉反应性的雪松花粉病患者。本发明的T细胞表位肽可用简单方法，例如通过注射(皮下或静脉内)、滴注、鼻内注射、口服给药、细入或经皮给药。在注射时，单剂量的肽优选从1微克到约30毫克，更优选从约20微克到10毫克。
附图简要说明图1说明了日本扁柏花粉过敏原Chao1及每一肽的阳性指数。
图2说明了Chao1的重叠肽(#1-1到#1-28)。
图3说明了Chao1的重叠肽(#1-29到#1-35)。
图4说明了含Chao1的T细胞表位的肽。
图5说明了日本扁柏花粉过敏原Chao2的T细胞表位肽及每一肽的阳性指数。
图6说明了Chao2的重叠肽(#2-1到#2-27)。
图7说明了Chao2的重叠肽(#2-28#2-51)。
图8说明了含Chao2的T细胞表位的肽。
本发明的最佳实施方式下面将对本发明的实施例进行描述，但不应将其理解为是对本发明范围的限制。
实施例1重叠肽的合成根据日本扁柏花粉过敏原Chao1(SEQ ID NO:1)及Chao2(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。用肽合成仪(PSSM-8,ShimadzuSaisakusho Ltd.)通过Fmoc方法合成了含20个氨基酸残基(在肽#1-35(SEQID NO:37)中的14个残基及肽#2-51(SEQ ID NO:88)，每个含有10个重叠残基)的重叠肽。对Chao1制备了35种重叠肽(图1,SEQ IDNO:37)，对Chao2制备了51种(图5,SEQ ID NO:38到SEQ ID NO:88)。如此所得的肽用ODS柱高压液相色谱(HPLC)纯化。在上述肽中，其纯度为90％或更高。用LASERMAT 2000(Finnigan MAT Ltd.)鉴定纯化肽的分子量。
实施例2大肠杆菌中重组蛋白质的表达用PCR技术从质粒DNA中扩增了cDNA，该质粒中已克隆了编码日本扁柏花粉过敏原的Chao1或Chao2 cDNA(日本专利申请号Hei 6-335089)。将一个限制酶识别位点附到了每个cDNA的末端。将该DNA片段插入到组氨酸标记的蛋白质表达载体pQE9中，并将所得的载体用于转化大肠杆菌M15(pREP4)。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确证了氨苄西林抗性克隆的转化基因的表达。用Ni-NTA琼脂糖亲和柱纯化表达蛋白质。
实施例3如下建立Chao1的T细胞系。用Ficoll-Paque通过比重离心分离了用丙氨酸STAT(Nippon DPC公司)或CAP-RAST(Pharmacia)患者收集到的外周淋巴细胞。在补充以2毫升来自于同一患者的血浆(10％)或人AB型血清(20％,Banpoh Tsusho Co.,Ltd.)的RPMI 1640培养基(GIBCO,Inc.)中悬浮液淋巴细胞(2×106个细胞)。将该悬浮液与实施例2中所得的10到30微克/毫升的重组Chao1或与实施例1中所得的重叠肽(0.01到1微摩尔/升)一起在24孔板上温育3到10天(37℃,CO2恒温箱，TABAI,Inc.)。当用显微镜确证Chao1刺激所活化的T细胞时，将5单位/毫升的IL-2(Boehringer Mannheim)加到系统中，随后温育过夜。第二天，用补充以20单位/毫升IL-2,10％到20％人AB型血清的新鲜RPMI1640培养基替换原培养基。用同样方法每天替换培养基将温育持续10天。测定了该增殖T细胞系的特异性，并将部分的T细胞系冰冻冷藏。用同样方法从20个日本扁柏花粉病患者中也建立了有Chao2刺激的T细胞系。
实施例4抗原呈递细胞建立建立了用EB病毒(非洲淋巴细胞瘤病毒，EBV)感染B淋巴细胞转化来的淋巴样干细胞系(B细胞系)并用作抗原呈递细胞。首先，在补充有20％失活的肽牛血清(FCS,GIBCO Inc.)的RPMI 1640培养基上培养产EBV的B-95-8细胞(marmoset,ATCC CRL 1612)。以0.22微米无菌滤纸过滤培养物上清。将过滤物冰冻保存于-80℃。随后，将1毫升的EBV溶液加到日本扁柏花粉病患者的淋巴细胞(2×106个细胞)中，将混合物在37℃保持30分钟进行感染。将EBV感染的细胞洗涤两次，然后在补充有终浓度为200纳克/毫升的环孢菌素(Sandoz Pharmaceutical Co.,Ltd.)的20％FCS-RPMI 1640培养基中温育约20天。在以裸眼能观察到细胞团后于20％FCS-RPMI培养基上在继续培养20天。所得细胞冰冻保存待用。
实施例5T细胞表位肽的建立用50微克/毫升丝裂霉素C(Sandoz Pharmaceutical Co.,Ltd.)将实施例中所建立的B细胞培养系处理30分钟或以X光曝光(50g ray)，然后以RPMI 1640培养基洗涤4次。将B细胞接种到96孔板(10000个细胞/孔)后，在其中加入终浓度为10微克/毫升的Chao1和Chao2。对照组中加入终浓度为10微克/毫升的溶血链球菌细胞壁抗原(SCW)，终浓度为10微克/毫升的白色假丝酵母抗原(CA)，以及终浓度为1微克/毫升的结核菌素抗原(PPD)。接着，将来自于已建立了其细胞系的相同患者的T细胞系(20000个细胞/孔)接种到每个孔中。温育48小时后，在每孔中加入0.5微居里[3H]胸腺嘧啶并继续培养16小时。用细胞收集器(Berthold)在玻璃滤纸上收集细胞后，通过液闪计数器测定细胞[3H]胸腺嘧啶的吸收来确证细胞的生长反应。
当确证T细胞具有对Chao1和Chao2的特异性增殖后，用实施例3中建立的T细胞系通过与上述相同的方法测定了T细胞系对每种重叠肽(终浓度为1微摩尔/升)的生长反应。图1和图5中表明了T细胞系对重叠肽的生长反应的平均刺激指数、出现频率及如此计算所得的阳性指数。
而且，测定了T细胞系(N=17)对相应于氨基酸序列#2-11和其中有一个氨基酸残基取代的#2-12的修饰序列(SEQID NO:89和SEQ IDNO:90)的生长反应。这两个修饰序列的刺激活性用刺激指数表示时是1.6和1.2，用出现频率表示时是16％和11％，用阳性指数表示时是25.6和13.2。如上所述，即使有一个或多个氨基酸残基的突变，本发明的T细胞表位肽仍然保持了其T细胞刺激活性，在某些情况下其活性还有增加。
工业实用性本发明的肽含有Chao1或Chao2的至少一个T细胞表位肽，Chao1和Chao2是日本扁柏花粉的主要过敏原。本发明还进一步包括一种与该肽有免疫T细胞交叉反应性的其它树木花粉的肽片段。这些肽在用于春天由以雪松和日本扁柏花粉为代表的树木花粉引起的花粉病的基于肽的免疫治疗是有效的。序列表SEQ ID NO:1:序列长度354序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型蛋白质序列描述Asp Asn Pro Ile Asp Ser Cys Trp Arg Gly Asp Ala Asn Trp Asp Gln5 10 15Asn Arg Met Lys Leu Ala Asp Cys Ala Val Gly Phe Gly Ser Ser Ala20 25 30Met Gly Gly Lys Gly Gly Ala Phe Tyr Thr Val Thr Ser Ser Asp Asp35 40 45Asp Pro Val Asn Pro Ala Pro Gly Thr Leu Arg Tyr Gly Ala Thr Arg50 55 60Glu Arg Ser Leu Trp Ile Ile Phe Ser Lys Asn Leu Asn Ile Lys Leu65 70 75 80Asn Met Pro Leu Tyr Ile Ala Gly Asn Lys Thr Ile Asp Gly Arg Gly85 90 95Ala Glu Val His Ile Gly Asn Gly Gly Pro Cys Leu Phe Met Arg Thr100 105 110Val Ser His Val Ile Leu His Gly Leu Asn Ile His Gly Cys Asn Thr115 120 125Ser Val Ser Gly Asn Val Leu Ile Ser Glu Ala Ser Gly Val Val Pro130 135 140Val His Ala Gln Asp Gly Asp Ala Ile Thr Met Arg Asn Val Thr Asp145 150 155 160Val Trp Ile Asp His Asn Ser Leu Ser Asp Ser Ser Asp Gly Leu Val165 170 175Asp Val Thr Leu Ala Ser Thr Gly Val Thr Ile Ser Asn Asn His Phe180 185 190Phe Asn His His Lys Val Met Leu Leu Gly His Ser Asp Ile Tyr Ser195 200 205Asp Asp Lys Ser Met Lys Val Thr Val Ala Phe Asn Gln Phe Gly Pro210 215 220Asn Ala Gly Gln Arg Met Pro Arg Ala Arg Tyr Gly Leu Ile His Val225 230 235 240Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Trp Ser Ile Tyr Ala Ile Gly Gly Ser245 250 255Ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser Glu Gly Asn Ser Phe Thr Ala Pro Asn260 265 270Asp Ser Asp Lys Lys Glu Val Thr Arg Arg Val Gly Cys Glu Ser Pro275 280 285Ser Thr Cys Ala Asn Trp Val Trp Arg Ser Thr Gln Asp Ser Phe Asn290 295 300Asn Gly Ala Tyr Phe Val Ser Ser Gly Lys Asn Glu Gly Thr Asn Ile305 310 315 320Tyr Asn Asn Asn Glu Ala Phe Lys Val Glu Asn Gly Ser Ala Ala Pro325 330 335Gln Leu Thr Lys Asn Ala Gly Val Leu Thr Cys Ile Leu Ser Lys Pro340 345 350Cys SerSEQ ID NO:2:序列长度514序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型蛋白质序列描述Met Gly Met Lys Phe Met Ala Ala Val Ala Phe Leu Ala Leu Gln Leu5 10 15Ile Val Met Ala Ala Ala Glu Asp Gln Ser Ala Gln Ile Met Leu Asp20 25 30Ser Asp Ile Glu Gln Tyr Leu Arg Ser Asn Arg Ser Leu Lys Lys Leu35 40 45Val His Ser Arg His Asp Ala Ala Thr Val Phe Asn Val Glu Gln Tyr50 55 60Gly Ala Val Gly Asp Gly Lys His Asp Ser Thr Glu Ala Phe Ala Thr65 70 75 80Thr Trp Asn Ala Ala Cys Lys Lys Ala Ser Ala Val Leu Leu Val Pro85 90 95Ala Asn Lys Lys Phe Phe Val Asn Asn Leu Val Phe Arg Gly Pro Cys100 105 110Gln Pro His Leu Ser Phe Lys Val Asp Gly Thr Ile Val Ala Gln Pro115 120 125Asp Pro Ala Arg Trp Lys Asn Ser Lys Ile Trp Leu Gln Phe Ala Gln130 135 140Leu Thr Asp Phe Asn Leu Met Gly Thr Gly Val Ile Asp Gly Gln Gly145 150 155 160Gln Gln Trp Trp Ala Gly Gln Cys Lys Val Val Asn Gly Arg Thr Val165 170 175Cys Asn Asp Arg Asn Arg Pro Thr Ala Ile Lys Ile Asp Tyr Ser Lys180 185 190Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Thr Leu Met Asn Ser Pro Glu Phe His195 200 205Leu Val Phe Gly Glu Cys Glu Gly Val Lys Ile Gln Gly Leu Lys Ile210 215 220Lys Ala Pro Arg Asp Ser Pro Asn Thr Asp Gly Ile Asp Ile Phe Ala225 230 235 240Ser Lys Arg Phe His Ile Glu Lys 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Ile450 455 460Ser Leu Ser Ser Ser Pro Pro Asn Cys Lys Asn Lys Cys Lys Gly Cys465 470 475 480Gln Pro Cys Lys Pro Lys Leu Ile Ile Val His Pro Asn Lys Pro Gln485 490 495Asp Tyr Tyr Pro Gln Lys Trp Val Cys Ser Cys His Asn Lys Ile Tyr500 505 510Asn ProSEQ ID NO:3:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Asp Asn Pro Ile Asp Ser Cys Trp Arg Gly Asp Ala Asn Trp Asp Gln1 5 10 15Asn Arg Met Lys20SEQ ID NO:4:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Asp Ala Asn Trp Asp Gln Asn Arg Met Lys Leu Ala Asp Cys Ala Val1 5 10 15Gly Phe Gly Ser20SEQ ID NO:5:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Leu Ala Asp Cys Ala Val Gly Phe Gly Ser Ser Ala Met Gly Gly Lys1 5 10 15Gly Gly Ala Phe20SEQ ID NO:6:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ser Ala Met Gly Gly Lys Gly Gly Ala Phe Tyr Thr Val Thr Ser Ser1 5 10 15Asp Asp Asp Pro20SEQ ID NO:7:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Tyr Thr Val Thr Ser Ser Asp Asp Asp Pro Val Asn Pro Ala Pro Gly1 5 10 15Thr Leu Arg Tyr20SEQ ID NO:8:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Val Asn Pro Ala Pro Gly Thr Leu Arg Tyr Gly Ala Thr Arg Glu Arg1 5 10 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Gly Val Val Pro Val His1 5 10 15Ala Gln Asp Gly20SEQ ID NO:17:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Gly Val Val Pro Val His Ala Gln Asp Gly Asp Ala Ile Thr Met Arg1 5 10 15Asn Val Thr Asp20SEQ ID NO:18:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Asp Ala Ile Thr Met Arg Asn Val Thr Asp Val Trp Ile Asp His Asn15 10 15Ser Leu Ser Asp20SEQ ID NO:19:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Val Trp Ile Asp His Asn Ser Leu Ser Asp Ser Ser Asp Gly Leu Val1 5 10 15Asp Val Thr Leu20SEQ ID NO:20:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ser Ser Asp Gly Leu Val Asp Val Thr Leu Ala Ser Thr Gly Val Thr1 5 10 15Ile Ser Asn Asn20SEQ ID NO:21:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ala Ser Thr Gly Val Thr Ile Ser Asn Asn His Phe Phe Asn His His1 5 10 15Lys Val Met Leu20SEQ ID NO:22:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述His Phe Phe Asn His His Lys Val Met Leu Leu Gly His Ser Asp Ile1 5 10 15Tyr Ser Asp Asp20SEQ ID NO:23:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Leu Gly Mis Ser Asp Ile Tyr Ser Asp Asp Lys Ser Met Lys Val Thr1 5 10 15Val Ala Phe Asn20SEQ ID NO:24:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Lys Ser Met Lys Val Thr Val Ala Phe Asn Gln Phe Gly Pro Asn Ala1 5 10 15Gly Gln Arg Met20SEQ ID NO:25:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Gln Phe Gly Pro Asn Ala Gly Gln Arg Met Pro Arg Ala Arg Tyr Gly1 5 10 15Leu Ile His Val20SEQ ID NO:26:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Pro Arg Ala Arg Tyr Gly Leu Ile His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp1 5 10 15Pro Trp Ser Ile20SEQ ID NO:27:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Trp Ser Ile Tyr Ala Ile Gly Gly Ser1 5 10 15Ser Asn Pro Thr20SEQ ID NO:28:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Tyr Ala Ile Gly Gly Ser Ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser Glu Gly Asn1 5 10 15Ser Phe Thr Ala20SEQ ID NO:29:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ile Leu Ser Glu Gly Asn Ser Phe Thr Ala Pro Asn Asp Ser Asp Lys1 5 10 15Lys Glu Val Thr20SEQ ID NO:30:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Pro Asn Asp Ser Asp Lys Lys Glu Val Thr Arg Arg Val Gly Cys Glu1 5 10 15Ser Pro Ser Thr20SEQ ID NO:31:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Arg Arg Val Gly Cys Glu Ser Pro Ser Thr Cys Ala Asn Trp Val Trp1 5 10 15Arg Ser Thr Gln20SEQ ID NO:32:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Cys Ala Asn Trp Val Trp Arg Ser Thr Gln Asp Ser Phe Asn Asn Gly1 5 10 15Ala Tyr Phe Val20SEQID NO:33:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Asp Ser Phe Asn Asn Gly Ala Tyr Phe Val Ser Ser Gly Lys Asn Glu1 5 10 15Gly Thr Asn Ile20SEQ ID NO:34:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ser Ser Gly Lys Asn Glu Gly Thr Asn Ile Tyr Asn Asn Asn Glu Ala1 5 10 15Phe Lys Val Glu20SEQ ID NO:35:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Tyr Asn Asn Asn Glu Ala Phe Lys Val Glu Asn Gly Ser Ala Ala Pro1 5 10 15Gln Leu Thr Lys20SEQ ID NO:36:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Asn Gly Ser Ala Ala Pro Gln Leu Thr Lys Asn Ala Gly Val Leu Thr1 5 10 15Cys Ile Leu Ser20SEQ ID NO:37:序列长度14序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Asn Ala Gly Val Leu Thr Cys Ile Leu Ser Lys Pro Cys Ser1 5 10SEQ ID NO:38:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Met Gly Met Lys Phe Met Ala Ala Val Ala Phe Leu Ala Leu Gln Leu1 5 10 15Ile Val Met Ala20SEQ ID NO:39:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Phe Leu Ala Leu Gln Leu Ile Val Met Ala Ala Ala Glu Asp Gln Set1 5 10 15Ala Gln Ile Met20SEQ ID NO:40:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ala Ala Glu Asp Gln Ser Ala Gln Ile Met Leu Asp Ser Asp Ile Glu1 5 10 15Gln Tyr Leu Arg20SEQ ID NO:41:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Leu Asp Ser Asp Ile Glu Gln Tyr Leu Arg Ser Asn Arg Ser Leu Lys1 5 10 15Lys Leu Val His20SEQ ID NO:42:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ser Asn Arg Ser Leu Lys Lys Leu Val His Ser Arg His Asp Ala Ala1 5 10 15Thr Val Phe Asn20SEQ ID NO:43:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ser Arg His Asp Ala Ala Thr Val Phe Asn Val Glu Gln Tyr Gly Ala1 5 10 15Val Gly Asp Gly20SEQ ID NO:44:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Val Glu Gln Tyr Gly Ala Val Gly Asp Gly Lys His Asp Ser Thr Glu1 5 10 15Ala Phe Ala Thr20SEQ ID NO:45:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Lys His Asp Ser Thr Glu Ala Phe Ala Thr Thr Trp Asn Ala Ala Cys1 5 10 15Lys Lys Ala Ser20SEQ ID NO:46:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Thr Trp Asn Ala Ala Cys Lys Lys Ala Ser Ala Val Leu Leu Val Pro1 5 10 15Ala Asn Lys Lys20SEQID NO:47:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ala Val Leu Leu Val Pro Ala Asn Lys Lys Phe Phe Val Asn Asn Leu1 5 10 15Val Phe Arg Gly20SEQ ID NO:48:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Phe Phe Val Ash Asn Leu Val Phe Arg Gly Pro Cys Gln Pro His Leu1 5 10 15Ser Phe Lys Val20SEQ ID NO:49:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Pro Cys Gln Pro His Leu Ser Phe Lys Val Asp Gly Thr Ile Val Ala1 5 10 15Gln Pro Asp Pro20SEQ ID NO:50:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Asp Gly Thr Ile Val Ala Gln Pro Asp Pro Ala Arg Trp Lys Asn Ser1 5 10 15Lys Ile Trp Leu20SEQ ID NO:51:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ala Arg Trp Lys Asn Ser Lys Ile Trp Leu Gln Phe Ala Gln Leu Thr1 5 10 15Asp Phe Asn Leu20SEQ ID NO:52:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Gln Phe Ala Gln Leu Thr Asp Phe Asn Leu Met Gly Thr Gly Val Ile1 5 10 15Asp Gly Gln Gly20SEQ ID NO:53:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Met Gly Thr Gly Val Ile Asp Gly Gln Gly Gln Gln Trp Trp Ala Gly1 5 10 15Gln Cys Lys Val20SEQ ID NO:54:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Gln Gln Trp Trp Ala Gly Gln Cys Lys Val Val Asn Gly Arg Thr Val1 5 10 15Cys Asn Asp Arg20SEQ ID NO:55:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Val Asn Gly Arg Thr Val Cys Asn Asp Arg Asn Arg Pro Thr Ale Ile1 5 10 15Lys Ile Asp Tyr20SEQ ID NO:56:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Asn Arg Pro Thr Ala Ile Lys Ile Asp Tyr Ser Lys Ser Val Thr Val1 5 10 15Lys Glu Leu Thr20EQ ID NO:57:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ser Lys Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Thr Leu Met Asn Ser Pro Glu1 5 10 15Phe His Leu Val20SEQ ID NO:58:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Leu Met Asn Ser Pro Glu Phe His Leu Val Phe Gly Glu Cys Glu Gly1 5 10 15Val Lys Ile Gln20SEQID NO:59:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Phe Gly Glu Cys Glu Gly Val Lys Ile Gln Gly Leu Lys Ile Lys Ala1 5 10 15Pro Arg Asp Ser20SEQ ID NO:60:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Gly Leu Lys Ile Lys Ala Pro Arg Asp Ser Pro Asn Thr Asp Gly Ile1 5 10 15Asp Ile Phe Ala20SEQ ID NO:61:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Pro Asn Thr Asp Gly Ile Asp Ile Phe Ala Ser Lys Arg Phe His Ile1 5 10 15Glu Lys Cys Val20SEQ ID NO:62:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ser Lys Arg Phe His Ile Glu Lys Cys Val Ile Gly Thr Gly Asp Asp1 5 10 15Cys Ile Ala Ile20SEQ ID 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5 10 15Glu Asn Pro Ile20SEQ ID NO:71:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Val Glu Met Ile Asn Ser Glu Asn Pro Ile Leu Ile Asn Gln Phe Tyr1 5 10 15Cys Thr Ser Ala20SEQ ID NO:72:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Leu Ile Asn Gln Phe Tyr Cys Thr Ser Ala Ser Ala Cys Gln Asn Gln1 5 10 15Arg Ser Ala Val20SEQ ID NO:73:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ser Ala Cys Gln Asn Gln Arg Ser Ala Val Gln Ile Gln Gly Val Thr1 5 10 15Tyr Lys Asn Ile20SEQ ID NO:74:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Gln Ile Gln Gly Val Thr Tyr Lys Asn Ile His Gly Thr Ser Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Ala Ile20SEQ ID NO:75:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述His Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ala Ile Gln Leu Met Cys Ser Asp1 5 10 15Ser Val Pro Cys20SEQ ID NO:76:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Gln Leu Met Cys Ser Asp Ser Val Pro Cys Thr Gly Ile Gln Leu Ser1 5 10 15Asn Val Ser Leu20SEQ ID NO:77:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Thr Gly Ile Gln Leu Ser Asn Val Ser Leu Lys Leu Thr Ser Gly Lys1 5 10 15Pro Ala Ser Cys20SEQ ID NO:78:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Lys Leu Thr Ser Gly Lys Pro Ala Ser Cys Val Asp Lys Asn Ala Arg1 5 10 15Gly Phe Tyr Ser20SEQ ID NO:79:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Val Asp Lys Asn Ala Arg Gly Phe Tyr Ser Gly Arg Leu Ile Pro Thr1 5 10 15Cys Lys Asn Leu20SEO ID NO:80:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Gly Arg Leu Ile Pro Thr Cys Lys Asn Leu Arg Pro Gly Pro Ser Pro1 5 10 15Lys Glu Pue Glu20SEQ ID NO:8l:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Arg Pro Gly Pro Ser Pro Lys Glu Phe Glu Leu Gln Gln Gln Pro Thr1 5 10 15Thr Val Met Asp20SEQ ID NO:82:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Leu Gln Gln Gln Pro Thr Thr Val Met Asp Glu Asn Lys Gly Ala Cys1 5 10 15Ala Lys Gly Asp20SEQ ID NO:83:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Glu Asn Lys Gly Ala Cys Ala Lys Gly Asp Ser Thr Cys Ile Ser Leu1 5 10 15Ser Ser Ser Pro20SEQ ID NO:84:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Ser Thr Cys Ile Ser Leu Ser Ser Ser Pro Pro Asn Cys Lys Asn Lys1 5 10 15Cys Lys Gly Cys20SEQ ID NO:85:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Pro Asn Cys Lys Asn Lys Cys Lys Gly Cys Gln Pro Cys Lys Pro Lys1 5 10 15Leu Ile Ile Val20SEQ ID NO:86:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Gln Pro Cys Lys Pro Lys Leu Ile Ile Val His Pro Asn Lys Pro Gln1 5 10 15Asp Tyr Tyr Pro20SEQ ID NO:87:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述His Pro Asn Lys Pro Gln Asp Tyr Tyr Pro Gln Lys Trp Val Cys Ser1 5 10 15Cys His Asn Lys20SEQ ID NO:88:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Gln Lys Trp Val Cys Ser Cys His Asn Lys Ile Tyr Asn Pro1 5 10SEQ ID NO:89:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Phe Phe Val Asn Asn Leu Val Phe Arg Gly Pro Cys Gln Pro His Leu1 5 10 15Pro Phe Lys Val20SEQ ID NO:90:序列长度20序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列描述Pro Cys Gln Pro His Leu Pro Phe Lys Val Asp Gly Thr Ile Val Ala1 5 10 15Gln Pro Asp Pro20
权利要求
1．包含日本扁柏花粉过敏原Cha o1的至少一种T细胞表位肽并具有选自如图4所示的下列某一肽的氨基酸序列或所说氨基酸序列的一部分的肽，这些肽包括肽#1-2(SEQ ID NO:4)，肽#1-4(SEQ ID NO:6)，肽#1-5(SEQ ID NO:7)，肽#1-6(SEQ ID NO:8)，肽#1-7(SEQID NO:9)，肽#1-8(SEQ ID NO:10)，肽#1-10(SEQ ID NO:12)，肽#1-11(SEQ ID NO:13)，肽#1-12(SEQ ID NO:14)，肽#1-14(SEQ ID NO:16)，肽#1-15(SEQ ID NO:17)，肽#1-16(SEQID NO:18)，肽#1-19(SEQ ID NO:21)，肽#1-20(SEQID NO:22)，肽#1-21(SEQ ID NO:23)，肽#1-22(SEQ ID NO:24)，肽#1-23(SEQ ID NO:25)，肽#1-24(SEQ ID NO:26)，肽#1-25(SEQID NO:27)，肽#1-26(SEQ ID NO:28)，肽#1-27(SEQ ID NO:29)，肽#1-30(SEQ ID NO:32)，肽#1-31(SEQ ID NO:33)，肽#1-32(SEQ ID NO:34)，肽#1-33(SEQ ID NO:35)，以及肽#1-34(SEQ ID NO:36)。
2．包含日本扁柏花粉过敏原Chao2的至少一种T细胞表位肽并具有选自如图4所示的下列某一肽的氨基酸序列或所说氨基酸序列的一部分的肽，这些肽包括#2-5(SEQ ID NO:42)，肽#2-7(SEQ ID NO:44)，肽#2-8(SEQ ID NO:45)，肽#2-9(SEQ ID NO:46)，肽#2-10(SEQID NO:47)，肽#2-11(SEQ ID NO:48)，肽#2-12(SEQ ID NO:49)，肽#2-13(SEQ ID NO:50)，肽#2-14(SEQ ID NO:51)，肽#2-15(SEQID NO:52)，肽#2-16(SEQ ID NO:53)，肽#2-17(SEQID NO:54)，肽#2-18(SEQ ID NO:55)，肽#2-19(SEQ ID NO:56)，肽#2-20(SEQ ID NO:57)，肽#2-21(SEQ ID NO:58)，肽#2-22(SEQ ID NO:59)，肽#2-23(SEQ ID NO:60)，肽#2-24(SEQID NO:61)，肽#2-25(SEQ ID NO:62)，肽#2-26(SEQ ID NO:63)，肽#2-27(SEQ ID NO:64)，肽#1-2(SEQ ID NO:65)，肽#2-30(SEQ ID NO:67)，肽#2-31(SEQ ID NO:68)，肽#2-32(SEQID NO:69)，肽#2-33(SEQ ID NO:70)，肽#2-34(SEQ ID NO:71)，肽#2-35(SEQ ID NO:72)，肽#2-36(SEQ ID NO:73)，肽#2-37(SEQID NO:74)，肽#2-38(SEQ ID NO:75)，肽#2-40(SEQID NO:77)，肽#2-41(SEQ ID NO:78)，肽#2-42(SEQ ID NO:79)，和肽#2-43(SEQ ID NO:80)。
3．权利要求1或2中所说的肽，其中所说的肽包含至少两个T细胞表位。
4．对春天由树木花粉引起的花粉病患者的T细胞具有刺激和/或抑制效应并具有经取代、缺失或插入修饰的权利要求1或2中所述的氨基酸序列的肽。
5．用于由春天因树木花粉引起的花粉病的基于肽的免疫治疗的组合物，包括作为有效成分的权利要求1到4中的任一项的肽。
6．将权利要求1到4中任一项的肽用于制备春天由树木花粉引起的花粉病的基于肽的免疫治疗组合物的用途。
7．用于治疗和预防春天由树木花粉引起的花粉病的方法，包括用权利要求1到4中任一项的肽进行给药。
8．用于诊断春天由树木花粉引起的花粉病的试剂，包括作为有效成分的权利要求1到4中的任一项的肽。
9．将权利要求1到4中任一项的肽用于制备诊断春天由树木花粉引起的花粉病的试剂的用途。
10．用于诊断春天由树木花粉引起的花粉病的方法，包括用权利要求1到4中任一项的肽进行给药。
全文摘要
用覆盖日本扁柏花粉过敏源一级结构的重叠肽对来自患日本扁柏(hinoki)花粉过敏源过敏的患者的T细胞系进行刺激从而鉴定了日本扁柏花粉过敏源的T细胞表位位点。该肽可用于春天的树木花粉病包括与日本扁柏花粉有交叉反应活性的日本扁柏花粉病的免疫治疗和诊断。
文档编号C07K14/415GK1227566SQ97197087
公开日1999年9月1日 申请日期1997年6月12日 优先权日1996年6月14日
发明者纪光助, 大力一雄 申请人:明治乳业株式会社