一个黄瓜抗白粉病主效qtl定位的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及的是采用分子标记技术定位了一个新的黄瓜抗白粉病主效QTL，采用QTL分子标记方法，将抗白粉病新主效QTL定位在第5号染色体标记CPMID?2和SSR15321之间，其中CPMID?2是新开发标记，标记间的距离为8.5kb。通过该连锁的分子标记辅助选择黄瓜育种后代，可以大大缩短黄瓜育种的时间。
【专利说明】
一个黄瓜抗白粉病主效QTL定位
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及的是采用分子标记技术定位了一个新的黄瓜抗白 粉病主效QTL，开发了 一个与抗白粉病主效QTL紧密连锁的CPMID-2标记。
【背景技术】
[0002] 白粉病又称白毛病、粉霉病。白粉病病原菌包括二孢白粉菌、普生白粉菌、寥白粉 菌、多主白粉菌、鞑靼内丝白粉菌、单囊壳菌，分属于3个属、6个种，均属于子囊菌亚门、核菌 纲、白粉菌目。最常见的、报道最多的瓜类白粉病的病原菌是二孢白粉菌和单囊壳菌。白粉 病以叶片受害最重，其次是叶柄和茎，一般不危害果实。发病初期，叶片或背面产生白色近 圆形的小粉斑，逐渐扩大成边缘不明显的大片白粉区，布满叶面，好像撒了层白粉。抹去白 粉，可见叶面褪绿，枯黄变脆。发病严重时，叶面布满白粉，变成灰白色，直至整个叶片枯死。 白粉病侵染叶柄和嫩茎后，症状与叶片上的相似，惟病斑较小，粉状物也少。在叶片上开始 产生黄色小点，而后扩大发展成圆形或椭圆形病斑，表面生有白色粉状霉层。一般情况下部 叶片比上部叶片多，叶片背面比正面多。霉斑早期单独分散，后联合成一个大霉斑，甚至可 以覆盖全叶，严重影响光合作用，使正常新陈代谢受到干扰，造成早衰，产量受到损失。
[0003] 黄瓜抗白粉病遗传规律比较复杂，属于数量性状遗传。近年来发展起来的分子QTL 技术可以将黄瓜抗白粉病基因定位在染色体的特定区段内，并开发与目标基因密切连锁的 分子标记，通过连锁的分子标记辅助选择黄瓜育种后代，可以大大缩短黄瓜育种的时间。
[0004] 经对现有技术文献的检索发现，专利CN101240342A公开了一种黄瓜白粉病抗性主 效QTL紧密连锁分子标记方法与应用方法，包括以下步骤:黄瓜白粉病感病品种S94(罕）和 黄瓜白粉病抗病品种S06(d)杂交，得到杂种F 1;通过子代单粒传方法获得F7代的重组自交 系;分离每个重组自交系单株黄瓜叶片的DNA，进行PCR扩增;对分子标记分析资料构建黄瓜 遗传连锁图；用于统计分析和QTL定位;确定与抗源S06白粉病抗性主效QTL连锁的分子标记 F、CSEPGNll、e23ml8f和MEllEM9c。本发明鉴定结果与田间抗病吻合率由94%提高到100%。 利用与抗源S06抗白粉病主效QTL紧密连锁的分子标记，可以不受环境条件的影响，对该特 定抗源的后代及其衍生品种(系)在早代苗期进行筛选，节约成本，提高育种和选择效率。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是采用QTL分子标记方法，确定一种黄瓜抗白粉病主效QTL定位，并 开发一个紧密连锁的CPMID-2分子标记。
[0006] 本发明所述的一种黄瓜抗白粉病主效QTL定位，黄瓜高抗白粉病自交系和黄瓜高 感白粉病自交系杂交，获得杂种FHf，由Fi代自花授粉，通过子代单粒传的方法获得内代自 交系，分离每个单株黄瓜叶片的DNA，进行PCR扩增。F 2代和亲本接种白粉病病原菌，调查发 病情况，用于QTL定位。采用QTL IciMapping 3.2软件做图，最终将抗白粉病主效〇11定位在 第5号染色体标记CPMID-2和SSR15321之间，其中CPMID-2是新开发标记，标记间的距离为 8.5kb〇
[0007] 其中，在第5号染色体上新开发标记CPMID-2的序列为：0?110-2?:5-TATTTTCCTCCGACTGAC-3，CPMID-2R:5-GATAACATCTTACGTTGC-3。
[0008] 本发明定位的抗白粉病主效QTL位于第5号染色体的之间，所开发的标记距离黄 瓜抗白粉病QTL最近，仅为8.5Kb。
【附图说明】
[0009]
[0010] 图1为体白粉病病情指数的次数分布图；
[0011] 图2为&群体PCR扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0012] 图3是黄瓜白粉病主效QTL分析。
【具体实施方式】
[0013] 以下结合实施例和附图对本发明作进一步描述。
[0014] 实施例1:
[0015] ⑴利用高抗白粉病自交系74和高感白粉病自交系80杂交获得种子，由杂交卩丄 代自花授粉获得内代，通过单粒传方法获得F3代种子。
[0016] (2)选取Fi种子170粒、F2种子293粒和亲本一同播种，将亲本和F2群体，单株挂牌， 采集幼嫩叶片提取DNA，用于白粉病分子标记定位研究。
[0017] ⑶将亲本、170ftFi单株、293棵F2单株幼苗移栽到黄瓜塑料大棚，待黄瓜植株长至 14-15叶期开始白粉病的接菌鉴定，接种15天后，调查发病情况。植株病情鉴定方法和分级 标准基本参考2010年国家农业行业标准-黄瓜抗白粉病鉴定技术规程(NY/T1857.2-2010) 进行：（〇级:无任何病症；1级:病斑面积占叶面积的1/3以下，白粉状病斑模糊不清;2级：病 斑面积占叶面积的1/3-2/3，白粉状病斑较为明显，但分散不连片;3级：病斑面积占叶面积 的2/3以上，白粉状病斑连片，叶片开始变黄;4级：白粉层浓厚，由叶缘向里变褐;5级：叶片 变褐坏死斑面积占叶面积的2/3以上，叶缘上卷。）
[0018] (4)详细记录单株的接种叶片的病情级别和对应级别的叶片数，输入Excel工作 表中，计算亲本、？1和?2群体各单株的病情指数(DI)。计算方法如下:DI= Σ (各病情级别代 表数值X各病情级别病叶数)/(调查总叶数X最高病情级别代表值）X 1〇〇,计算F1代单株 病情指数的平均值，根据^群体各单株的病情指数，绘制病情指数次数分布图，用以研究黄 瓜白粉病遗传规律。
[0019] 通过计算获得接种鉴定对象的病情指数，感白粉病黄瓜亲本80的病情指数为 67.58，抗白粉病黄瓜亲本74对白粉菌有完全的抗性，病情指数为0，抗感亲本差异十分明 显。FiRnO个单株全部感病，病情指数11.4<DI<55.43，DI平均值为42.61，介于亲本之 间，趋于感病。由此表明抗病亲本74的白粉病抗性是由隐性基因控制的。根据F 2群体的病情 指数，绘制出？2群体病情指数次数分布图（图1)，结果显示，接种鉴定调查结果基本符合正 态分布规律，即初步认为其属于数量性状遗传群体的病情指数平均值为31.83,单株病 情指数标准差为18.74。（表1)
[0020] 表1亲本，FLF2群体病情指数
[0022]单株病情指数大于感病亲本的共有15株，占 F2群体的0.51 %。其中病情指数最大 值为85.2,比感病亲本病情指数大17.62。这种现象可能解释为由于诱病环境条件(如塑料 大棚两侧和两头的温度相对较低)不一致造成，同时也不排除或是基因的超亲优势影响。 [0023] (5)将亲本、170株?1单株、293棵?2单株叶片取样，提取DNA，进行琼脂糖凝胶电泳电 泳检测。条带相对清楚，杂质比较少。然后用紫外分光光度计测定DNA样品的浓度，大多在 300-1000ngAiL之间，平均值约为700ng/yL，足以满足后期实验要求。
[0024] (6)SSR引物由中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组提供，源自一张高密度 黄瓜SSR遗传图谱（以下简称高密图谱)上的共995对引物，分布于7条染色体上，引物序列来 自黄瓜基因组序列。
[0025]初期从黄瓜7条染色体上均匀选取119对SSR引物，平均遗传间距为5.12cM，最大间 距12.8cM，最小间距为0.7cM，间距方差为s2 = 7.81，用于筛选多态性引物和抗病QTL的染色 体定位。将抗病QTL定位到染色体后，针对该染色体特定区段，再次开发设计25对新的SSR引 物和18对Indel引物（ID5-1-ID5-18)，共合成162对引物。其中144条SSR引物平均遗传间距 为4.24cM，最大间距12.1cM，间距方差为s 2 = 7.77。所有引物均由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成。
[0026]总计合成的162对SSR引物中，具多态性引物共有37对，总体多态率为22.8%，缺失 率为2.8%。扩增凝胶电泳图见图2。
[0027] (7)利用获得的37对多态性SSR和Indel引物，对抗病亲本74 X感病亲本80的F2代 分离群体293个单株进行分析，经PCR扩增和5%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，得到的条带与抗病 亲本74带型一致的记为A，与感病亲本80带型一致的记为B，同时有抗感亲本条带的杂合带 型记为H，失的记为"-"，统计录入Excel工作表中。用软件QTLIciMapping3·2构建连锁图 谱及QTL分析，先将录入的Excel工作表中的原始数据按照软件数据格式进行处理。内群体 数据格式如下：亲本P1型、亲本P2带型和杂合型（Fi带型）分别由0、2、1来编码，缺失则记 为一 1。经过软件分析后初步将黄瓜抗白粉病主效QTL定位在第5号染色体标记SSR15321和 SSR07531之间。依据黄瓜全基因组序列信息（cucumber_ChineseLong_V2 ; http : // ￥￥界.;[0呢;[.0坪），确定标记331?15321和331?07531之间的物理距离约5.8]\&。
[0028] (8)在第5号染色体5.8Mb之间无已发表的标记，采用Primer Premier 5.0软件设 计12对基因扩增引物，分别命名为PCR1-PCR12，用抗感亲本进行PCR扩增，引物PCR9在抗感 亲本中扩增出差异片段，回收PCR扩增差异片段，进行测序。根据测序的序列信息，继续设计 6对Indel引物，命名为CPMID-1-CPMID-6。在F2群体中进行PCR扩增，将结果与步骤7中具有 多态性的37对引物结果，用软件QTL Icimapping 3.2构建连锁图谱及〇11分析，最终将抗白 粉病主效QTL进一步定位在标记SSR15321与CPMID-2之间（如图3所示）。连锁标记在第5号染 色体上的位置分别为17，443，753位和17，435，252位。即将目的主效QTL锁定于17，443，753 ~17，435，252序列间，物理距离约为8.5Kb的范围内，其中CPMID-2为新开发的Indel标记。
【主权项】
1. 一种黄瓜抗白粉病主效QTL定位，其特征在于:采用QTL分子标记方法，将抗白粉病新 主效QTL定位在第5号染色体标记CPMID-2和SSR15321之间，其中CPMID-2是新开发标记，标 记间的距离为8.5kb。2. 根据权利要求1所述的一种黄瓜抗白粉病主效QTL定位，其特征在于：新开发标记 CPMID-2 的序列为 CPMID-2F:5-TATTTTCCTCCGACTGAC-3，CPMID-2R:5-GATAACATCTTACGTTGC- 3〇
【文档编号】C12N15/11GK105969860SQ201610323872
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】张守才, 郝俊杰, 崔健, 李磊, 秦玉红, 王波, 王瑛, 王珍青, 江志训
【申请人】青岛市农业科学研究院