一种产胞外多糖的菠萝泛菌及其多糖的提取和应用的制作方法

专利名称：一种产胞外多糖的菠萝泛菌及其多糖的提取和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于产胞外多糖的微生物技术领域，涉及一种产胞外多糖的菠萝泛菌及其多糖的提取和应用。
背景技术：
多糖的抗氧化作用已经成为最为活跃的研究课题之一。通常植物和藻类来源的多糖较为普遍，但近些年来，微生物来源的多糖(胞外多糖)引起广泛关注，尤其是细菌和真菌来源的胞外多糖，因其易于分离纯化而且产量高等优点在工业生产中颇受青睐。胞外多糖(Exopolysaccharide, EPS)是细菌细胞外含糖结构的总称,包括革兰氏阴性细菌胞膜外的多糖成分和革兰氏阳性菌得肽聚糖，是细菌在特定环境调节下产生的高分子物质。作为细菌的次生代谢产物，胞外多糖对细菌的作用主要有:使细菌群集抵抗吞噬；保护细菌不和抗体结合；形成群集内细菌交替性生长；帮助细菌群体向周围获得足够营养。作为与人类生活紧密相关的一类生物高分子，近年的研究发现细菌胞外多糖还具有抗氧化、抗辐射、免疫调节、降血糖、降血脂，以及抗肿瘤、抗肝炎病毒等特殊的生物学活性。近年来，微生物多糖抗氧化活性的研究报道很多，其在体外可以清除自由基，还具有抗脂质过氧化的能力；在体内则可以提高抗氧化酶的活性，也表现出抗脂质过氧化的能力。与其他外源性抗氧化剂相比，抗氧化多糖具有低毒、安全来源广等特点。作为外源性抗氧化剂，多糖在生物体内发挥作用更为复杂，它可直接参与淬灭自由基的途径外，还可能与通过调节机体内内源性抗氧化剂的活性相关。另外多糖可以作为一种天然的生物抗氧化剂进行复配，增强对人体健康的保护作用
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种产胞外多糖的菠萝泛菌及其多糖的提取和应用，该菠萝泛菌是一种新的微生物，其分泌的胞外多糖具有抗氧化活性。本发明是通过以下技术方案来实现:—种产胞外多糖的菠萝泛菌,其分类命名为Pantoea ananatis G-14,保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M2010107。所述的产胞外多糖的菠萝泛菌在生长过程中向胞外分泌多糖。所述的多糖具有抗氧化活性。基于Pantoea ananatis G-14发酵培养提取胞外多糖的方法,包括以下步骤:I)将P.ananatis G-14单菌落接种在LB液体培养基中，于25 30°C下，搅拌，通气培养8 IOh ;然后转接至发酵培养基中，于25 30°C下，搅拌，通气培养48 65h ；所述的发酵培养基是在LB液体培养基中添加质量分数I 5%的单糖或双糖作为附加碳源；2)培养完成后，离心，收集培养液上清；3)将培养液上清浓缩后，加入其体积2 5倍的体积分数80 95%的乙醇溶液，充分混匀，O 10°C下静置12 24h后，收集静置后的沉淀，得到粗多糖；4)分离去除粗多糖中的蛋白后，在截留分子量为8000 14000的透析袋中以灭菌纯水缓冲液透析24h以上，每12小时更换I次缓冲液；将透析袋中的多糖溶液低温冷冻干燥获得胞外多糖干粉。所述的步骤I)是将P.ananatis G-14单菌落接种在LB液体培养基中，于25 30°C下，100 300rpm搅拌，通气培养8 IOh ;然后以I 5%的接种量转接至发酵培养基中，于25 30°C下，搅拌，通气培养48 65h ；所述的发酵培养基是在LB液体培养基中添加质量分数I 5%的葡萄糖作为附加碳源。所述的步骤2)的离心为8000 12000rpm,3 lOmin, 4°C离心收集培养液上清。所述的步骤3)为:将培养液上清减压浓缩至原体积的1/5 1/10，然后加入其体积2 5倍的体积分数80 95%、4°C预冷的乙醇溶液，充分混匀，O 4°C下放置12 24h后使胞外多糖充分沉淀；8000 12000rpm,3 lOmin,4°C离心收集沉淀,得到粗多糖。所述的步骤4)为:粗多糖采用Sevage法除蛋白后，离心取上清，在截留分子量为8000 14000的透析袋中在灭菌纯水中透析48小时，每12小时更换I次缓冲液；将透析袋中的多糖溶液在使用冷冻干燥机中冷冻干燥，冷凝温度<-50°C，真空度<20Pa，冷冻时间为18· 24h，获得胞外多糖干粉。Pantoea ananatis G-14发酵培养分泌的胞外多糖在制备抗氧化剂的应用。所述的抗氧化剂为:清除羟自由基的抗氧化剂、清除超氧阴离子自由基的抗氧化剂、脂质过氧化抑制齐U、清除DPPH自由基的抗氧化剂中的一种或几种。Pantoea ananatis G-14发酵培养分泌的胞外多糖在制备促进肠道损失修复、促进肠道益生菌繁殖和/或抑制肠道病原菌繁殖的药物的制备。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:本发明提供了一种新的能够产生胞外多糖的微生物，该微生物属于菠萝泛菌P.ananatis，其分类命名为P.ananatis G-14，在LB+1%葡萄糖的固体培养基上的菌苔呈黄色、光滑、湿润、饱满，其16s rRNA序列NCBI登录号为JN974457。本发明提供的P.ananatis G_14在生长过程中向胞外分泌多糖，在培养基上培养后，经过浓缩、沉淀、除蛋白、透析后得到P.ananatis G_14胞外多糖提纯产物，产量为380mg/L，其中的糖蛋白浓度为0.7%。Pantoea ananatis G-14发酵培养分泌的胞外多糖具体抗氧化活性:a)清除羟自由基(.0H)羟基自由基(.0H)被公认是生物系统中最具活性的活性氧化物，能导致生物体内DNA，蛋白质和脂质氧化等的不可逆损伤。羟自由基清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标。P.ananatis G-14胞外多糖对轻基自由基有一定的清除作用，当粗提多糖为5mg/ml时，其清除能力达到同浓度Vc的40%。b)清除超氧阴离子自由基(.02_)在生物氧化中形成的超氧阴离子自由基，性质活泼，可以通过细胞膜的阴离子通道，直接与多种大分子物质结合而使其失去活性。多糖分子上的还原性半缩醛羟基，与超氧阴离子自由基发生氧化还原反应。粗提多糖对超氧阴离子自由基具有一定的清除效果，在5mg/ml时，清除能力仅为15.8%。c)还原能力P.ananatis G-14胞外多糖具有一定的还原能力，且还原能力随多糖浓度的增加而增加，还原能力与多糖浓度之间存在的显著的量效关系。d)脂质过氧化抑制作用脂质过氧化是指不饱和脂肪酸、脂质的氧化，该过程可直接干扰和破坏膜的生物功能，许多导致羟自由基增多的因素(酒精、植物毒素蛋白、氟中毒等)、紫外辐射都会诱导脂质过氧化，进而诱发一系列疾病。以卵黄脂蛋白为反应底物的模型LPO体系实验结果显示,P.ananatis G-14胞外多糖具有较高的脂质过氧化抑制作用，从0.15mg/ml到0.6mg/ml时，脂质过氧化抑制作用随多糖的浓度增加而显著增加，当多糖浓度高于1.25mg/ml时，抑制作用趋于平稳，在5mg/ml时，抑制作用可达35.8%。e)清除DPPH自由基*DPPH (1，1-二苯基-2-苦基肼自由基)是一种很稳定的以氮原子为中心的自由基，通过检测多糖对*DPPH的清除能力，可以说明多糖抗氧化能力的大小。随着多糖浓度的增加，其对.DPPH的清除能力也逐渐在增强，在2.5mg/ml时，清除率达28%，在5mg/ml时，清除率达46%。P.ananatis G-14胞外多糖具有类益生元效果:
未经P.ananatis G_14胞外多糖灌胃的痢疾志贺氏菌感染大鼠的肠壁出现水肿、充血等典型炎症的组织病理学特征，黏膜上皮有不同程度破坏；经P.ananatis G_14胞外多糖灌胃的痢疾志贺氏菌感染大鼠的肠壁较之平滑，黏膜上皮的破坏获得了一定程度的修复。表明P.ananatis G-14胞外多糖具有促进肠道损失修复的作用，同时其可能调节肠道微生物区系平衡，促进肠道益生菌，抑制病原菌和大肠杆菌的繁殖，可促进动物健康，表现出类似于益生元的作用。保藏说明本发明所述的P.ananatis G-14进行了下述保藏:保藏时间:2012年4月11日，保藏地点:中国.武汉.武汉大学，中国典型培养物保藏中心，CCTCC ;保藏号为 CCTCC M2012107 ;分类命名 Pantoea ananatis G-14。


图1为CCTCC M2010107在显微镜下的镜检结果图(100 X 100)；图2为CCTCC M2010107在固体培养基上的产胞外多糖；图3为16s rRNA序列比对构建的系统进化树(NJ进化树)；图4为CCTCC M2010107分泌胞外多糖体外对羟自由基的清除作用；图5为CCTCC M2010107分泌胞外多糖体外对超氧阴离子自由基的清除作用；图6为CCTCC M2010107分泌胞外多糖体外的还原能力检测结果图；图7为CCTCC M2010107分泌胞外多糖的脂质过氧化抑制作用；图8为CCTCC M2010107分泌胞外多糖体外对DPPH自由基的清除作用；
图9-1 9-2为CCTCC M2010107分泌胞外多糖处理的痢疾志贺氏菌慢性感染大鼠的肠道组织病理学变化；其中图9-1为痢疾志贺氏菌慢性感染大鼠；图9-2为G-14胞外多糖干预的慢性感染大鼠。
具体实施例方式下面结合Pantoea ananatis G-14的分离、培养、多糖的提取和作用的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。UCCTCC M2010107 (Pantoea ananatis G-14)的分离有报道称部分菠萝泛菌P.ananatis具有抑菌性质(包括真菌和细菌);有些菌株具有冰核细菌特性，可作为生物添加剂用于食品冷冻过程中；部分菌株则被被认为是一种植物病原菌，可引起洋葱、稻谷等腐烂病变。目前的研究并没有关于菠萝泛菌P.ananatis的胞外多糖抗氧化活性的研究报道。CCTCC M2010107 的分离为:分离来源:2011年4月从西安华润万家超市采集切片水果样品，无菌状态下匀浆，秤称取0.5g样品，加灭菌的0.1%蛋白胨溶液试管中充分混匀，室温静置5min，取上清Iml与25ml灭菌的溶化的牛肉膏-蛋白胨固体培养基混匀，倾倒平板，37°C培养48h。

从上述培养基中筛选得到了一株菠萝泛菌P.ananatis，发现该菌在牛肉膏-蛋白胨固体培养基上生长迅速，菌落光滑、湿润，接触时有粘性，在LB液体试管培养基中培养时，48小时以后出现细胞凝集现象。分离所用培养基:牛肉膏-蛋白胨固体培养基(0.3%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%氯化钠、1.5%琼脂,高压蒸汽灭菌，121°C,20min)该菌在P.ananatis培养基上生长时,在显微镜下的镜检结果如图1所不,放大倍数 100X100。P.ananatis培养基:TSB培养基(1.5%胰蛋白胨，0.5%大豆蛋白胨，0.5%氯化钠，固体培养基加1.5%琼脂)该菌株在LB+1%葡萄糖的固体培养基上的菌苔呈黄色、光滑、湿润、饱满，具体如图2所示。在发现该菌的向培养基中分泌胞外多糖后，筛选出了适合其的产胞外多糖发酵的培养基:LB培养基(1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化钠)+1-5%葡萄糖；其培养条件为:产胞外多糖发酵条件为30°C，恒温震荡摇床200rpm，通气培养48_65h。2、CCTCC M2010107 分离株的鉴定提取CCTCC M2010107的总DNA，并以其为模板，扩增1.5kbl6S rRNA序列，16SrRNAPCR引物为:16S-F:5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3’，16S-R:5 ‘GGT ACC T TG TTA CGA CTT3’ 。扩增程序为-MV , 4min, I个循环预变性；94°C变性，30sec，58 °C退火，30sec，72°C延伸，lmin，30 个循环；72°C 7min。PCR 扩增体系为 20μ I PCR 体系中分别加入 IOmM dNTP 1.6 μ 1，IOXTaq 酶 buffer2 μ I，InM PCR 引物各 I μ I，G-14 总 DNA 模板 2_3ng，Taq DNA 聚合酶 0.2 μ I，以 MiniQ 水补足 20 μ I。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，用PCR产物回收试剂盒回收，并送测序公司测序。测序结果与NCBI上公布的细菌16S rRNA序列比对，证实该分离株属于菠萝泛菌P.ananatis，其16s rRNA序列NCBI登录号为JN974457。N-J系统进化树见图3，确定该菌株是一种新的菠萝泛菌。3、CCTCC M2010107产胞外多糖发酵、多糖的提取基于Pantoea ananatis G-14发酵培养提取胞外多糖的方法,包括以下步骤:I)将P.ananatis G-14单菌落接种在LB液体培养基中，于25 30°C下，搅拌，通气培养8 IOh ;然后转接至发酵培养基中，于25 30°C下，搅拌，通气培养48 65h ；所述的发酵培养基是在LB液体培养基中添加质量分数I 5%的单糖或双糖作为附加碳源；具体的:是将P.ananatis G-14单菌落接种在LB液体培养基中，于25 30°C下，100 300rpm搅拌，通气培养8 IOh;然后以I 5%的接种量转接至发酵培养基中，于25 30°C下，搅拌，通气培养48 65h ；所述的发酵培养基是在LB液体培养基中添加质量分数I 5%的葡萄糖作为附加碳源。2)培养完成后，离心，收集培养液上清；具体的:的离心为8000 12000rpm,3 lOmin, 4°C离心收集培养液上清。3)将培养液上清浓缩后，加入其体积2 5倍的体积分数80 95%的乙醇溶液，充分混匀，O 10°C下静置12 24h后，收集静置后的沉淀，得到粗多糖；
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具体的:将培养液上清减压浓缩至原体积的1/5 1/10，然后加入其体积2 3倍的95%乙醇溶液(4°C预冷)，充分混匀，O 4°C下放置12 24h后使胞外多糖充分沉淀；8000 12000rpm,3 lOmin,4°C离心收集沉淀，得到粗多糖。4)分离去除粗多糖中的蛋白后，在截留分子量为8000 14000的透析袋中以灭菌纯水为透析液透析24h以上,每12小时更换I次缓冲液；将透析袋中的多糖溶液低温冷冻干燥获得胞外多糖干粉。具体的:粗多糖采用Sevage法除蛋白后，离心取上清，在截留分子量为8000 14000的透析袋中以灭菌纯水为透析液透析48小时，每12小时更换I次缓冲液；将透析袋中的多糖溶液进行低温冷冻干燥(使用冷冻干燥机，冷凝温度<-50°C，真空度<20Pa，18-24h)获得胞外多糖干粉。经过浓缩、沉淀、除蛋白、透析后得到P.ananatis G-14胞外多糖提纯产物,产量为380mg/L，其中的糖蛋白浓度为0.7%。4、P.ananatis G_14胞外多糖的体外抗氧化活性测定:4.1清除羟自由基(.0H)在IOml试管中分别加入2ml不同浓度的胞外多糖溶液(称取冻干粉，配置为
0.15mg/ml>0.31mg/ml、0.62mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml),2ml6mM FeSO4, 2mlH2O2,混匀室温静置反应30min，测定OD51tl值。以相同浓度的Vc溶液代替胞外多糖溶液作为阳性对照组，以无菌ddH20代替胞外多糖溶液作为阴性对照组。外多糖清除羟自由基(％) = (A0-A1) /AtlX 100%，其中Atl为空白对照组的平均吸光值夂为样品组的平均吸光值羟基自由基(.0H)被公认是生物系统中最具活性的活性氧化物，能导致生物体内DNA，蛋白质和脂质氧化等的不可逆损伤。羟自由基清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标。P.ananatis G-14胞外多糖对轻基自由基有一定的清除作用，当粗提多糖为5mg/ml时，其清除能力达到同浓度Vc的40%，检测结果如图4所示，其中黑色代表G-14胞外多糖，灰色代表Vc.。4.2清除超氧阴离子自由基(.02_)在25°C水浴中预热30min的加有4.5ml0.05M Tris-HCl (pH8.2)的试管中分别加入Iml不同浓度的胞外多糖溶液(称取冻干粉，配置为0.15mg/ml、0.31mg/ml、0.62mg/ml、
1.25mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml),以及0.4ml25mM邻苯三酚溶液，以相同浓度的Vc溶液代替胞外多糖溶液作为阳性对照组，以无菌ddH20代替胞外多糖溶液作为阴性对照组。分别混匀后，置于25°C水浴中反应5min，加入lml8M HCl中止反应，测定OD299值。胞外多糖清除超氧阴离子(％) = (A0-A1) /AtlX 100%，其中Atl为空白对照组的平均吸光值夂为样品组的平均吸光值在生物氧化中形成的超氧阴离子自由基，性质活泼，可以通过细胞膜的阴离子通道，直接与多种大分子物质结合而使其失去活性。多糖分子上的还原性半缩醛羟基，与超氧阴离子自由基发生氧化还原反应。粗提多糖对超氧阴离子自由基的作用结果如图5所示，其中黑色代表G-14胞外多糖，灰色代表Vc.;其对超 氧阴离子自由基的清除效果较差，在5mg/ml时，清除能力仅为15.8%。4.3还原能力在IOml试管中分别加入Iml不同浓度的胞外多糖溶液(称取冻干粉，配置为
0.15mg/ml、0.31mg/ml、0.62mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml), 2.5ml 憐酸盐溶液(pH6.6),2.5ml铁氰化钾，混匀后置于50°C水浴中反应20min，再加入2.5mll0%三氯乙酸溶液，混勻，3000rpm离心IOmin,取上清2.5ml于新试管中，加入2.5ml无菌ddH20,
0.5ml0.l%FeCl3,室温放置3min，测定OD7tltl值。以相同浓度的Vc溶液代替胞外多糖溶液作为阳性对照组。检测结果如图6所示，实线代表G-14胞外多糖，虚线代表Vc.;P.ananatisG-14胞外多糖具有一定的还原能力，且还原能力随多糖浓度的增加而增加，还原能力与多糖浓度之间存在的显著的量效关系。4.4脂质过氧化抑制作用取0.2mll:40 稀释的卵黄悬液(用 pH7.45,0.1MPBS 配置的)，0.2ml25mMFeS04，100 μ I不同浓度的胞外多糖溶液(称取冻干粉，配置为0.15mg/ml、0.31mg/ml、0.62mg/ml、l.25mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml),以无菌 ddH20 补足 2ml,混勻，置于 37°C水浴中震荡15min，取出后，样品管加入0.5ml20%TCA溶液，静置lOmin，3500rpm离心lOmin，转移上清，再加入Iml0.8%的硫代巴比妥酸溶液，密闭试管，100°C煮沸15min，自然冷却。阴性对照管以2mlPBS代替多糖溶液。测定OD532值。胞外多糖对脂质过氧化的抑制作用率(％)= (1-A1Atl)XlO(Fc);其中Atl为空白对照组的平均吸光值夂为样品组的平均吸光值。脂质过氧化是指不饱和脂肪酸、脂质的氧化，该过程可直接干扰和破坏膜的生物功能，许多导致羟自由基增多的因素(酒精、植物毒素蛋白、氟中毒等)、紫外辐射都会诱导脂质过氧化，进而诱发一系列疾病。以卵黄脂蛋白为反应底物的模型LPO体系实验结果如图7所示，P.ananatis G-14胞外多糖具有较高的脂质过氧化抑制作用，从0.15mg/ml到0.6mg/ml时,脂质过氧化抑制作用随多糖的浓度增加而显著增加，当多糖浓度高于1.25mg/ml时，抑制作用趋于平稳，在5mg/ml时，抑制作用可达35.8%。4.5清除DPPH自由基在IOml试管中分别加入2ml40mg/ml DPPH，和2ml不同浓度的胞外多糖溶液(称取冻干粉，配置为 0.15mg/ml、0.31mg/ml、0.62mg/ml、l.25mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml),充分混匀，室温下避光反应30min，测定OD517值。以相同浓度的Vc溶液代替胞外多糖溶液作为阳性对照组，以无菌ddH20代替胞外多糖溶液作为阴性对照组。胞外多糖清除DPPH自由基(％)= (A0-A1)A0X 100% ;其中Atl为空白对照组的平均吸光值夂为样品组的平均吸光值* DPPH (1，1-二苯基-2-苦基肼自由基)是一种很稳定的以氮原子为中心的自由基，通过检测多糖对*DPPH的清除能力，可以说明多糖抗氧化能力的大小。随着多糖浓度的增加，其对.DPPH的清除能力也逐渐在增强，在2.5mg/ml时，清除率达28%，在5mg/ml时，清除率达46%，具体如图8所示，其中黑色代表G-14胞外多糖，灰色代表Vc.。5, P.ananatis G_14胞外多糖处理对痢疾志贺氏菌感染大鼠的生理活性以感染性痢疾志贺氏菌灌喂SD大鼠，建立大鼠的痢疾杆菌慢性感染模型。将纯化的P.ananatis G-14多糖按照10mg/kg体重进行感染模型大鼠灌胃，每天I次,进行4周。以生理盐水灌胃处理做阴性对照。4天后解剖大鼠，取肠道组织，制备石蜡切片，HE染色，显微镜观察比较处理和对照的肠道组织病变情况。未经P.ananatis G-14胞外多糖灌胃的痢疾志贺氏菌感染大鼠的肠壁出现水肿、充血等典型炎症的组织病理学特征，黏膜上皮有不同程度破坏；经P.ananatis G_14胞外多糖灌胃的痢疾志贺氏菌感染大鼠的肠壁较之平滑，黏膜上皮的破坏获得了一定程度的修复，结果如图9-1、9-2所示(HEX40)，其中图9_1为痢疾志贺氏菌慢性感染大鼠；图9-2为G-14胞外多糖干预的慢性感染大鼠。这表明P.ananatis G_14胞外多糖具有促进肠道损失修复的作用。同时其可能调节肠道微生物区系平衡，促进肠道益生菌，抑制病原菌和大肠杆菌的繁殖，可促进动物健康，表现出类似于益生元的作用。综上检测表明:P.ananatis G-14多糖具有明显的抗氧化活性、抗辐射、增强免疫力、抗肿瘤活性，可用于保健食品、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂、兽药等。进一步,还可对P.ananatis G_14菌株进行分子生物学改造,在原有基础上进一步提高产多糖能 力，经规模发酵并提取活性多糖，作为抗氧化剂、益生元等，用于保健食品原料、食品添加剂、饲料添加剂、防辐射化妆品、兽药注射剂、免疫佐剂等。还可开发新型细菌胞外多糖功能产品，也可与其他活性物质(多糖类、多酚类等)协同作用，获得复合活性添加物。
权利要求
1.一种产胞外多糖的菠萝泛菌,其特征在于,其分类命名为Pantoea ananatis G-14,保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCM2010107。
2.如权利要求I所述的产胞外多糖的菠萝泛菌，其特征在于，其在生长过程中向胞外分泌多糖。
3.基于Pantoeaananatis G-14发酵培养提取胞外多糖的方法,其特征在于,包括以下步骤1)将P.ananatis G-14单菌落接种在LB液体培养基中，于25 30°C下，搅拌，通气培养8 IOh ;然后转接至发酵培养基中，于25 30°C下，搅拌，通气培养48 65h ；所述的发酵培养基是在LB液体培养基中添加质量分数I 5%的单糖或双糖作为附加碳源；2)培养完成后,离心,收集培养液上清；3)将培养液上清浓缩后，加入其体积2 5倍的体积分数80 95%的乙醇溶液，充分混匀，O 10°C下静置12 24h后，收集静置后的沉淀，得到粗多糖；4)分离去除粗多糖中的蛋白后，在截留分子量为8000 14000的透析袋中以灭菌纯水缓冲液透析24h以上，每12小时更换I次缓冲液；将透析袋中的多糖溶液低温冷冻干燥获得胞外多糖干粉。
4.如权利要求3所述的基于Pantoeaananatis G-14发酵培养提取胞外多糖的方法，其特征在于，所述的步骤I)是将P. ananatis G-14单菌落接种在LB液体培养基中，于25 30°C下，100 300rpm搅拌，通气培养8 IOh ;然后以I 5%的接种量转接至发酵培养基中，于25 30°C下，搅拌，通气培养48 65h ；所述的发酵培养基是在LB液体培养基中添加质量分数I 5%的葡萄糖作为附加碳源。
5.如权利要求3所述的基于Pantoeaananatis G-14发酵培养提取胞外多糖的方法，其特征在于，所述的步骤2)的离心为8000 12000rpm，3 lOmin，4°C离心收集培养液上清。
6.如权利要求3所述的基于Pantoeaananatis G-14发酵培养提取胞外多糖的方法，其特征在于，所述的步骤3)为将培养液上清减压浓缩至原体积的1/5 1/10，然后加入其体积2 5倍的体积分数80 95%、4°C预冷的乙醇溶液，充分混匀，O 4°C下放置12 24h后使胞外多糖充分沉淀； 8000 12000rpm,3 lOmin,4°C离心收集沉淀,得到粗多糖。
7.如权利要求3所述的基于Pantoeaananatis G-14发酵培养提取胞外多糖的方法，其特征在于，所述的步骤4)为粗多糖采用Sevage法除蛋白后，离心取上清，在截留分子量为8000 14000的透析袋中在灭菌纯水中透析48小时，每12小时更换I次缓冲液；将透析袋中的多糖溶液在使用冷冻干燥机中冷冻干燥，冷凝温度<-50°C，真空度<20Pa，冷冻时间为18 24h，获得胞外多糖干粉。
8.Pantoea ananatis G-14发酵培养分泌的胞外多糖在制备抗氧化剂的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的抗氧化剂为清除羟自由基的抗氧化剂、清除超氧阴离子自由基的抗氧化剂、脂质过氧化抑制剂、清除DPPH自由基的抗氧化剂中的一种或几种。
10.Pantoea ananatis G_14发酵培养分泌的胞外多糖在制备促进肠道损失修复、促进肠道益生菌繁殖和/或抑制肠道病原菌繁殖的药物的制备。
全文摘要
本发明公开了一种产胞外多糖的菠萝泛菌及其多糖的提取和应用，其分类命名为Pantoea ananatis G-14，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M2010107。本发明提供的P.ananatis G-14在生长过程中向胞外分泌多糖，在培养基上培养后，经过浓缩、沉淀、除蛋白、透析后得到P.ananatis G-14胞外多糖提纯产物，产量为380mg/L，其中的糖蛋白浓度为0.7%。Pantoea ananatis G-14发酵培养分泌的胞外多糖具体抗氧化活性和类益生元效果。
文档编号A61K31/715GK103255075SQ20121023575
公开日2013年8月21日 申请日期2012年7月9日 优先权日2012年7月9日
发明者韩蓓, 张瑞娟, 李卫敏, 王培培, 梁欢 申请人:西安交通大学