一种猪圆环病毒ii型疫苗制备的制作方法

专利名称：：一种猪圆环病毒ii型疫苗制备的制作方法
技术领域：
：本发明属于兽用生物制品
技术领域：
，涉及动物病毒，更具体是涉及猪圆环病毒II型疫苗的制备方法。
背景技术：
：猪圆环病毒II型(简称PCV2)感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征(P丽S)、猪呼吸疾病综合征(PRDC)、猪皮肤和肾病综合征(PDNS)等多种疾病(总称为猪圆环病毒病，PCVDs)，其临床特征为体重逐渐减轻，以及体征例如呼吸急促、呼吸困难和黄疸。从病理学观点来看，其表现为淋巴细胞或肉芽肿浸润，淋巴结病以及较罕见的肝炎和淋巴细胞或肉芽肿性肾炎。(ClarkE.G.(1997)Proc.Am.Assoc.SwinePrac.499-501;LaSemaineVeterinaireNo.26，supplementtoLaSemaineVeterinaire1996(834);LaSemaineVeterinaire1997(857):54;Nayar等人(1997)Can.Vet.J.38:385-387)。该病最早于1991年在力口拿大西部发现(ClarkEG.Post-weaningmultisystemicwastingsyndrome.ProcAmAssocSwinePract，1997，28:499-501)，随后，该疾病相继在美国、法国、西班牙、北爱尔兰等国或地区出现(DaftB等.Interstitialpneumoniaandl卿hade,hathyassociatedwithcircoviralinfectioninasixweek—oldpig.ProcAmAssocYetLabDiag，1996，39:32;Ke皿edyS等.PorcinecircovirusinfectioninNorthernIreland,vetRec，1998，142:495并96;LeCannP等.Pigletwastingdisease.TletRec，1997，141:660;SegalesJ等.Firstreportofpost-weaningmultisystemicwastingsyndromeinpigsinSpain.VetRec，1997，141:600-660)。在国内，郎洪武等(郎洪武等.断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测.中国兽医科技，2000，30:3-5)和曹胜波等(曹胜波等.猪II型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析.病毒学报，2000，18:137-141)分别通过血清学和病原学调查表明，我国已有PCV2的流行。目前，PCV2已在世界各地广泛存在并流行，给全球养猪业造成了相当大的经济损失。目前还没有治疗和预防这种疾病的方法。然而，多项证据指出猪圆环病毒是P丽S(断奶仔猪多系统衰竭综合征)的病原体(Ellis等人(1998)Can.Vet.J.39:44-51)。圆环病毒已从患有P丽S的猪回收，并且针对猪圆环病毒的抗体已在患有该疾病的猪体内证实。由于该病毒是一种DNA病毒，病毒变异率低，同时在世界范围内的致病只有PCV2—型。而PCV2的生物学特性比较特殊，它在细胞上增殖滴度很低，而且不引起细胞病变，因此研制PCV2的灭活疫苗和弱毒疫苗的难度很大。目前国内外生产疫苗主要有两种工艺(l)生物反应器规模较小，一般是实验室用，不能规模化生产；其有搅拌浆，以载体为依托培养细胞。这种方法的缺点是搅拌产生剪切力，并且有气泡生成，影响细胞生长，规模化生产存在技术瓶颈。(2)转瓶技术目前工业化生产基本都采用这种技术，生产细胞和病毒时劳动强度大、占地大、批间差异大、生产成本高、单批产量低，难以进行标准化生产的质量控制。在我国还未有确实有效并经过农业部批准的PCV2疫苗，主要原因还在于，抗原浓度较低，PCV2在细胞中的生长滴度较低，一般仅为10"TCIDs。/ml左右。因此提高病毒效价和产量，降低生产成本，是解决猪圆环病毒II型疫苗产业化的难题。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种圆环病毒II型(PCV2)疫苗的制备方法。该方法生产工艺简单、易操作，所得产品病毒含量高，批间差异小，质量易控制，可显著提高疫苗产量和质量。本发明方法包括下列操作步骤(1)将制苗用宿主细胞接种到含有细胞生长用培养液与微载体的载体罐内，并将上述细胞与微载体混合均匀，使细胞贴附在微载体上；在适当培养环境下，提供上述细胞生长足够的养分及气体环境，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的540倍；(2)将细胞生长液更换为维持用培养液，并同步加入猪圆环病毒II型种毒，先使其吸附在细胞上，然后进行培养，增殖病毒；(3)培养24小时后将细胞维持液弃去，接种病毒的细胞用0.01mol/L的PBS充分洗涤，加入D-氨基葡萄糖孵育30min;(4)弃去D-氨基葡萄糖，将细胞用0.01mol/L的PBS(pH7.4)充分洗涤，加入细胞维持液继续培养细胞；(5)连续培养10天后，收获病毒液，于_20°〇冻融两次，得到猪圆环病毒II型(PCV2)病毒液;(6)病毒液经检验合格后，加入甲醛灭活，灭活后的猪圆环病毒II型(PCV2)加入常规油性佐剂或双相佐剂，搅拌混匀，制得油乳剂疫苗或双相疫苗。制苗毒液的检验方法制苗毒液按《中华人民共和国兽药典》2005年版附录15、19、20页的相关规定进行检验，完全符合，对猪安全无副作用，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。通过IFA法测定病毒的效价，细胞制苗毒液每1.Oml含病毒^106°TCID5。；成品检验方法按《中华人民共和国兽药典》2005年版附录15、19、20页的相关规定进行检验，完全符合，对猪安全无副作用，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。上述技术方案中，所述的宿主细胞为可增殖猪圆环病毒病毒II型(PCV2)的细胞系，如PK15细胞系等。上述技术方案中，所述的载体为网状纤维，如聚酯纤维。上述技术方案中，步骤(1)中所述微载体用量为每500ml培养液添加5.5g微载体、细胞的初始接种量为1.42.6X107Cells/g微载体较好。上述技术方案中，步骤(2)中所述接种病毒时细胞密度为1.12.0X108cellS/g微载体。上述技术方案中，细胞培养的环境为温度37t:，0)2浓度为5X，培养液pH值为7.0-7.6。上述技术方案中，步骤(2)中所述接种病毒时按病毒感染复数(M.O.I.)为0.011的比例。上述技术方案中，步骤(1)中所述细胞培养时一般贴附4h后开始培养程序。上述技术方案中，步骤(2)中所述接种病毒时一般吸附4h后开始病毒培养程序。本发明方法中培养细胞和病毒，可在生物反应器中进行。生物反应器主要包括载体瓶、储液罐、PH控制器、D0监测器、输入和输出系统。工作过程如下细胞贴附在载体瓶中载体上生长，当储液罐的培养液被泵入载体瓶时，培养液液面上升向细胞供给养分并促进细胞新陈代谢产物的去除；当载体瓶的培养液泵入储液罐时，培养液面随之下降，使细胞进行通风，促进呼吸，减小细胞切向压力，无02供应限制，无泡沫烦恼。这个重复的运动使载体上的细胞能够得到足够的营养和02，同时产生的代谢废物像C02能够有效的被排出去，从而能够大量的扩增细胞并增值病毒，此种技术称之为潮汐式微载体悬浮培养技术。与现有技术相比，本发明的制备猪圆环病毒II型(PCV2)疫苗的方法，具有以下有益效果(1)毒价高传统的转瓶工艺生产的PCV2病毒效价仅为10"TCIDs。/ml，而本发明采用新的技术参数，运用潮汐式微载体悬浮培养技术高密度培养生产的病毒效价可以达到106°TCID50/ml1()70TCID5o/ml，其毒价要高出100-1000倍。(2)生产规模大、单批次产量高目前国内采用搅拌式悬浮培养工艺培养动物细胞，单台生物反应器最大规模不超过IOOL;而本发明采用新的技术参数，运用潮汐式微载体悬浮培养技术培养动物细胞，单台生物反应器规模达500L，最大可达IOOOL，单台规模提高5-10倍。(3)生产成本相对较低、产品质量高且稳定传统转瓶生产工艺生产的PCV2病毒效价仅为10"TCID5。/ml，要达到兽用生物制品规程要求的10，CID5。/ml，需要进行浓縮处理，每ml的生产成本为3元，而本发明工艺生产的PCV2病毒效价可达10"TCIDs。/ml，每ml的生产成本为0.5元，产品成本下降6倍，质量提高提高100倍(以毒价计)。(4)操作方便、操作空间小500L工作体积仅需20m2的操作区域，仅需2人就可完成全部操作，而传统工艺需要2000个大方瓶或转瓶，最少需要600m2的操作区域，最少需要100人才能完成。(5)工艺参数控制精确本发明运用潮汐式微载体悬浮培养技术生产时可控参数有温度、pH值、溶氧量、二氧化碳浓度、载体浓度，可实现在线监测的参数有葡萄糖、乳酸和铵离子浓度，批次质量稳定，而传统转瓶培养工艺仅能控制温度和转速，不同批次质量差异大。(6)本发明利用生物反应器，解决抗原浓度低、生产成本高、劳动强度大的问题，而且能连续培养、占地小、生产规模大、无搅拌式悬浮培养时对细胞形成的剪切力、无气泡产生、对细胞无伤害。具体实施例方式实施例1潮汐式微载体悬浮培养技术高密度培养PK15细胞及猪圆环病毒II型(PCV2)所使用的生物反应器为美国CESC0公司的TideCell-020，所使用的载体为美国CESCO公司的BioNocII聚酯纤维。(1)将PK15细胞4.0X10、ell接种于20L载体罐中并添加载体BioNocII聚酯纤维2.2X102g，以及工作体积为500L的含6%小牛血清的DMEM生长用培养液，潮汐式微载体悬浮培养技术培养至细胞总数达到4.OXl(Tcell;培养细胞时先启动贴附程序，4h后换成5培养程序；细胞贴附程序为卯2500mL/minholdlmin、Down:2500mL/minhold30s、设定最大换液量18500mL;细胞培养程序up:1900mL/minholdlmin、Down1900mL/minholdlmin、设定最大换液量18000mL;(2)将细胞生长用培养液全部更换为含2X小牛血清的维持用DMEM培养液，并同步(M.O.I.=0.1)加入猪圆环病毒II型(PCV2)种毒，于37t:培养，控制二氧化碳浓度5%，pH值7.2;接种病毒时先启动病毒吸附程序，4h后换成病毒培养程序；病毒吸附程序为up:1600mL/minholdlmin、Down:1600mL/minhold30s、设定最大换液量18500mL;病毒培养程序up:1000mL/minholdlmin、Down1000mL/minholdlmin、设定最大换液量18000mL;(3)培养24小时后将载体罐内维持液弃去，细胞用0.01mol/L的PBS(pH7.4)充分洗涤，加入300mmol/LD_氨基葡萄糖孵育30分钟(D_氨基葡萄糖添加量以刚好淹没载体为准，孵育期间设备程序暂停，静止孵育)；(4)弃去D-氨基葡萄糖将细胞用0.Olmol/L的PBS(pH7.4)充分洗涤以除去载体上残留的D-氨基葡萄糖，加满细胞维持液继续培养细胞；(5)连续培养10天后收获病毒液，于_201:冻融两次，即得到猪圆环病毒II型(PCV2)。将收获的病毒液进行半成品检验以确认符合各项标准；半成品检验(a)纯净性检验按《中华人民共和国兽药典》2005版附录15、19、20页相关规定进行检验，结果无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。(b)病毒含量测定将病毒用含300mmol/LD_氨基葡萄糖和2%小牛血清细胞维持液作10倍梯度系列稀释，从10—1到10—6。每个稀释度接种8个L同时设立阴性不接毒对照，放入5%0)2温箱中37t:培养4872h，80X丙酮固定，用免疫荧光抗体(IFA)方法测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞(绿色荧光)的孔数，根据Reed-Muench法计算病毒TCIDs。，每1.Oml含病毒^106°TCID5。；(c)特异性用间接免疫荧光抗体(IFA)方法测定。将病毒接种于96孔细胞板PK15细胞，每个样品4孑L每孔200iiL，同时设立阴性对照，放入5%C02温箱中37。C培养4872h;弃去生长液，用O.01mol/L的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤细胞2次，然后加入100yL预冷的80%丙酮溶液，41:固定30min。然后用PBS洗涤3次；弃掉维持液，PBS洗涤3次后，每孔加入100iiL用PBSl:100稀释的猪抗PCV2血清，37t:作用lh;用PBS洗涤3次，每次3min后；加入用PBS1:100稀释的荧光标记的兔抗猪IgG的二抗(IgG-FITC)，每孔100iiL，37t:作用lh;用PBS洗涤3次，每次3min，在荧光显微镜下观察。细胞对照孔应无特异性荧光出现，而病毒接种细胞孔应有大量特异性荧光出现。实施例2猪圆环病毒II型(PCV2)灭活疫苗的制备及免疫效力评价1.材料与方法1.1疫苗实施例1得到的猪圆环病毒II型(PCV2)病毒液按1:1比例加入206佐剂(法国SEPPIC公司产品)，充分混合均匀即得(批号为:0803、0804、0805、0806和0807)。将制得的疫苗进行成品检验以确认符合各项标准；6性状检验本苗为水包油包水双相淡红色乳剂，性状检验均达到了"质量标准(草案)"的规定。取一个清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第一滴外，均不扩散。稳定性检验在37t:条件下放置21日均不分层、不破乳。取疫苗10ml装于离心管中，以3000r/min离心15min，管底未见水相析出。粘度检验用lml吸管(出口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)，吸取25。C左右疫苗1.Oml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，均在5s以内。纯净性检验按《中华人民共和国兽药典》2005版附录15、19、20页相关规定进行检验，结果无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。甲醛残留量测定按照《中华人民共和国兽药典》2005年版进行甲醛残留量测定，结果甲醛含量均符合兽用生物制品通则的有关规定。1.2.试验动物725周龄PCV2ELISA抗体和PCV2抗原阴性仔猪，购自河南洛阳。1.3.安全性试验1.3.1.最小免疫日龄仔猪一次单剂量接种取7日龄哺乳仔猪30头，分成6组，每组5头，第15组肌肉注射5个批次疫苗，接种剂量2ml/头；第6组为空白对照组，编号并称体重后隔离饲养30天，观察仔猪有无临床症状。接种后17天每天测量体温(直肠温度)。5批疫苗接种的仔猪和对照组猪均无临床异常反应，体温正常。免疫后30天称重，试验组仔猪体重与对照组仔猪体重无差异(P>0.5)。1.3.2.仔猪单剂量重复接种取1518日龄哺乳仔猪30头，分成6组，每组5头，第15组肌肉注射5个批次疫苗，接种剂量2ml/头，接种后2周，再用相同剂量免疫一次；第6组为空白对照组。编号并称体重后隔离饲养30天，观察仔猪有无临床症状。接种后17天每天测量体温(直肠温度)，试验结束时称体重。5批疫苗接种的仔猪和对照组猪均无临床异常反应，体温正常。第二次免疫后30天称重，试验组仔猪体重与对照组仔猪体重无差异(P>0.5)。1.3.3.仔猪一次超剂量接种取25日龄哺乳仔猪30头，分成6组，每组5头，第15组肌肉注射5个批次疫苗，接种剂量4ml/头；第6组为空白对照组，编号并称体重后隔离饲养30天，观察仔猪有无临床症状。接种后17天每天测量体温(直肠温度)，试验结束时称体重。5批疫苗2倍剂量接种的仔猪和对照组猪均无临床异常反应，体温正常。免疫后30天称重，试验组仔猪体重与对照组仔猪体重无差异(P>0.5)。1.4.抗体检测与攻毒保护试验选择35头1518日龄PCV2ELISA抗体和PCV2抗原阴性断奶仔猪，随机分成7组，5头/组，第1、2、3、4、5组免疫0803、0804、0805、0806和0807批灭活苗，颈部肌肉注射免疫，2ml/头，两周后用相同免疫剂量加强免疫一次；第6组为攻毒对照组；第7组为空白对照组，只接种钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA)和巯基乙酸培养基。二免后3周用PCV2-SH病毒攻击，肌肉注射3X105°TCID5。/头，攻毒后第4、7天分别在猪的两腋下及两臀部分四点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/mL)，4mL/头，腹腔接种巯基乙酸培养基，10mL/头；攻毒后第11、19天仅腹腔接种巯基乙酸培养基，10mL/头。检测指标(l)分别于首免后14、21、35天采血，测定ELISA抗体和中和抗体效价，观察抗体产生动态。(2)攻毒后120天测量体温，观察临床症状。(3)死亡猪进行病理解剖，并且试验结束时，扑杀所有猪，观察病理变化。1.5.ELISA抗体检测用大肠杆菌表达的PCV2-0RF2蛋白作为抗原，通过方阵滴定试验确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板，iooiil/孔，37t:作用2h后4t:包被过夜；洗涤3次，每次3-5min;每孔加200yL的0.15%BSA封闭液封闭板子，37。C作用2h;洗涤；将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100iiL，37t:作用lh;洗涤；然后加入酶标的SPA(l:10000倍稀释)，100iiL/孔，37。C作用lh;洗涤；加底物液TMB(3'，3'，5'，5'，-四甲基联苯胺)显色，最后用2mmol/L的H^04终止反应。结果判定待检血清0D45。值/阴性血清0D45。值>2.1为阳性。1.6.血清中和试验采用固定病毒稀释血清法。待检血清56t:加热30min，10000rpm离心5min，小心吸出上清，做1:2稀释后进行倍比稀释；分别与等量1000TCID5。PCV2-SH病毒液混合，37°Clh，接种于含PK15细胞单层的96孔板内，100y1/孔，每一稀释度接种4孔，同时设细胞对照和病毒对照孔。37t:培养12h，用300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理，37。C继续培养48小时，80%丙酮固定细胞，用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数。以能够抑制50%特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。1.7.病理学检查按常规方法进行病理解剖，观察脏器病理变化，并采集肺脏、脾脏、淋巴结等脏器4%福尔马林固定后，制备石蜡切片，HE染色，显微镜观察组织病变。2.结果2.1.疫苗安全性5批疫苗分别做最小日龄仔猪一次单剂量接种以及仔猪单剂量重复接种和仔猪一次超剂量接种后均表现发育良好，精神状态、食欲正常，无体温升高和其他不良反应。证明该疫苗安全性良好。结果见表13。表l7日龄仔猪一次单剂量接种安全性试验结果8临床_平均体温('C)_平均体重(kg)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3仔猪一次超剂量接种安全性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.2.免疫猪PCV2抗体检测免疫后14天，免疫组均能检测到PCV2抗体；首免疫后35天，疫苗免疫组ELISA抗体和中和抗体效价分别达l:3200和l:32以上，而且，ELISA抗体和中和抗体水平基本一致。结果见表4。表4仔猪攻毒保护试验抗体检测结果首免后不同时间ELISA抗体平均值中和抗体平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.3.攻毒保护试验2.3.1.临床症状攻毒对照组所有猪攻毒后第13周体温升高(>40°C)，持续36天，攻毒后第10天出现被毛粗乱、食欲减退现象，第11天有1头死亡；空白对照猪在整个攻毒期中体温始终保持正常，无异常临床表现。0803、0804、0805、0806和0807批疫苗免疫的猪，攻毒后第1周均有23头猪出现体温超过4(TC，持续12天，但均未见到明显异常临床表现。5批疫苗保护效率分别100%、100%、100%、100%和100%。结果见表5。2.3.2.体重变化为了评价疫苗对猪体的保护效果，我们分别在攻毒前及宰杀时对猪体进行称重，计算猪的平均日增重。疫苗免疫组和空白对照组的相对日增重分别为0.0255、0.0250、0.0267、0.0245、0.0264和0.0268kg，表明疫苗免疫组猪相对日增重与空白对照组相似，但明显高于非免疫攻毒对照组(P<0.05)。证明疫苗均有较好免疫保护作用。2.3.3.病理变化攻毒后第11天，攻毒对照猪1头死亡，病理剖解表现为肺脏出血、弹性变低，腹股沟、髂下、颌下、肠系膜淋巴结肿胀、出血，脾脏边缘轻微出血等。试验结束时，扑杀所有试验猪，进行病理解剖和组织病理学检查。试验结果表明非免疫攻毒对照组猪有明显肉眼病理变化，淋巴结组织中淋巴细胞缺失、巨噬细胞浸润、包涵体病变；肺脏组织有单核细胞浸润；而免疫猪病理变化很不明显。结果见表6。表5攻毒后20天内猪临床症状统计结果组别临床症状攻毒后体温》40'C的天数攻毒后体温》发病否4(TC的头数保护率(%)疫苗0803正常053_100%疫苗0804正常023_100%疫苗0805正常052_100%疫苗0806正常033-100%'疫苗0807IE常022_薩o攻毒对照组异常※365+空白对照组正常00_※被毛粗乱，皮肤苍白，食欲减退，有死亡现象。表6攻毒猪病理变化统计结果11病理变化组别肺实变等淋巴结肿大肾有坏死点脾轻度肿大肠道鼓气等疫苗08032/51/50/50/51/5疫苗08041/50/50/50/50/5疫苗08052/51/50/50/51/5疫苗08061/50/50/50/50/5疫苗08071/50/50/50/50/5攻毒对照组5/55/54/53/54/5空白对照组0/50/50/50/50/53.另外，比较以本发明"大规模潮汐式细胞微载体悬浮培养系统"与常用转瓶培养系统，培养PK15细胞，以增殖猪圆环病毒，两系统细胞培养的病毒相关比较如表7所示。表7不同培养系统增殖猪圆环病毒的相关比较培养方式TideCell-020悬浮培养3000ml转瓶培养系统细胞贴壁面积528000cm21250cm2产量比值5l个微载体培养系统423个转瓶占地面积20m2150m2人工投入2个人x4h30个人x8h风险暴露点<20个423个耗材成本低.高清洗成本低高收获病毒液500L423><300ml=126.9L病毒毒价1065TCID50/ml1045TCID5o/ml操作工艺全自动微电脑控制程序繁琐备注BioNOCII载体贴壁面积lg=2400cm2，1个TideCell-020微载体悬浮培养系统需要加入BioNOCII载体220g。124.结论本研究用5批猪圆环病毒II型灭活疫苗接种仔猪，结果均无异常临床表现，安全性很好；仔猪免疫后14天产生ELISA抗体和中和抗体，首免后35天攻毒，无异常临床表现和病理变化，免疫保护效率达100%，免疫效果良好。且以本发明采用新的工艺参数运用潮汐式微载体细胞悬浮培养系统生产猪圆环病毒灭活疫苗无论是抗原含量、产量还是生产成本等指标，远优于常用转瓶培养系统。权利要求一种猪圆环病毒II型疫苗制备方法，包括下列操作步骤(1)将制苗用宿主细胞接种到含有生长用培养液与微载体的载体罐内，并将上述细胞与微载体混合均匀，使细胞贴附在微载体上；在适当培养环境下，提供上述细胞生长足够的养分及气体环境，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的5～40倍；(2)将细胞生长用培养液更换为维持用培养液，并同步加入猪圆环病毒II型种毒，先使其吸附在细胞上，然后进行培养，增殖病毒；(3)培养24小时后将细胞维持液弃去，接种病毒的细胞以0.01mol/L的PBS充分洗涤，加入D-氨基葡萄糖孵育30min；(4)弃去D-氨基葡萄糖，将细胞以0.01mol/L、pH为7.4的PBS充分洗涤，加入细胞维持液继续培养细胞；(5)连续培养10天后，收获病毒液，于-20℃冻融两次，得到猪圆环病毒II型病毒液；(6)病毒液经检验合格后，加入甲醛灭活，灭活后的猪圆环病毒II型加入常规油性佐剂或双相佐剂，搅拌混匀，制得油乳剂疫苗或双相疫苗。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的宿主细胞为可增殖猪圆环病毒病毒II型的细胞系。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于细胞、病毒的增殖方法采用潮汐式微载体悬浮培养方式。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)、(2)中培养细胞时启动贴附程序4h后换成培养程序，细胞贴附程序参数为up:23002700mL/minhold4075s、Down:23002700mL/minhold3060s、设定最大换液量18500ml;细胞培养程序参数为up:17002100mL/minhold4075s、Downl7002100mL/minhold4075s、设定最大换液量18000ml。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于接种病毒时启动病毒吸附程序4h后换成病毒增殖程序，病毒吸附程序参数为卯14001800mL/minhold4075s、Down:14001800mL/minhold3060s、设定最大换液量18500ml;病毒增殖程序参数为up:9001200mL/minhold4075s、Down9001200mL/minhold4075s、设定最大换液量18000ml。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的微载体为聚酯纤维。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述微载体用量为每500ml培养液添加5.5g微载体，细胞的初始接种量为1.42.6Xl()7cells/g微载体。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于细胞培养的环境为温度37t:，0)2浓度为5%，培养液pH值为7.07.6。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述接种病毒时细胞密度为1.12.OX108cells/g微载体。10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述接种病毒时按病毒感染复数为0.011的比例。全文摘要本发明公开了一种猪圆环病毒II型(PCV2)灭活疫苗大规模生产及其制备方法，包括如下技术步骤(1)制苗用细胞高密度培养；(2)制苗毒液的繁殖；(3)加入佐剂制备灭活疫苗。与现有技术相比，本发明具有病毒产量高、毒价高、生产规模大、单批次产量高、生产成本相对较低、产品质量高且稳定、操作方便、操作空间小、工艺参数控制精确等优点。本发明灭活疫苗具有较好安全性，并可以诱导猪体产生免疫保护效果，完全符合国家生物制品标准。文档编号C12N7/00GK101773667SQ20101010203公开日2010年7月14日申请日期2010年1月28日优先权日2010年1月28日发明者乔荣岑,习向锋,孙进忠,张海洋,张许科,彭伍平,李三,陶家权申请人:洛阳普莱柯生物工程有限公司