专利名称：一种预防奶牛乳腺炎的核酸疫苗PV-Fn的设计及其构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中的疫苗及其构建方法，尤其是涉及FnBPA分子为靶标的DNA疫苗及其构建方法。更具体地说，本发明涉及抗奶牛乳腺炎的核酸疫苗和编码该疫苗的粘附素分子的特定核苷酸序列，抗原表位和表达方式。
背景技术：
由金黄色葡萄球菌引发的奶牛乳腺炎在世界范围内都造成了巨大的损失。截止2011年我国奶牛存栏头数1300万头，毎年由乳腺炎造成的经济损失可达40亿元。近些年来，抗生素的大量使用甚至滥用，使金黄色葡菌球菌的抗菌谱逐渐扩大，给临床治疗和预防金黄色葡菌球菌乳腺炎提出了新的挑战。目前认为疫苗是防控金黄色葡菌球菌感染的有效方法。 迄今金黄色葡萄球菌疫苗研制经历了全菌灭活苗、亚单位疫苗和DNA疫苗3次重大变革。1902年，Wright将体外培养的金黄色葡萄球菌全菌灭活，制成灭活苗免疫牛，结果免疫效果不理想，不能有效抵抗新的感染发生(赫娜，杨宏军，王长法等.奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌疫苗研究进展.动物医学进展，2009，30 (I) :93-96.)林峰强等(林峰强，胡松华，胡奇林等.奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎菌苗佐剂研究现状.动物医学进展，2004，25(6) 49-51.)针对灭活苗的不足研制出了针对金黄色葡萄球菌单ー成分的亚单位疫苗。目前，部分亚单位疫苗已应用于生产中，如在美国获准使用的Soma-to-Staph和Lysigin 2种金黄色葡萄球菌疫苗及大肠杆菌J5菌苗均是基因工程亚单位疫苗。目前，在奶牛乳腺炎疫苗的研制方面，国内起步较晩。金黄色葡萄球菌黏附素纤连蛋白结合蛋白A(FnbpA)是细菌感染的先决条件(周宏，李韩平.金黄色葡萄球菌表面蛋白研究进展.生物技术通讯，2004，15 (I) :73-75.)，抑制其活性后可从根源上切断金黄色葡萄球菌感染的途径。几乎所有的金黄色葡萄球菌都拥有FnbpA基因，都可以表达纤连蛋白结合蛋白A，此蛋白由于具有与宿主组织的特异黏附能力，正成为抗金黄色葡萄球菌感染疫苗开发的热点分子。国内研制的FnBPA重组蛋白疫苗疫苗首免后7d，在免疫组小鼠血清中即可检测到抗体，而且随着免疫时间的延长，抗体效价呈明显的上升趋势，在21d达到最高水平，之后抗体水平逐渐降低。通过对小鼠的免疫攻毒试验可知，FnBPA基因工程亚单位疫苗可有效提高小鼠的抗体水平，免疫保护指数PI达80%，说明疫苗对金黄色葡萄球菌具有较强的免疫保护力。(张海燕，杨宏军，王长法等.重组金黄色葡萄球菌FnbpA亚单位疫苗的研制.西北农林科技大学学报.2011，5 (39) :39-43.)。虽然基因工程亚单位疫苗具有抗原剂量大、纯度高且无遗传物质及宿主和培养基的成分等优点(张延龄，张晖.疫苗学.北京科学出版社2004 :345-377,421-504.)。此外基因工程亚单位疫苗诱导大动物的免疫应答持续时间短，且大动物的免疫成本高。为克服这些缺点，我们选择了针对FnBPA的核酸疫苗。核酸疫苗又称基因疫苗、DNA疫苗，是把外源基因克隆到质粒或病毒载体上，用重组质粒或病毒DNA直接免疫，使外源基因在活体内以天然蛋白的形式呈递抗原，激活机体免疫系统，井能持续的引发免疫反应。其无毒性返祖现象，对病毒变异株也起作用。因此DNA疫苗是近年来备受人们关注的ー种新型疫苗。Nour等研制了 CTLA4和ClfA的重组核酸疫苗并采用了共聚物阳离子包装先用核酸疫苗免疫奶牛2次，3个月后再用200 μ g的ClfA重组蛋白加强免疫一次，免疫牛产生了较强的体液免疫及细胞免疫反应(Adel NM Nour Eldin, Lulzim Shkreta, Br IanG Talbot，et a. I DNA imunization of dairy cows with the clumping factor A ofStaphylococcus aureus. Vaccine，2006，24 :1997-2006.)。国外已有基于 FnBP 的黏附机制来研制金黄色葡萄球菌DNA疫苗的报道。目前FnBP分子结构中的D区被称作配体結合区，被认为是主要的免疫优势表位，在目前研制的金黄色葡萄球菌核酸疫苗中占有重要的作用。发明目的研究证实，不同来源的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌产生的黏附素有一定差异。而且不同地区流行的菌株所产生的黏附素有一定差异。目前国内有关粘附素分子FnBPA的疫苗大多为亚单位疫苗，且抗原表位多针对配体结合区D区设计。因此为克服不同 来源菌株粘附素分子的差异，并且也为克服亚单位疫苗免疫应答持续时间短，且制作的成本高的缺点，本发明以FnBPA为免疫靶标，且抗原表位主要针对配体结合区A区及B区的序列设计的奶牛乳腺炎核酸疫苗。
发明内容
(I)本发明的目的之ー是提供了ー种核酸疫苗的设计以克服亚单位疫苗的不足。(2)为解决上述的技术问题，本发明采取了以下技术方案在抗原表位的选择上选择了本地区流行株FnBPA基因的A区和B区，克服了不同来源的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌产生的粘附附素对本地疾病的免疫造成的差异。(3)所述的免疫靶基因位于真核表达载体PVAX-I中，此外还包括所有能在真核细胞中表达的载体pcDNA3. 1，pEGFP-Nl, pLXSN等载体。(4)本发明的第二个目的是提供一种本发明预防奶牛乳腺炎的核酸疫苗PVAX-Fn的设计及其构建方法。(5)本发明预防奶牛乳腺炎核酸疫苗PVAX-Fn的设计及其构建方法，可包括以下步骤(A)用引物 koF5，CGG GAT CCG GAA ATG GCT AAC GTT AAT CAT AT 3，，koR5，GCGCTC GAG CTA TTC AAT GTA TCC GTC AAC 3’。将 Kozak 序列与我们所选择的 FnBPA 基因的优势抗原表位相连接；(B)再将此连接好的基因片段连接到真核表达载体BamH I和Xhol I中；(C)在此以PVAX-I为出发载体。(6)本发明以上技术方案提供了一种以金黄色葡萄球菌FnBPA基因为靶标的核酸疫苗的设计和构建方法。本发明的特点可总结为该疫苗是针对当地流行菌株的抗原特点和分子流行特点而设计，免疫的抗原表位的选择不同于其他的研究，选择了 FnBPA基因的A区及B区的部分序列作为抗原表位，使用更为有效；该设计可增加疫苗DNA编码序列在抗原提呈细胞中的表达水平，能够较快的建立起免疫保护机制并具有长期而有效的保护作用，提高DNA疫苗的免疫活性。本发明在奶牛乳腺炎防治中新型疫苗的研制与开发方面发挥重要的作用，应用前景广阔。发明效果(I)本发明与亚单位疫苗相比，制作简单且成本降低。(2)本发明中将Kozak序列与抗原表位相连可增加抗原在细胞内的表达水平。(3)本发明与亚单位疫苗相比免疫应答持续时间长，可达3个月以上。(4)免疫后3个月攻毒保护效果可达66 %。(5)免疫表位的设计不同于以往的表位选择，考虑了不同地区菌株存在的抗原多态性和对免疫的影响，选择了地区流行株且抗原表位位于FnBPA的A区及B区，该抗原表位的选择可克服不同来源的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌产生的粘附素差异造成的免疫失败。
图I是FnBPA基因的PCR扩增结果的电泳图，获得得本地流行菌株的基因组DNA，并用PCR方法扩增FnBPA基因，可在1500bp处见到目的条带。图2是克隆的FnBPA基因序列同源性分析比较结果图，序列分析比较的结果表明(图2)我们选择的FnBPA基因在本地分离株高度同源(> 94% )，与其他地区和国家流行菌株的核苷酸除了(CP002114)タト，同源性多在77. 7% -82%，这表明我们选择的FnBPA基因具有自身独特的序列特异性。图3是PV-FnBPA重组质粒的酶切鉴定图，重组质粒构建完成后，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，进行双酶切鉴定。结果获得1500bp左右的片段，与预期结果相符，提示上述抗原表位已连接到表达载体上。图4是PV-FnBPA所用的载体图，FnBPA目的片段与该载体连接。图5是BHK-21细胞表达的目的蛋白的Western Blot分析图,Western Blot实验结果表明，所构建的重组质粒转染BHK-21细胞后可以表达目的蛋白，大小约为66kD，且表达的重组目的蛋白能够和抗FnBPA的高免血清发生特异性反应。图6是实验动物免疫后体液免疫的检测，免疫后不同时间采集的血清经100倍稀释后做一抗分别作ELISA检测，0D450nm读数，以空载体和PBS注射组做对照。我们研究的结果表明I免后(P < O. 01)及2免后(P < O. 001)粘附素分子FnbpA DNA疫苗免疫组(PVFn)诱导的抗体水平与对照组相比差异极显著。图7是实验动物免疫后细胞免疫的检测，ニ免90天后，对脾脏T淋巴细胞的MTT实验检测所得的刺激指数(stimulation index, SI)。MTT实验的结果显示PV-SGFn比空载体组和空白对照组更能刺激机体的细胞免疫水平。统计分析表明PV-SGFn与空载体组和空白对照组差异显著。
实施例构建奶牛乳腺炎FnBPA基因的真核表达载体(I)获得本地流行菌株的基因组DNA，并用PCR方法扩增FnBPA基因(图I)。 (2)筛选具有良好免疫原性和抗原多样性FnBPA基因的优势表位，FnBPA基因的A区及B区的部分基因，作为DNA疫苗的候选序列。
(3)序列分析比较的结果表明(图2)我们选择的FnBPA基因在本地分离株高度同源(> 94%)，与其他地区和国家流行菌株的核苷酸除了(CP002114)タト，同源性多在77. 7% -82%，这表明我们选择的FnBPA基因具有自身独特的序列特异性。(4)通过PCR反应将FnBPA基因优势表位基因与Kozak序列连接。(所用引物koF5’ CGG GAT CCG GAA ATG GCT AAC GTT AAT CAT AT 3’， koR5’ GCG CTC GAG CTA TTCAAT GTA TCC GTC AAC 3’)。(5)将连接好的片段引入PVAX-I真核表达载体(图4)。(6)构建完成后，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，进行PCR鉴定(引物序列为F5’ATGGCT AACGTT AAT CAT AT 3，，R5，AAT GTA TCC GTC AAC 3’)。结果获得 1500bp 左右的片段，与预期结果相符，提示上述抗原表位已连接到表达载体上(图3)。同时将重组的载体送去测序，以验证序列。
鉴定好的阳性克隆用质粒大提试剂盒提取质粒，检测质粒的浓度及纯度。重组质粒体外表达的检测收集的转染后48h左右的细胞与5 X SDS loading buffer混合煮沸处理，空载体作为阴性对照SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转膜。一抗浓度I : 80037°C孵育2h，用PBST洗膜5次，将I : 500稀释的HRP标记羊抗兔IgG 37°C温育lh，PBST洗膜5次，DAB显色液显色3min,观察结果。Western Blot实验结果表明(图5)，所构建的重组质粒转染BHK-21细胞后可以表达目的蛋白，大小约为66kD，且表达的重组目的蛋白能够和抗FnBPA的高免血清发生特异性反应。实验动物免疫后体液免疫的检测(I)免疫前及姆次免疫后2周后对免疫小鼠进行断尾采血,分离血清。用间接ELISA方法检测免疫前及各免后血清中抗体滴度。将FnBPA纯化蛋白用PH = 9. 6的碳酸钠缓冲液4°C进行过夜包被。对鼠血清进行不同浓度稀释初始100倍稀释，随后倍比稀释。将不同稀释度的血清做ー抗37°C温育2h。将羊抗鼠HRP标记的ニ抗I : 4000稀释，37°C温育Ih后，洗涤、显色、终止，0D450nm读数。(2)免疫后不同时间采集的血清经100倍稀释后做一抗分别作ELISA检测，0D450nm读数，以空载体和PBS注射组做对照。结果如图6。我们研究的结果表明I免后(P< O. 01)及2免后(P < O. 001)粘附素分子FnbpA DNA疫苗免疫组(PVFn)诱导的抗体水平与对照组相比差异极显著。实验动物免疫后细胞免疫的检测(I)无菌摘取ニ免一个月后的小鼠脾脏，经200目筛网研磨后，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，用Dhanks液3000r/min, 4°C洗漆两次后,用细胞计数板对姆个样品进行细胞计数后，用含有10%胎牛血清的1640培养液稀释到2. 5X IO4个数量级。在96孔细胞培养板上每孔加IOOuL淋巴细胞稀释液，每个样品重复4孔，实验组加入40 μ L刀豆蛋白A (ConA, 10 μ g/mL)同时对照组加入等量的1640培养液，另每孔加140 μ 1640培养液设纯空白组，培养48小时后加入100uLMTT(10y g/ml)试剂。继续培养4_6小时，加入150 μ LDMSO終止，轻轻震动使不溶于水的紫色结晶彻底溶解后OD57tl读数。按以下公式计算刺激指数(stimulation index, SI)=(阳性 OD 值-空白 OD 值)/(细胞 OD 值-空白 OD 值)。
(2)用等量所构建的不同重组质粒免疫小鼠2次，ニ免90天后，对脾脏T淋巴细胞的MTT实验检测所得的刺激指数(stimulation index, SI)。如图7所示，MTT实验的结果显示PV-SGFn比空载体组和空白对照组更能刺激机体的细胞免疫水平。统计分析表明PV-SGFn与空载体组和空白对照组差异显著。动物实验(1)取18只5-7周龄雌性小鼠分为3组(1.空白对照组，注射100 μ I生理盐水；2.空载体组，注射100 μ g PVAX-I表达载体，3. PV-Fn组，注射100 μ g PV-Fn重组体，ニ免后3个月对小鼠进行攻毒试验，以最小致死量7 X IO9CFU金黄色葡萄球菌腹腔注射6-8周龄的小鼠(体重25g左右)，攻毒后连续观察7天，记录每组试验鼠的发表，死亡情况，计算免疫保护效率。(2)免疫接种后90天，用分离的乳源致病性金黄色葡萄球菌菌株进行攻毒试验，经7天观察，空白组6只小鼠12h全部死亡，空载体组6只小鼠24h全部死亡，PV-Fn重组质粒组保护率为66%。
权利要求
1.一种治疗和预防奶牛乳腺炎的核酸疫苗。
2.根据权利要求I所述的核酸疫苗，其特征在于其抗原表位包含奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌粘附素FnBPA分子相应抗原表位的特定核苷酸序列(包括FnBPA分子配体结合区A区及B区的部分序列)。该抗原表位具有其独特性与新颖性，不同于以往的设计。
3.根据权利要求2所述的核酸疫苗，该疫苗具有SEQNOl所示的碱基序列，该序列为特定地区流行株的独特序列。
4.根据权利要求2所述的核酸疫苗，其特征在于其抗原分子FnBPA的基因的优势抗原表位基因与Kozak序列组合在一起。
5.根据权利要求2所述的核酸疫苗，其特征在于其抗原分子FnBPA的基因可位于任何真核表达载体中，包括但不限于pVAX-1，pcDNA3. 1，pEGFP-Nl, pEGFP-Cl和pLXSN等载体。
6.根据权利要求2所述的核酸疫苗，还涉及所述核苷酸用于生产疫苗的用途。
7.权利要求I所述的核酸疫苗的设计与构建方法，包括以下步骤:A)用引物koF5’CGGGATCCG GAA ATG GCT AAC GTT AAT CAT AT 3’，koR5’ GCG CTC GAG CTA TTC AAT GTA TCCGTCAAC 3’。将Kozak序列与我们所选择的FnBPA基因的优势抗原表位相连接；(B)再将此连接好的基因片段连接如真核表达载体中；(C)在此以PVAX-I为出发载体。
8.权利要求I所述的核酸疫苗的生产宿主细胞是大肠杆菌。
全文摘要
本发明属于微生物学，分子生物学及免疫学领域，涉及牛乳腺炎奶样中金黄色葡萄球菌来源的粘附素分子FnBPA核酸疫苗的设计和制备使用。通过对来源于奶牛乳腺炎地区分离株FnBPA的部分基因的克隆，分析其序列及抗原表位，筛选抗原表位，设计并构建表达载体获得了针对FnBPA分子特定表位的DNA疫苗。该DNA疫苗能刺激小鼠产生持久和显著的特异性淋巴细胞增殖反应以及一定的体液免疫，与相应的空载体接种的阴性对照组比较，差异显著(P＜0.05)。同时攻毒实验的结果表明该核酸疫苗能对免疫小鼠起到免疫保护的作用，该核酸疫苗能够安全、有效地防治奶牛乳房炎且无药物残留，对奶牛乳腺炎的防治具有良好的应用前景。
文档编号A61K39/085GK102847168SQ20121023610
公开日2013年1月2日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者苏艳, 王世民, 张宝江, 邵俊高, 韦海娜 申请人:新疆农业大学