一种抗白粉病近等基因系Brock/京411⁷的遗传检测方法

专利名称：一种抗白粉病近等基因系Brock/京411⁷的遗传检测方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术工程，涉及抗白粉病近等基因系配制，更具体的说是涉 及小麦Brock抗白粉病近等基因系遗传背景的分子检测与应用。
背景技术：
近等基因系(Near-isogenic Lines, NIL)是由Yong等提出的，指的是遗传背景 相近，目标基因不同的一组品系(Young N D, Zamir D G, Tanksley S D. Use of isogenic lines andsimultaneoue probing to identify DNA markers tightly linked to the TM-Za gene in tomato. Genetics. 1988，120 :579_585)，它可以用于基因多效性分析、目 标基因分离、基因精细定位和克隆等研究(田清震，周荣华，贾继增.小麦抗白粉病近等 基因系遗传背景的分子检测.作物学报，2004，30 (3) :205-209;张毅，李云峰，谢戎，杨正 林，钟秉强，沈福成，谭自俊，何光华.水稻小穗簇生性近等基因系的构建及其近等性评 价.作物学报，2006，32 (3) :397-401)，因此，是遗传学及育种研究的珍贵材料。通过杂交 和多代回交已培育了包括抗病性在内的许多目标性状的NIL，并应用于各自的相关领域研 究中([BorbalaD, Harrach J F，Miklos P，et al. Antioxidant ethylene and membrane leakage responses topowdery mildew infection of near-isogenic barley lines with various types of resistance. European Journal of Plant Pathology.2008， 121 :21_33 ；Mumtaz S，Khan I A，Ali S，et al. Development of RAPD based markers for wheat rust resistance gene cluster(Lr37_Sr38_Yrl7)derived from Triticum ventricosum L.African Journal of Biotechnology. 2009，8(7) : 1188-1192 ；Zhu S， Walker D R，Boerma H R，et al. Effects of defoliating insectresistance QTLs and a crylAc transgene in soybean near-isogenic lines. Theoretical andApplied Genetics. 2008，116 :455_463 ；Brevis J C，Chicaiza 0，Khan I A，et al. Agronomicand quality evaluation of common wheat near-isogenic lines carrying the Leaf Rust ResistanceGene Lr47. Crop Science.2008,48,1411-1451. Zhou R H, Zhu Z D， Kong X Y，Huo N X，Tian Q Z，Li P，Jin C Y，Dong Y C，Jia J Z. Development of wheat near-isogenic lines forpowdery mildew resistance.Theoretical and Applied Genetics. 2005，110 :640_648)。但NIL的培育与选择需7_8年时间，周期长，而选择效率 的评价指标是回交代数和外观形态，这种方法容易受发育和环境条件影响，选择效率低。 分子水平上跟踪和评价NIL遗传背景，可靠性高，不受发育和环境条件制约，因此，可以提 高NIL的培育进程和选择效率。栽培小麦Brock中含有一个抗白粉病新基因(Wang Z Y， Zheng Q，Peng Y K，et al.Identification of random amplified polymorphic DNA and simple sequence repeat markerslinked to powdery mildew resistance in common wheat cultivar Brock. Plant ProductionScience，2004，7(3) 318-322 ；Wang Z Y，Zhao P，Chen H，et al. Identification of RAPDmarkers and development of SCAR markers linked to a powdery mildew resistance gene， andtheir location on chromosome inwheat cultivar Brock. Plant Production Science, 2005,8 (5) :578_585)。中国农业大学 以Brock为供体，和农业性状优良的小麦品系015杂交后，后代与优良品 种京411杂交，获 得抗白粉病的F1，与京411为轮回亲本再次杂交，后代用京411回交，并在白粉菌胁迫下选 择，配制了近等基因系Brock/015//京4117。本发明以Brock为抗白粉病基因供体亲本，直接和优良品种京411，通过杂交、回 交和白粉菌胁迫下的个体选择，配制了抗白粉病近等基因系Brock/京4117。并利用AFLP方 法，对本发明配制的近等基因系Brock/京4117的遗传背景进行了检测，该检测在抗白粉病 基因供体亲本Brock、轮回亲本京411和近等基因系Brock/015/京4117和Brock/京4117 之间进行。结果发现有4种AFLP谱型“亲二型”、“偏抗病供体Brock型”、“偏轮回亲本京 411型”和“交换型”被检测到，它们能反映出近等基因系中双亲遗传背景。同时，对2对近 等基因系中与抗病基因相连锁分子标记进行了筛选，获得紧密连锁分子标记P15/M14-160。 上述对近等基因系遗传背景的检测，会使其能在抗病遗传机理研究和农业上应用发挥更好 作用。

发明内容
本发明的目的在于用对白粉菌免疫的小麦品种Brock为抗白粉病基因供体亲本， 以农艺性状优良的品种京411为轮回亲本，配制抗白粉病近等基因系，通过AFLP检测技术， 检测近等基因系与双亲间的遗传背景，从而获得可靠的抗白粉病近等基因系，用于小麦的 抗白粉病育种、抗病基因因克隆及抗病分子机理研究。为实现上述目的，本发明提供如下的 技术方案一种抗白粉病近等基因系Brock/京4117遗传检测方法，其特征在于包括如下步 骤DAFLP分析参照所用接头和引物见表1 ；表1 AFLP分析所用接头和引物
接头与引物 序列
Pst I 接头 5’ CTCGTAGACTGCGTACATGCA3’
3' CATCTGACGCATGT 5' Mse I 接头 5' GACGATGAGTCCTGAG3' 3' TACTCAGGACTCAT5' 5， GACTGCGTACATGCAG3， 预扩增引物 5’ GATGAGTCCTGAGTAA3，
5’ -GACTGCGTACATGCAG ANN 或 GNN_3;~ 5’ -GATGAGTCCTGAGTAACNN-3’
选择性扩增引物注下画线部分为选择碱基，N为任意碱基A、G、T、C
2)基因组 DNA 双酶切及接头连接100XBSA 0. 2μ 1, NEB buffer 4. 0μ 1, Pst I(20U/y 1)0. 25 μ 1, Mse I(10U/μ 1)0. 5 μ 1, Pst I 接头(5ρΜ) 1· 0 μ 1，Mse I 接头 (50ρΜ) 1· 0μ 1，Τ4 DNAligase 0. 4μ 1,10ΧΤ4 buffer 2· O μ 1，DNA(100ng/μ 1) 5· O μ 1， ddH20补齐40 μ 1。37 °C条件下保温8个小时；3)预扩增反应体系为25 μ L，内含IyL连接产物，0.6pmol/L引物，IOXPCR缓冲 液 2. 5μ L，0. 2mmol/L 的 dNTPs，IU Taq 聚合酶。PCR 扩增程序为 94°C 2min ；94°C 35S,56°C 35S，72°C 60S, 30个循环；72°C 5min。预扩增产物用琼脂糖电泳检测，稀释20倍保存
备用；
4)选择性扩增选择性扩增体积为20 μ L，AFLP选扩体系Pst I接头引物(50ng/ μ L) 0· 8 μ L，Mse I 接头引物(50ng/μ L) 0. 8 μ L, IOXBuffer 2. 0 μ LjMgCl2 (25mM) L 2 μ L， dNTP (IOmM) 0. 45 μ L, TaqE (5U/ μ L) 0· 2 μ L，模板 DNA 2. 0 μ L, ddH20 补齐 20 μ L ；PCR 扩增采 用递降式方法，其程序为94°C 2min -MV 35S，65°C 35S，72°C 30S,以后每个循环退火温度 降低 0. 7°C，共 12 个循环；然后 94°C 35S，56°C 35S, 72°C, 60S, 30 个循环；最后 72°C 5min。 扩增在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行。5)扩增产物的检测扩增产物加等量loading Buffer (98 %甲酰胺；IOmM EDTA(pH8. 0) ；0.25%溴酚兰；0. 25%二甲苯青)，95°C变性5min，立即于冰浴待用；用6% 的变性聚丙烯酰胺凝胶(含6mol/L尿素)电泳分离，银染法显示电泳图谱。6)遗传背景分析以两个近等基因系(Brock/015//京4117 ；Brock/京4117)和供 体亲本Brock及轮回亲本京411为材料，用表2中随机选取225对AFLP引物组合，用上述 酶切连接、预扩增、选择扩增及扩增产物检测体系进行AFLP分子检测，结果有4种亲二型、 偏抗病供体Brock型、偏轮回亲本京411型和交换型被检测到。表2 AFLP标记的弓丨物组合
权利要求
一种抗白粉病近等基因系Brock/京4117遗传检测方法，其特征在于包括如下步骤1)AFLP分析参照所用接头和引物见表1；2)基因组DNA双酶切及接头连接100×BSA 0.2μl，NEB buffer 4.0μl，Pst I(20U/μl)0.25μl，Mse I(10U/μl)0.5μl，Pst I接头(5pM)1.0μl，Mse I接头(50pM)1.0μl，T4DNAligase 0.4μl，10×T4buffer 2.0μl，DNA(100ng/μl)5.0μl，ddH2O补齐40μl。37℃条件下保温8个小时；3)预扩增反应体系为25μL，内含1μL连接产物，0.6pmol/L引物，10×PCR缓冲液2.5μL，0.2mmol/L的dNTPs，1U Taq聚合酶。PCR扩增程序为94℃2min；94℃35S，56℃35S，72℃60S，30个循环；72℃5min。预扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，稀释20倍保存备用；4)选择性扩增选择性扩增体积为20μL，AFLP选扩体系PstI接头引物(50ng/μL)0.8μL，Mse I接头引物(50ng/μL)0.8μL，10×Buffer 2.0μL，MgCl2(25mM)1.2μL，dNTP(10mM)0.45μL，TaqE(5U/μL)0.2μL，模板DNA 2.0μL，ddH2O补齐20μL；PCR扩增采用递降式方法，其程序为94℃2min94℃35S，65℃35S，72℃30S，以后每个循环退火温度降低0.7℃，共12个循环；然后94℃35S，56℃35S，72℃，60S，30个循环；最后72℃5min。扩增在MJ Research PTC 200型PCR仪上进行。5)扩增产物的检测扩增产物加等量loading Buffer(98％甲酰胺；10mM EDTA(pH8.0)；0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯青)，95℃变性5min，立即于冰浴待用；用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶(含6mol/L尿素)电泳分离，银染法显示电泳图谱。6)遗传背景分析以两个近等基因系(Brock/015//京4117；Brock/京4117)和供体亲本Brock及轮回亲本京411为材料，用表2中随机选取225对AFLP引物组合，用上述酶切连接、预扩增、选择扩增及扩增产物检测体系进行AFLP分子检测，结果有4种亲二型、偏抗病供体Brock型、偏轮回亲本京411型和交换型被检测到。
2.权利要求1所述的遗传检测方法，其中抗白粉病近等基因系Brock/京4117的配制 在于以抗白粉病普通小麦Brock为抗病基因供体亲本，以农艺性状优良但不抗白粉病的 栽培小麦京411为轮回亲本，BrockX京411杂交，杂交组合为Brock/京411”，所得F1均 抗白粉病，用京411回交7代，自交1代育成抗白粉病近等基因系Brock/京4117;每一次的 杂交和回交，均在白粉菌胁迫下选择抗病单株。
3.一种采用AFLP方法与抗白粉病基因紧密连锁的分子标记P15/M14-160，其碱基序列为GCAGAAGTCGTTTACAATCAGGTCATAGTAGAAACTGTTGAAATCAAAAGGAAATGGGTGCGTGTTTTGAATTGAGACGTGTTAGTCGCTAAATCGAGGTGTCAAAGCGTCGTTCTGTTCTTATGATCGCTCGTTATGTGTTGCTGAAGAAAATGTGGTC。
全文摘要
本发明公开了抗白粉病近等基因系Brock/京4117配制、遗传背景的分子检测方法和与抗白粉病基因紧密连锁的分子标记P15/M14-160的核苷酸序列，属于农业生物基因工程领域。该近等基因系的获得是以抗白粉病普通小麦Brock为抗病基因供体亲本，以农艺性状优良但不抗白粉病的栽培小麦京411为轮回亲本，Brock×京411杂交后，F1再与京411连续回交7代，自交1代育成近等基因系Brock/京4117。每一次的杂交和回交，均在白粉菌胁迫下选择抗病单株。本发明用AFLP检测技术，发现有4种AFLP谱型亲二型、偏抗病供体Brock型、偏轮回亲本京411型和交换型被检测到，它们能反映出近等基因系中双亲遗传背景。
文档编号C12Q1/68GK101955988SQ20101010192
公开日2011年1月26日 申请日期2010年1月28日 优先权日2010年1月28日
发明者刘晓颖, 彭永康, 王振英, 陈宏 , 陈欧 申请人:天津师范大学