与大麦抗白粉病相关的HvMIR1及其应用
【专利摘要】本发明提供了与大麦抗白粉病相关的HvMIR1及其应用，属于基因工程领域与作物分子生物学领域。本发明的HvMIR1来源于大麦，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明发现在大麦表皮细胞中瞬时过表达HvMIR1能够使大麦细胞对白粉菌的小种专化抗性减低。本发明的与大麦抗白粉病相关的HvMIR1可用于大麦种质资源的改良及遗传育种领域，还可用于培育抗白粉病的大麦品种，具有良好的市场应用前景。
【专利说明】
与大麦抗白粉病相关的HvMIRI及其应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及作物分子生物学和分子育种领域，更具体地，涉及与大麦抗白粉病相 关的HvMIRI及其应用。
【背景技术】
[0002] 大麦是在全球广泛种植的主要粮食作物之一，其世界播种面积仅次于小麦、水稻 和玉米，位列第四。大麦可做食品、饲料和啤酒酿制原料，具有重要的经济价值。大麦白粉病 (barley powdery mildew)是大麦主要的真菌病害之一，由布氏白粉菌大麦专化型 (Blumeria graminis f.sp.hordei)引起。该病原真菌属子囊菌纲白粉菌目，主要在宿主大 麦叶片表皮细胞内专性活体寄生，可侵害大麦植株的地上部各器官，但以叶片和叶鞘为主， 发病重时大麦茎杆和穗部也受侵害(Jorgensen, 1994，Crit · Rev·Plant Sci ·)。大麦白粉病 多发生在潮湿和半潮湿地区，分布于世界各大麦产区。在欧洲各国、北美东部和南部地区、 日本等地，以及中国的贵州、四川和东南沿海等大麦种植区域均有普遍发生，一般可造成 20%-25%的产量损失，而在病害流行的年份里严重损失可达30%。近年来，由于大麦品种 单一化、高度密植和过量施用氮肥等栽培因素，使得大麦白粉病发病日趋严重。
[0003] 目前大麦白粉病的防治工作主要通过施用化学农药完成。大量使用化学杀菌剂会 对环境造成污染，并对人畜饮食安全和健康形成潜在的威胁。筛选、培育和种植抗病品种， 是防治大麦白粉病的另一重要途径，而发现和鉴定大麦抗白粉病基因则是抗病育种工作中 的重要一环。大麦对白粉病的抗性包括:一，依赖小种专化抗性抗病基因（如MLA基因）产生 的特异性抗性（Shen et al，2007，Science);二，依赖非小种专化抗性抗病基因（如mlo基 因）产生的广谱抗性(Acevedo-Garcia et al，2014，New Phytol·);三，依赖非小种专化抗 性抗病基因产生的部分抗性。通过传统育种方式和分子标记辅助筛选相结合，可以加速将 大麦白粉病抗病基因向栽培品种中导入。
[0004] 大麦白粉病菌具有许多生理小种;主栽的大麦抗病品种的白粉病抗性往往与当地 的白粉菌优势生理小种不同，因此不能产生有效的小种专化抗性。而且大麦白粉病菌变异 速度快，使得许多一时有效的小种专化抗性抗病基因在短时间内丧失抗性，成为选育和推 广大麦抗病品种过程中育种工作者一直未能解决的难题。抗源多样化是实现抗病性持久的 有效途径。为此通过生物学的方法克隆新的抗病基因，利用转基因的方法提高大麦对白粉 病的抗性是今后防治白粉病的有效策略之一。
[0005] 泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)介导的蛋白质降解在 调节机体内蛋白质水平和功能上发挥着重要的作用。该系统通过一个多步骤的反应过程， 利用多种不同功能的蛋白，将活化的泛素分子结合到待降解的蛋白上，形成具有多聚泛素 链的靶标蛋白。而蛋白酶体系统则可以识别泛素化的蛋白并将其降解。泛素-蛋白酶体系统 包括泛素、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3和26S蛋白酶体。蛋白泛素化通过三 步反应完成。第一步，泛素在ATP的作用下被泛素活化酶E1激活，泛素 C末端的甘氨酸结合到 E1的半管氨酸巯基上;第二步，泛素被转移到泛素结合酶E2的半胱氨酸巯基上；第三部，泛 素在泛素连接酶E3的作用下通过共价结合的方式连接到底物蛋白的赖氨酸残基上，形成单 泛素化或者多泛素化的底物。E3泛素连接酶决定着底物的特异性，在这个过程中发挥着重 要的作用。而目前还没有在大麦中通过泛素蛋白酶体系统调控大麦抵御白粉菌侵染的报 道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种与大麦抗白粉病相关的E3泛素连接酶及其编码基因。
[0007] 本发明的另一目的在于提供该E3泛素连接酶在大麦对白粉菌抗性中的用途。
[0008] 本发明首先发现一种E3泛素连接酶在白粉菌侵染大麦过程中的表达量发生明显 变化，该E3泛素连接酶命名为HvMIRl，其氨基酸序列是如下(a)或(b):
[0009] (a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010] (b)SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与抗病相关或具有转录激活活性的蛋白质。
[0011] 编码HvMIRl蛋白的基因属于本发明的保护范围。
[0012] 进一步，编码HvMIRl蛋白的基因的核苷酸序列为如下1)-3)中任意一种的核苷酸 序列：
[0013] (l)SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；
[0014] (2)在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
[0015] (3)与（1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
[0016] 下述1)-4)中任一种生物材料也属于本发明的保护范围：
[0017] 1)含有上述基因的表达盒；
[0018] 2)含有上述基因的重组载体；
[0019] 3)含有上述基因的转基因细胞系；
[0020] 4)含有上述基因的重组微生物。
[0021]本发明提供了克隆HvMIRl基因的引物对，其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0022]本发明在接种白粉菌的大麦叶片样品中利用Real-time qPCR的方法检测了 HvMIRl的表达丰度，发现HvMIRl的表达量在大麦-白粉菌亲和和非亲和相互作用中均显著 变化。
[0023] 本发明提供了特异地检测HvMIRl表达量的引物对，其序列如SEQ ID N0.7和SEQ ID NO .8所示。
[0024]本发明通过基因枪介导的方法在大麦表皮细胞中表达HvMIRl-mYFP，发现其在细 胞质有定位。
[0025]本发明利用基因枪的方法在大麦表皮细胞中瞬时过表达HvMIRl，发现在非亲和互 作中大麦对白粉菌的抗性降低，表现为白粉菌的吸器指数显著升高，说明HvMIR1负调大麦 对白粉菌的小种专化抗性。
[0026]本发明提供了上述HvMIRl蛋白或编码该蛋白的基因或上述生物材料在调控植物 抗真菌病中的应用。
[0027]优选地，所述植物为大麦。
[0028]本发明提供了上述HvMIRl蛋白或编码该蛋白的基因或上述生物材料在植物种质 资源改良中的应用。
[0029]优选地，所述植物为大麦。
[0030]本发明提供了上述HvMIRl蛋白和编码该蛋白的基因在制备抗病转基因植物中的 应用。
[0031]具体地，是将HvMIRl基因功能失活以提高植物的抗病能力。
[0032]所述抗病为抗大麦白粉病，所述植物为大麦。
[0033]进一步地，所述大麦白粉病的病原菌为大麦白粉菌生理小种K1、A6。
[0034]本发明通过对HvMIRl的表达谱分析，发现HvMIRl在白粉菌侵染大麦过程中表达量 显著上升，说明HvMIRl参与大麦防御白粉菌侵染的过程并发挥其生物学功能;本发明通过 大麦表皮细胞中瞬时表达HvMIRl发现HvMIRl在细胞质定位。通过大麦表皮细胞瞬时过表达 HvMIRl并接种非亲和白粉菌，发现大麦对白粉菌的抗性显著减弱，说明HvMIRl负向调控大 麦对白粉菌的抗性。本发明提供的HvMIRl可广泛应用于大麦遗传育种、种质资源改良和培 育抗白粉病的转基因植物领域，对改进和改良大麦等作物的种质资源具有重要作用。
【附图说明】
[0035]图1为大麦表皮细胞中过表达HvMIRl对大麦白粉病菌抗性的影响。，大麦HvMIRl基 因负向调控MLA抗病蛋白介导的大麦白粉菌小种专化抗性。在抗病蛋白MLA1的遗传背景下， 图1的A图显示过表达HvMIRl增强了大麦白粉菌无毒生理小种K1的侵染能力。而在抗病蛋白 MLA10的遗传背景下，图1的B图显示过表达HvMIRl增强了大麦白粉菌无毒生理小种A6的侵 染能力。
[0036]图2为白粉菌侵染对大麦HvMIRl表达水平的影响图。HvMIRl基因的表达被白粉菌 菌株K1和A6所诱导。以含有Mlal的近等基因系P01作为检测材料，分别接种亲和菌株A6和非 亲和菌株K1，检测HvMIRl在白粉菌侵染后的表达谱变化，检测结果发现，HvMIRl不管是在亲 和背景还是非亲和背景下，其表达均能够被白粉菌诱导。其表达趋势为前期下降，后期上 升。
[0037] 图3为HvMIRl定位于细胞质的结果图。HvMIRl定位于细胞质中。将HvMIRl与mYFP蛋 白融合后通过基因枪瞬时表达，将HvMIRl在大麦叶表皮细胞中表达，通过荧光显微镜观察 HvMIRl的蛋白定位情况，检测发现HvMIRl主要定位于细胞之中，其中GFP作为阴性对照。
【具体实施方式】
[0038]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 [0039]若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中使用的大麦品种为P01和P09,记载 在Shen et al，2007, Science中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所（以下简称 为"中科院遗传所"）获得；大麦白粉菌（Blumeria graminis f · sp.hordei)生理小种K1和A6 记载在Shen et al，2003，Plant Cell中，公众可从中科院遗传所获得;CTAP载体记载在Bai et al，2012，PLoS Pathog.中，公众可从中科院遗传所获得;pUbi载体记载在Shen et al, 2003，Plant Ce 11中，公众可从中科院遗传所获得。
[0040] 实施例lHvMIRl基因的获得
[0041] 1、植物材料的准备。大麦品种P01种子播种后，待长至1周左右，剪下旗叶，保存于 液氮中。
[0042] 2、植物总RNA的提取。在液氮中迅速研磨300mg大麦叶片至粉末状，加入lml TRizol，充分震荡混匀后于4°C12,000rpm离心10min;上清转移到新离心管中，加入1/ 5TRizol体积的氯仿，混勾后室温静置3min等待其分层，之后于4°C12,000g离心15min。上清 转移到新离心管中，先加入上清体积10%的3M醋酸钠 (pH 5.2)，混匀后再加入上清体积1倍 的异丙醇，混匀后于_20°C中静置10，000g离心15min，弃上清，用75 %乙醇洗涤沉 淀两次，每次室温静置l〇min，之后4°C7500rpm离心5min，沉淀在室温下瞭置10min。用60μ1 DEPC水溶解沉淀，获得的植物总RNA。
[0043] 3、反转录获得cDNA
[0044] (1)反转录体系及过程：
[0045] RNA 2·5μ1
[0046] 01ig〇-dT ΙμL
[0047] DEPC-H2O 6.5μ1
[0048] 离心管混合上述溶液，70 °C 5min，冰上再放置5min。
[0050] 离心管继续加入上述溶液，48°C温浴lh，70°C15min，4°C10min。
[0051 ] 反转录产物加入25μ1 ddH20,取ΙμL进行后续PCR反应，得到cDNA。
[0052] (2)克隆 HvMIRl
[0053] PCR扩增所需引物如下：
[0056] PCR 体系
[0060] 得到113 lbp的PCR产物，将该PCR产物送去测序，结果为该PCR产物具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸，该序列所示的基因命名为HvMIRl，编码区为序列表中序列1自5'末端第 1-1131位核苷酸;该基因编码的蛋白命名为HvMIRl，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所 不。
[0061] 实施例2HvMIRl基因在抗白粉病中的作用
[0062] 1、载体构建
[0063] 1)以实施例1得到的PCR产物(或者人工合成序列1)为模板，用下述引物F和R进行 PCR扩增，得到约113 lbp的PCR产物。
[0068] 上述PCR体系如下：
[0072] 2)用上述PCR产物与pDN0R201载体(购自Invitrogen公司）进行BP反应，得到ENTRY 载体。
[0073] 上述 BP 反应体系：PCR 产物 75ng，pDN0R201 75ng，BP 酶 0.5以1。25。(：过夜。
[0074] 3)将上述ENTRY载体与pUbi-Adaptor-NOS载体进行LR反应，生成pUbi-HvMIRl载 体。
[0075] LR反应体系：ENTRY载体 75ng，pUbi-gate 载体 75ng，LR酶 0 · 5μ1。25 Γ 过夜。
[0076] pUbi-HvMIRl载体通过测序鉴定，该载体为将序列表中的序列1插入pUbi-Adap tor-NOS载体中得到的载体。
[0077] 2、基因枪瞬时超表达试验
[0078] 1)金粉的制备
[0079] (1)称取9mg (w)金粉放在离心管中，65 °C放置4h以上。
[0080] (2)加入70%乙醇，漩涡振荡8min，静止15min。
[0081] (3)2000r/min 离心 2s，去掉上清液。
[0082] (4)加 lml消毒蒸馏水，旋祸振荡2min，静止1分钟，2000rpm/min离心2s，弃掉上清 液。
[0083] (5)重复（4)三次。
[0084] (6)在沉淀的金粉中加入50 %甘油，漩涡振荡。
[0085] 2)DNA子弹的制作
[0086] (1)振荡50 %甘油中的金粉5分钟，使之成为悬浮液。
[0087] (2)取50μ1的悬浮液于离心管中。
[0088] (3)加入5μ1的质粒DNA(2yg)，边振荡便加入50μ1 CaCl2水溶液(2 · 5Μ)，振荡中再 在小管加入20μ1亚精胺(0.1M)，振荡3分钟，之后静置lmin，2000rpm/min离心2s，去掉上清 液。
[0089] (4)加入140μ1 70 %的乙醇，漩涡振荡，使沉淀均匀散开，则离心（2000rpm/min 2s)，弃掉上清液。
[0090] (5)加入140μ1 100 %的乙醇，漩涡振荡，使沉淀均匀散开，则离心（2000rpm/min 2s)，弃掉上清液。
[0091] (6)加入12μ1 100%的乙醇，漩涡振荡，使沉淀均匀散开。
[0092] 3)基因枪轰击转化方法
[0093] 基因枪介导的方法:分别将大麦Ρ01、Ρ09种子土播种植后，待长至一周左右，剪下 旗叶，叶面朝上，放置于含有培养基（1 %的琼脂，l〇〇mg/L苯丙咪唑）的培养皿上，恢复4h，得 到大麦P〇 1靶材料、P09靶材料，备用基因枪轰击；
[0094] 将目的质粒pUbi-HvMIRl和质粒pUbi-GUS按1:1摩尔比充分混合，包裹在直径为1μ m金粉微粒上，采用PDS-1000/He (美国Bio-Rad)分别轰击大麦Ρ01靶材料、Ρ09靶材料，得到 轰击后大麦P01叶片、轰击后大麦P09叶片;基因枪轰击参数为:阻挡网与轰击材料之间的距 离为5 · 5cm，可裂膜压力为900Pa 〇
[0095]基因枪轰击完毕后，将轰击后大麦P01叶片、轰击后大麦P09叶片放入培养箱中恢 复培养4h(培养条件22°C、16h光照/18°C8h黑暗），得到转入pUbi-HvMIRl和pUbi-GUS的大麦 P01叶片（HvMIRl)和转入pUbi-HvMIRl和pUbi-GUS的大麦P09叶片（HvMIRl)，4h后分别进行 接大麦白粉菌K1和A6。
[0096]上述接种方法如下:接种方法为:将孢子抖落在大麦叶片上，保证2个孢子/mm2。
[0097] 将上述接种K1的各种大麦叶片和接种A6的各种大麦叶片均培养48h(培养条件22 °C、16h光照/18°C8h黑暗），进行⑶S染色，37°C过夜，染色完毕后进行脱色，两天后利用显微 镜进行细胞观察。
[0098] 统计表达GUS的细胞中感病细胞的比例来计算吸器指数，根据吸器指数来判断基 因 HvMIRl的功能。吸器指数越低，说明抗性越高。
[0099]抗病细胞的判断标准:细胞内表达GUS，且细胞内不含有吸器，而细胞表面附着有 分生孢子的细胞为抗病细胞
[0100] 感病细胞的判断标准:细胞内表达GUS，且细胞内含有吸器的细胞为感病细胞。
[0101] 吸器指数的计算公式:吸器指数=感病细胞的个数/(抗病细胞的个数+感病细胞 的个数）X100 %。由此可见植物细胞越抗病，吸器指数越低;越感病，吸器指数越高。
[0102] 以转入pUbi-Adaptor-NOS和pUbi-GUS的大麦叶片作为空对照(EV)。实验设3次重 复，结果取平均值。
[0103] 结果如图1所示，
[0104] 转入pUbi-Adaptor-NOS和pUbi-GUS的大麦P01叶片的吸器指数为19.18% ;
[0105] 转入pUbi-HvMIRl和pUbi-GUS的大麦P01叶片的吸器指数为41.60% ;
[0106] 转入pUbi-Adaptor-NOS和pUbi-GUS的大麦P09叶片的吸器指数为15.86%;
[0107] 转入pUbi-HvMIRl和pUbi-GUS的大麦P09叶片的吸器指数为46.56% ;
[0108] 结果显示，在大麦叶片中过表达HvMIRl后，吸器指数明显上升，说明过表达HvMIRl 会减弱大麦白粉病菌的抗性，也就是HvMIRl在大麦的白粉病抗性中发挥负调控作用。
[0109]实施例3HVMIR1的亚细胞定位和受白粉菌诱导的表达模式分析 [0110] 一、HvMIRl的亚细胞定位
[0111] 1、载体构建
[0112] 1)以实施例1得到的PCR产物(或者人工合成SEQ ID勵.2)为模板，用下述引物卩和 R进行PCR扩增，得到约1.2Kb的PCR产物。
[0117] 2)用上述PCR产物与pDN0R201载体（购自Invitrogen公司）进行BP反应，得到 ENTRY-1 载体。上述 BP反应体系：PCR 产物 75ng，pDN0R201 75ng，BP酶 0.5μ1。25 °C 过夜。
[0118] 3)将上述 ENTRY-1 载体与 pUbi-GW-mYFP 载体 LR 反应，生成 pUbi-HvMIRl-mYFP 载体。
[0119] LR 反应体系：中间载体 7 5ng，pUbi-GW-mYFP 载体 7 5ng，LR 酶0 · 5μ1。25 °C过夜。
[0120] pUbi-HvMIRl-mYFP载体通过测序鉴定，该载体为将序列表中的序列1插入pUbi-GW-mYFP载体中得到的载体。
[0121] 2、基因枪介导的单细胞瞬时转化技术鉴定HvMIRl的亚细胞定位情况
[0122] 大麦P01种子土播种植后，待长至一周左右，剪下旗叶，叶面朝上，放置于含有培养 基（1 %的琼脂，l〇〇mg/L苯丙咪唑）的培养皿上，恢复4小时后进行基因枪轰击;将目的质粒 pUbi-HvMIRl-mYFP包裹在直径为Ιμπι金粉微粒上，采用PDS-1000/He (美国Bio-Rad)轰击靶 材料，基因枪轰击参数为:阻挡网与轰击材料之间的距离为5.5cm，可裂膜压力为900Pa。
[0123] 基因枪轰击后叶片放置于植物培养室正常生长36h后在共聚焦显微镜不同荧光通 道观察HvMIRl的亚细胞定位情况。
[0124] 结果如图3所示，HvMIRl主要定位于细胞质中，其中GFP作为对照。
[0125] 二、HvMIRl受白粉菌诱导的表达模式分析
[0126] 大麦P01种子播种后，待长至一周左右，剪下旗叶，叶面朝上，放置于含有培养基 (1 %的琼脂，l〇〇mg/L苯丙咪唑）的培养皿上，恢复24小时，分别接种大麦白粉病菌生理小种 K1或A6;分别在接种后不同时间点取材，提RNA，反转录(体系与方法同上），反转录产物稀释 10倍，取2μ1进行Real time PdReal time PCR体系及程序参照promega公司试剂盒 GoTaq-qPCR Master Mix(目录号A6001)操作说明。以未接种的大麦P01为对照。
[0127] Real time PCR的引物如下：
[0130] Real time PCR体系如下：
[0132] Real time PCR程序如下：95°(：1〇111丨11，95°(：1586(3,60°(：1111丨11，40个循环。设置溶解 曲线:95 °C lOsec，65 °C lmin，0.3 °C阶梯升温，读荧光值，升温至95 °C结束。
[0133] 结果如图2所示，大麦白粉病菌生理小种K1和A6接菌处理均能够影响HvMIRl的表 达，接菌4-12h后表达量降低，达到未接菌时的一半，24h后开始上升，到48h最高，达到未接 菌时的2倍，达到4-12h时的4倍。
[0134] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种蛋白HvMIRl，是如下(a)或(b): (a) 由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且与抗病相关或具有转录激活活性的蛋白质。2. 编码权利要求1所述蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列为如下1)_3)中任意一种的 核苷酸序列： (1) SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列； (2) 在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； (3) 与（1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。3. 下述1)-4)中任一种生物材料： 1) 含有权利要求2所述基因的表达盒； 2) 含有权利要求2所述基因的重组载体； 3) 含有权利要求2所述基因的转基因细胞系； 4) 含有权利要求2所述基因的重组微生物。4. 权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的生物材料在调控 植物抗真菌病中的应用。5. 权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的生物材料在植物 种质资源改良中的应用。6. 权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在制备抗病转基因植物中的应用。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，将权利要求2所述的基因功能失活以提高植 物的抗病能力。8. 如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述抗病为抗大麦白粉病，所述植物为大 麦。9. 克隆权利要求2所述基因的引物对，其特征在于，含有SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸 序列。10. 特异性检测权利要求2所述基因的引物对，其特征在于，含有SEQ ID NO.7-8所示的 核苷酸序列。
【文档编号】C12N9/00GK105886479SQ201610286959
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】王涛, 沈前华, 常诚, 谷成
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所