一种与苦瓜抗白粉病基因紧密连锁的分子标记及其应用
【专利摘要】本发明是以抗病苦瓜MC18和感病苦瓜MC105杂交构建苦瓜遗传分离群体，利用简化基因组深度测序技术，共获得91,856个SLAF标签，筛选到29个与苦瓜白粉病抗性密切相关的差异标记。使用本发明的分子标记标号为SLAF4542，利用四引物扩增受阻突变体系PCR，在苦瓜白粉病抗性鉴定中，在高感和感病苦瓜鉴定中扩增出356bp和326bp的两条特异片段，而在高抗苦瓜鉴定中只扩增出326bp的特异片段。该标记在F2代分离群体中的检出率达到98％以上，可在苗期白粉病未发病前对苦瓜育种材料中的抗白粉病基因进行分子标记辅助选择，有效的克服了常规育种的不足，简化选择方法和提高育种效率，加快了苦瓜抗病育种的进程。
【专利说明】
一种与苦瓜抗白粉病基因紧密连锁的分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物分子遗传学技术领域，具体涉及一种与苦瓜抗白粉病基因紧密连 锁的分子标记及其该分子标记在苦瓜抗白粉病育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 苦瓜(Momordica charantia L.)为萌芦科苦瓜属一年生攀缘草本植物，具较高的 营养价值和食疗功效。近年来，苦瓜种植面积不断增加，已成为"南菜北运"的主要蔬菜品种 和特色产业。白粉病是瓜类蔬菜广泛发生的一种世界性病害，从苗期至收获期均可发生。近 年来，随着瓜类蔬菜种植面积的增加和规模化发展，白粉病已成为导致减产和果实品质下 降，阻碍绿色生产的主要病害之一。如在广西苦瓜种植基地五塘镇，年栽培面积近2万亩，年 产量超过4500万公斤，而白粉病的发病率高达90%以上，因白粉病导致的产量损失近1000 万公斤，经济收益损失达1500万元，导致严重的经济损失。
[0003] 白粉病在苦瓜田间生长的各个时期均可发生，在苗期发病可造成苦瓜生长势减 弱，发育迟缓;在开花期发病可导致苦瓜减产20-40 % ;在结瓜期发病，会导致植株叶片枯 黄，果实生长缓慢，植株早衰，严重影响果实的品质和产量。农户在防治白粉病的过程中耗 费了大量的劳动力和农资，过度使用的农药对产品质量及环境都造成极大的损害，因此，培 育出抗病品种是防御白粉病的一条最安全、经济、有效的途径。
[0004] 由于白粉病菌只能采用活体保存，发病程度容易受环境影响等特点，给抗病性鉴 定带来极大不便，传统抗病育种周期长，需要大量及多代配置杂交组合及接种白粉病观察， 严重阻碍了瓜类蔬菜抗白粉病品种选育进程。
[0005] 随着分子生物学技术的飞速发展，分子育种技术大大加快了抗病育种的进程，显 著缩短了抗病品种选育的周期。DNA分子标记技术因其具有多态性高、检测方便、快速、准确 等特点，在农作物抗病遗传育种中发挥了极其重要的作用。SLAF_seq(specific length amplified fragment sequencing)技术是由高通量测序技术发展而来。通过生物信息学进 行实验方案系统设计，构建SLAF-seq文库，筛选特异长度DNA片段，以高通量测序技术获得 海量序列，利用软件进行数据分析比对，获得大量特异DNA片段，进而依据其序列发展出特 异分子标记。SLAF-seq技术具有通量高、准确性高、成本低、周期短等突出优势，依其测序结 果可直接开发大量特异分子标记。该技术可用于单体型图谱、遗传图谱、关联性图谱、多态 性图谱的构建，为分子育种、系统进化、种质资源鉴定提供重要技术保障。
[0006] 本发明利用SLAF-seq技术开发了一批特异性强、稳定性高的黄瓜白粉病抗性特异 分子标记，为育种中导入抗性优良基因进行分子标记辅助选择提供重要基础。
【发明内容】
[0007] 为解决上述问题，本发明提供了一种新型苦瓜SNP分子标记，可在苗期白粉病未发 病前对苦瓜育种材料中的抗白粉病基因进行分子标记辅助选择，有效的克服了常规育种的 不足，简化选择方法和提高育种效率，加快了苦瓜抗病育种的进程。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] -种与苦瓜抗白粉病基因紧密连锁的分子标记，所述的分子标记的标号为 SLAF4542,其具有如Seq ID N0.1所示的序列。
[0010] 作为优选，所述的分子标记是由引物对Primer Forward inner和Primer Reverse inner、引物对Primer Forward outer和Primer Reverse outer扩增得到的 D [0011] 作为优选，所述的引物对Primer Forward inner、Primer Reverse inner、Primer Forward outer和Primer Reverse outer分别具有Seq ID NO.2-5所;^:的序列D
[0012] 本发明还提供了一种苦瓜抗白粉病基因的PCR检测试剂盒，所述的PCR检测试剂盒 反应体系共 IOyL: 1.0 yL 浓度 30ng/yL 的模板 DNA;lymol. L-1 的Primer Forward outer 1·0μ L;Ιμπιο?·L_1的Primer Reverse outer I.OyL;IOymol.L_l的Primer Forward inner 1.0μ L; ΙΟμ mol · L_1 的Primer Reverse inner I · OyL; 10 X buffer I · OyL; 2m mol · L_1 的dNTP I · OyL; 50ymol · L-I的MgCl2O · 4yL; Taq酶0 · IyL; CldH2O 2 · 5yL，其特征在于，所述的引物对 Primer Forward inner和Primer Reverse inner、引物对Primer Forward outer和Primer Reverse outer分别具有Seq ID N0.2-5所不的序列。
[0013] 本发明还提供了所述的与苦瓜抗白粉病基因紧密连锁的分子标记在苦瓜白粉病 抗性鉴定中的应用，包括以下步骤：
[0014] (1)提取待检测苦瓜基因组DNA;
[0015] (2)以待检测苦瓜基因组为模板，利用权利3所述的引物对、权利4所述的反应体 系，进行PCR扩增反应；
[0016] (3)经电泳，如条带扩增出326bp的特异片段，则为高抗白粉病苦瓜;如条带扩增出 356bp和326bp的两条特异片段，则为高感白粉病苦瓜。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0018] 本发明是以抗病苦瓜MC18和感病苦瓜MC105杂交构建苦瓜遗传分离群体。本发明 利用简化基因组深度测序技术，共获得91，856个SLAF标签，筛选到29个与苦瓜白粉病抗性 密切相关的差异标记。其中使用所述的分子标记标号为SLAF4542,利用四引物扩增受阻突 变体系PCR，在苦瓜白粉病抗性鉴定中，在高感和感病苦瓜鉴定中扩增出356bp和326bp的两 条特异片段，在高抗苦瓜鉴定中只扩增出326bp的特异片段。该标记在F2代分离群体中的检 出率达到98%以上，可在苗期白粉病未发病前对苦瓜育种材料中的抗白粉病基因进行分子 标记辅助选择，有效的克服了常规育种的不足，简化选择方法和提高育种效率，加快了苦瓜 抗病育种的进程。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例中苦瓜简化基因组测序质量值分布图；
[0020] 其中，横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为单碱基的质量值。前SObp为双端测序 序列的第一端测序reads的质量值分布，后80bp为另一端测序reads的质量值分布。每个bp 代表测序所有reads的每个碱基，同一位置的各个质量颜色越深表示在数据中这个质量值 得比例越高。
[0021] 图2为本发明实施例中苦瓜简化基因组测序碱基含量分布图；
[0022] 其中，横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为碱基所占的比例；不同颜色代表不同 的碱基类型，绿色代表碱基A，蓝色代表碱基T，红色代表碱基C，橙色代表碱基G，灰色代表测 序中识别不出的碱基N。前80bp为双端测序序列的第一端测序Reads的碱基分布，后80bp为 另一端测序reads的碱基分布。每个bp代表测序的每个碱基，如第一 bp即表示该项目所有测 序reads在第一个碱基的A、T、G、C、N的分布情况。
[0023]图3为苦瓜白粉病危害田间症状；
[0024] 图4为本发明实施例中鉴定白粉病病情指数；
[0025] 其中，a病情指数为0级(整张叶片无粉斑）；b、c病情指数为1级(有少数粉斑，但粉 斑面积少于叶片面积的1/3) ;d病情指数为2级(粉斑增多占全叶面积的1/3-2/3) ;e病情指 数为3级(粉斑逐渐连接成片，所占面积超过叶面积的2/3) ;f、g病情指数为4级(粉斑铺满整 张叶片，碰触叶片，白粉振落）;h病情指数为5级(粉斑布满整张叶片，叶片开始黄化，逐渐枯 死)。
[0026] 图5为本发明实施例中高抗、高感苦瓜基因组DNA电泳图；
[0027]其中，泳道1为高抗白粉病苦瓜DNA;泳道2为高抗白粉病苦瓜DNA;泳道3为高抗白 粉病苦瓜DNA;泳道4为高抗白粉病苦瓜DNA;泳道5为高感白粉病苦瓜DNA;泳道6为高感白粉 病苦瓜DNA;泳道7为高感白粉病苦瓜DNA;泳道8为高感白粉病苦瓜DNA。
[0028]图6为本发明实施例中SLAF4542分子标记在亲本材料及其F2代单株中的扩增图 谱；
[0029] 其中，泳道1为DNAmarker 1000;泳道2为父本MC18(356bp);泳道3母本MC105 (356匕？，326匕？）；泳道4为高抗白粉病苦瓜册1 (356匕？）；泳道5为高抗白粉病苦瓜册3 (356bp);泳道6为高抗白粉病苦瓜HR17(356bp);泳道7为高抗白粉病苦瓜HR30(356bp);泳 道8为高感白粉病苦HS4(356bp，326bp)，泳道9为高感白粉病苦HS7(356bp，326bp)，泳道10 为高感白粉病苦HSl8(356bp，326bp)，泳道11为高感白粉病苦HS31 (356bp，326bp)。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此 外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同 样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0031] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 实施例1:
[0033]本发明实施例中以抗病材料MC18为父本、感病材料MC105为母本，根据其接种白粉 病后的抗/感表现，利用BSA法在构建的F2群体中，挑取30个抗白粉病和感白粉病的家系组 成抗/感白粉病池。材料均种植于广西农业科学院蔬菜研究所科研基地。将亲本MC18、MC105 及F2群体株系在可调控温度、湿度的智能温室内盆栽。于苦瓜幼苗一叶一心期，采用摩擦接 种法，接种浓度为I XIO4-I XIO6个孢子/mL。接种后每三天观察、记录一次发病情况，共记录 15天。然后根据抗/感白粉病的表现型结果，挑取高抗和高感的植株各30个组成抗/感白粉 病池。
[0034]本实施案例利用1580株?2群体，鉴定白粉病病情指数。病情指数的鉴定方法如下 (参见图4):
[0035] 0级:整张叶片无粉斑；
[0036] 1级:有少数粉斑，但粉斑面积少于叶片面积的1/3;
[0037] 2级:粉斑增多占全叶面积的1/3-2/3;
[0038] 3级:粉斑逐渐连接成片，所占面积超过叶面积的2/3;
[0039] 4级:粉斑铺满整张叶片，碰触叶片，白粉振落；
[0040] 5级:粉斑布满整张叶片，叶片开始黄化，逐渐枯死。
[0041] 计算病情指数：
[0042] 公式为:DI= 2(sini)/5NX100
[0043] DI =病情指数，si =发病级别，ni =相应发病级别的叶数，i =病情分级的各个级 别，N=调查总叶数。
[0044] 取两叶一心期的苦瓜嫩叶，采用改良的CTAB法提取其基因组DNA，稀释至60ngAxL， 经1%琼脂糖电泳检测浓度。利用酶切预测软件SLAF_PrediCt进行系统分析，根据其GC含 量、重复序列和基因特点等确定酶切方案、切胶范围及测序量，以保证分子标记的密度和均 匀性。
[0045] 根据选定的最适酶切方案，对检测合格的各样品基因组DNA分别进行酶切。对得到 的酶切片段(SLAF标签)进行3'端加 A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、 切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM 2500进行测序。
[0046] 利用Dual-index对测序得到的原始数据进行识别，得到各个样品的reads。过滤测 序reads的接头后，进行测序质量和数据量的评估。通过Control数据评估酶切效率，以此判 断实验过程的准确性和有效性。通过reads间聚类的方法，在亲本和混池中开发SLAF标签， 寻找在亲本中存在多态性的SLAF标签。
[0047] 本发明实施例共获得91，856个SLAF标签，其中父本的测序深度为19.Olx，母本的 测序深度为24.64x，多态性比例为5.99 %。对多态性SLAF标签进行关联分析，筛选到29个与 目标性状相关联的Marker。
[0048] 针对筛选到29个与目标性状相关联的Marker，进行功能验证和分析。
[0049] 利用四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra_primer amplification refractory mutation system PCR，Tetra_primerARMS PCR)进行引物设计和反应体系优化。
[0050] Tetra-primerARMS PCR是一种在普通PCR基础上发展起来的单核苷酸多态性分型 技术，归类于等位基因特异性PCR法。该方法解决了传统方法操作繁琐、分型通量低等问题， 具有操作简便、分型快速、费用低廉等特点，已广泛应用于医学等领域的研究，但利用该方 法对苦瓜的研究报道，目前还未查询到相关的文献资料。
[0051] 本发明实施例共设计12对Tetra-primerARMS PCR引物，其中使用所述的分子标记 标号为SLAF4542,在抗病苦瓜鉴定中扩增出356bp和326bp的两条特异片段，在高感和感病 苦瓜鉴定中只扩增出326bp的特异片段。该标记在F2代分离群体中的检出率达到98%以上， 可在苗期白粉病未发病前对苦瓜育种材料中的抗白粉病基因进行分子标记辅助选择。 [0052] 采用改良的CTAB法提取苦瓜基因组DNA，提取步骤如下：
[0053] (1)称取2g新鲜的苦瓜嫩叶，加入1 %的PVP在液氮下快速研磨成粉，待用；
[0054] (2)将研磨好的材料迅速加入到500yL 65°C充分预热的2 % CTAB提取液(2 %CTAB 提取液的配方为：IOOmM Tris-HCUpH 8.0,20mM EDTA，1.4M NaCL)中，并加入 20μLβ-巯基 乙醇，充分振荡混匀，在65°C下水浴2h，期间每隔IOmin将离心管上下颠倒混匀；
[0055] (3)取出后冷却至室温，加入等体积的氯仿-异戊醇，上下颠倒混匀使其乳化，4°C、 12 000r/min离心10min;
[0056] (4)吸取上清液于另一干净的离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，1-2min后出现白色絮状沉淀；
[0057] (5)4000r/min离心后将沉淀转移到盛有75%乙醇的离心管中洗涤2次，加入TE溶 解沉淀；
[0058] (6)加入5yLRNase A(约40-100yg)于37°C酶解30min以除去样品中含有的RNA;
[0059] (7)加入等体积的氯仿-异戊醇，混匀后10 OOOr/min离心10min，取上清液重复抽 提2次；
[0060] (8)加入400yL 5mol/L的NaCL，混匀后在冰上静置30min，然后10000r/min离心 IOmin，取上清液；
[0061 ] (9)加入2倍体积的无水乙醇，混匀后4°C放置20min，然后6 OOOr/min离心10min， 倒掉上清液，晾干；
[0062] (10)将沉淀用75 %的乙醇洗涤2次后用无水乙醇洗1遍，抽干后加入IOOyL TE缓冲 液溶解，保存于-20 °C冰箱中。
[0063]将提取的苦瓜基因组DNA进行浓度和质量检测，100V恒定电压下，1 %琼脂糖凝胶 电泳30分钟，检测DNA质量。使用分光光度法检测DNA纯度。
[0064] 0嫩在26011111处吸收强烈，00260/00280的值在1.7-1.9之间，说明提纯度较好，低于 1.7，说明提取的DNA中残留有较多的蛋白质，可用酚、氯仿继续抽提;若大于2.0，说明有RNA 污染或DNA链断裂。
[0065]苦瓜白粉病抗性鉴定快速检测方法，PCR反应体系中含有SLAF4542的碱基序列的 引物对Primer Forward inner和Primer Reverse inner ,Primer Forward outer和Primer Reverse outer〇
[0066] Primer Forward inner:5'-TATGCGCGCCAAACCAAATA-3'；
[0067] Primer Reverse inner:5'-GCTTCTAGTGCTTTATATGAGTGTCTACC-3'；
[0068] Primer Forward outer：5'-CCACTGGAATTCCCACCTACAC-3'；
[0069] Primer Reverse outer:5'-CGTCAATCTGAAATCGACTAAAGTACC-3'〇
[0070] 本发明实施例中，PCR的反应体系和扩增程序分别如下：
[0071 ]反应体系共IOyL: I .OyL浓度30ng/yL的模板DNA; Ιμπιο? .L-1 的Primer outer F 1 ·0 yL; Ιμπιο? .L-1 的Primer outer R I .OyL; IOymol .L-1 的Primer inner F I .OyL; IOymol .L-1 的Primer inner R 1.0yL;10XbufTer 1.0yL;2mmol.L-1 的dNTP 1.0yL;5〇ymol.L-1 的 MgCl2 0.4yL; Taq酶0· IyL; CldH2O 2.5yL。
[0072] 扩增程序:94°C预变性5min;94°C变性45s，55°C退火30s，72°C延伸lmin;共35个循 环;72°C延伸7min;15°C保存备用。
[0073] 本发明实施例中PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测方法，胶浓度为2%，IyL loading buffer+4yL PCR产物，100V电压，电泳Ih 30min。
[0074] 如图5、图6所示，使用本发明的分子标记SLAF4542，利用四引物扩增受阻突变体系 PCR，在苦瓜白粉病抗性鉴定中，在高感和感病苦瓜中鉴定均扩增出356bp和326bp的两条特 异片段，在高抗苦瓜鉴定中只扩增出326bp的特异片段。
[0075]综上所述，本发明的分子标记在F2代分离群体中的检出率达到98%以上，可在苗 期白粉病未发病前对苦瓜育种材料中的抗白粉病基因进行分子标记辅助选择，有效的克服 了常规育种的不足，简化选择方法和提高育种效率，加快了苦瓜抗病育种的进程。
[0076] SEQUENCE LISTING <110>广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所 < 120> -种与苦瓜抗白粉病基因紧密连锁的分子标记及其应用 <130> ZYWS <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> ? <211> 345 <212> DNA <2:13>人工序列 <400> ? cactgctcca cttcccactg gaattcccac Gtacactgtg gttgtttctc aaaccaaagc 60 ccccaggcta ctgggagttc atcaacttca tcattcagat agctcttgat ttcgccatgg 120 gcacctgaat tctacaatga attagactcg tataaatcat ggagccaggt gatatatatg 180 tacattatgg acagaacagt agatctaatt tacaaaaact aggcttctat ccaaaaatga 240 agcaacgggg aatctggcaa ctatgcgcgc caaaccaact gggagacact catataaagc 300
[0077] actagaagpa gcaggtaett tagtcgattt eagattgacg atgga 345 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 2 tatgcgcgcc aaaccaaata 20 <21 ()> 3 <211〉 29 <212> DNA <2〗3>人工序列 <400> 3 gcttctagtg ctttatatga gtgtctacc 29 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列
[0078] <400> 4 ccactggaat tcccacctac ac 22 <21〇> 5 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <400> 5 Cgtcaatetg aaatcgacta aagtacc 27
【主权项】
1. 一种与苦瓜抗白粉病基因紧密连锁的分子标记，其特征在于:所述的分子标记的标 号为SLAF4542,其具有如Seq ID N0.1所示的序列。2. 根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的分子标记是由引物对Primer Forward inner和Primer Reverse inner、弓丨物对Primer Forward outer和Primer Reverse outer扩增得到的。3. 根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，所述的引物对Primer Forward inner 和Primer Reverse inner、弓|物对Primer Forward outer和Primer Reverse outer分另lj具 有Seq ID NO.2-5所示的序列。4. 一种苦瓜抗白粉病基因的PCR检测试剂盒，所述的PCR检测试剂盒反应体系共10yL: l.OyL浓度30ng/yL的模板DNA;lymol.L_l的Primer Forward outer 1.0yL;lymol.L_l的 Primer Reverse outer 1.OyL;lOymol.L-l的Primer Forward inner 1.OyL；lOymol.L-l 的Primer Reverse inner 1.0yL;10Xbuffer 1.0yL;2m mol.L-1 的dNTP 1·ΟμL;5〇μ mol · L-l 的MgCl2 0 · 4yL; Taq酶0 · lyL; ddH20 2 · 5yL，其特征在于，所述的引物对Primer Forward inner和Primer Reverse inner、弓丨物对Primer Forward outer和Primer Reverse outer分别具有Seq ID NO.2-5所不的序列。5. 根据权利要求1-3任一所述的与苦瓜抗白粉病基因紧密连锁的分子标记在苦瓜白粉 病抗性鉴定中的应用，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取待检测苦瓜基因组DNA; (2) 以待检测苦瓜基因组为模板，利用权利3所述的引物对、权利4所述的反应体系，进 行PCR扩增反应； (3) 经电泳，如条带扩增出326bp的特异片段，则为高抗白粉病苦瓜；如条带扩增出 356bp和326bp的两条特异片段，则为高感白粉病苦瓜。
【文档编号】C12N15/11GK105861496SQ201610279044
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】冯诚诚, 黄如葵, 陈小凤, 梁家作, 黄熊娟, 陈振东, 刘杏连, 黄玉辉, 秦健
【申请人】广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所