非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，属于基因检测领域。本发明基于多重PCR和高通量测序技术开发出一种用于检测12个致癌基因的466个突变的方法，所述的致癌基因为AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA和PTEN，所述突变可以是一个或多个碱基的置换、插入和/或缺失。本发明的检测方法灵敏度高，检测灵敏度高达0.01％，检测结果明确客观，可以直接反应相关基因的具体突变位点，可以直接用于指导临床非小细胞肺癌靶向用药以及用于癌症早期诊断或辅助诊断及筛查和癌症愈后监测。
【专利说明】
非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于基因检测领域，更具体地说，涉及一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检 测方法。
【背景技术】
[0002] 全国第三次人口死亡病因调查显示，过去三十年来，我国肺癌的死亡率上升了 465%，超过肝癌成为死亡率最高的癌症。据估计，2015年我国肺癌的新发病例为733300例 (男性509300例、女性224000例），死亡610200例（男性432400例、女性177800例），其发病率 和死亡率均居所有恶性肿瘤的首位。因此，肺癌在我国已成为一个非常重要的公共卫生问 题。
[0003] 肺癌根据组织学可分为小细胞肺癌（small cell lung carcinoma,SCLC)和非小 细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC)，非小细胞肺癌约占肺癌总数的80% 左右，主要分为腺癌（~50%)和鳞癌（~40%)两个亚型。通常腺癌发生在肺段支气管以下 的细支气管或肺泡壁。鳞癌则多发生在肺中央的主支气管和支气管的管腔并伴随着慢性炎 症。
[0004] 目前，临床上非小细胞肺癌仍以组织病理学诊断为确诊和治疗的依据，使用的治 疗方法是根据其分期采取手术或手术结合放化疗进行治疗。但由于非小细胞肺癌缺乏有效 的早期诊断手段，70%以上的患者在确诊时已是中晚期，错过了最佳手术时期。而非小细胞 肺癌各种化疗方案的总体有效性仅为30%左右，同时有些患者无法耐受化疗和放疗以及化 疗后很快耐药，从而导致非小细胞肺癌患者确诊后5年生存率很低，晚期患者五年生存期只 有15%左右。
[0005] 近年来，分子靶向治疗逐渐受到人们的关注并广泛应用于临床。分子靶向治疗是 使用药物针对已经明确的致癌基因，特异地杀死肿瘤细胞，因此分子靶向治疗的副作用更 小和特异性更高，也为晚期非小细胞肺癌患者提供了新的有效治疗手段。这其中最典型的 例子是肺腺癌的EGFR突变靶向治疗。在我国，约30%非小细胞肺癌患者存在EGFR突变。对这 类患者采用EGFR激酶抑制剂-吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼，有效率可以达到70%~80%。 过去十年针对非小细胞肺癌的特定基因突变开展的革E1向治疗就已让晚期肺癌患者中位生 存期显著增加2.4倍，从此前的14.1个月延长至33.5个月，相较于传统的治疗方法优势明 显。目前，临床上关于非小细胞肺癌的靶向药物，然而除激酶抑制剂-吉非替尼、厄洛替尼、 阿法替尼以外，还有作用于AKT的抑制剂普喹替尼和MK-2206 2HCL等，ALK突变靶向药物克 口坐替尼、色瑞替尼、&丨叾〇1:;[11；[13、061'；[1:;[11；[13、氣卓替尼、6&116丨68口;[13和？？-06463922等，可革巴 向作用于BRAF突变的维罗非尼、索拉菲尼、曲美替尼、达拉替尼极易西妥昔单抗和帕尼单抗 等，作用于EGFR突变的还有埃克替尼、AZD9291、艾力替尼、西帕替尼、易吡替尼、西莫替尼、 席栗替尼、啦略替尼、麦他替尼、帕尼单抗、西妥昔单抗、尼妥珠单抗、Hemay020、 尺0(^16衍11丨13、腿61713、124002和4203759等41^8抑制剂达可替尼、如以^13让、1'0￥01^-afatinib-BIBW2992 和 PF-00299804等，FGFR1/2/3 抑制剂 Nintedanib、索凡替尼、德立替尼、 丙氨酸布立尼布、AZD4547等，KRAS的抑制剂瑞格菲尼、Deltarasin及西妥昔单抗，抑制MET 的小分子化合物Ficlatuzumab、INC280、赛尔非尼、沃利替尼、宁格替尼、Tivantinib、 Foretinib和Golvatinib等，可祀向作用于PIK3CA突变的吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗、西 妥昔单抗和尼妥珠单抗等，作用于PTEN突变的西妥昔单抗和尼妥珠单抗等。然而，并非所有 的非小细胞肺癌患者对分子靶向治疗均表现出较好的疗效，比如现有资料表明EGFR基因突 变与EGFR激酶抑制剂敏感性相关，EGFR基因突变患者对EGFR激酶抑制剂吉非替尼的有效率 达60 %以上，而EGFR基因野生型（即未突变型）患者的有效率仅为10 % - 15 %。因此，明确肺 癌组织的突变状况对靶向药物的临床使用和疗效预测有重要的指导意义。而分子靶向药物 的使用需要明确肿瘤患者存在可靶向治疗的基因突变，所以基因突变的检测是确定治疗方 案的关键。
[0006] 临床中非小细胞肺癌的诊断样品70%是小的活检样品，其首先被用于临床病理学 诊断，剩下的有限组织若要用作分子诊断，则对其核酸含量及提取方法都有较高的技术操 作要求。且病理形态相同的非小细胞肺癌，由于分子遗传学改变，在分子水平上呈现高度异 质，这种组织的异质性使得一些活检样本无法反应肿瘤基因突变的全貌，从而导致对靶向 治疗的反应差别很大。同时，肿瘤异质性也是不断变化的，无法通过一两次的活检或组织样 本来检测患者的病情。
[0007] 高通量测序技术是一项国际先进的新型测序技术，它通过多基因、多位点的集成 式检测，可一次性检测与肿瘤靶向治疗密切相关的基因位点。它所需的核酸要求不高，是应 用于肿瘤基因检测的一个很好的选择。此外，肿瘤是基因组疾病，单一基因的检测难以满足 指导个体化治疗的需要。而以高通量测序和大数据分析为基础，对非小细胞肺癌进行多基 因突变检测，能够精确的地给出患者癌组织的基因突变信息，从而指导医生为病人制定针 对性的个性化靶向治疗方案。同时，也可用于非小细胞肺癌病人的早期诊断和筛查。
[0008] 目前，市场上对于非小细胞肺癌的检测主要停留在单个或几个位点的检测水平， 检测方法一般使用荧光PCR、芯片分析等方法，例如，中国专利申请号为201310200169.7，申 请公布日为2013年9月11日的专利文件公开了一种用于检测ALK基因表达的探针、引物及试 剂盒，包括以下序列：SEQ ID N01-SEQ ID N012,该发明的引物和探针可以特异检测ALK基 因表达差异，以确定是否存在ALK基因融合，该发明建立的用于检测ALK基因表达差异的实 时荧光PCR体系，通过检测5 '端和3 '端基因表达量的差异，提供ALK基因表达差异外显子的 定性评估，适用于非小细胞肺癌患者在进入个性化靶向治疗之前。中国专利申请号为 201310068052.8,申请公布日为2013年6月5日的专利文件公开了一种早期非小细胞肺癌多 位点关联基因的引物、探针、试剂盒及其制备方法和检测方法。该发明针对非小细胞肺癌的 早期检测与之相关联的EGFR，CHRNA3，CHRNA5及ERCCl基因内部的rs2239680，rsl6969968， rsl2910984及rs2298881位点的基因型进行分型，利用以上4个位点联合作为非小细胞肺癌 早期诊断的标志物，提高了检测的真实性和准确性。然而，由于癌症是基因组疾病，单一或 几个基因突变位点的检测难以满足指导个体化治疗的需要。已经报道的几种检测非小细胞 肺癌的方法只包含了极少的几个基因突变位点，不能有效的反应患者癌症突变的全貌，难 以用于临床指导，且临床发现单一基因的靶向用药多数存在治疗无效或很快产生药物抗性 等不利反应，因此，我们需要一种更加全面有效的检测手段。同时，对癌症进行全基因组或 全外显子测序可以获得海量的基因突变数据。然而，这些测序费用极其昂贵，后期数据分析 要求极高、耗时长达数月，且由于我们对绝大多数基因突变在癌症中的功能认识有限，目前 仅针对极少的一部分基因研发出了靶向药物。因此，全基因组或全外显子测序检测肺癌的 方法无法应用于临床需求。根据前期研究表明，非小细胞肺癌存在多种基因突变，其中最常 见的突变包括致癌基因 AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、 PIK3CA和PTEN，更重要的是这些突变临床上均已开发或正在测试靶向药物，对于这些基因 突变的检测将更好的指导医生为病人制定针对性的个性化靶向治疗方案。
[0009] 综上所述，现有的非小细胞肺癌的检测方法都存在一定的缺陷，例如结果不易判 读、重复性差、假阳性和假阴性多、检测基因少、通量低等问题。而现在市场上存在的一些基 于高通量测序技术检测肺癌的方法，存在对样品的要求较高、目的性不强、操作繁琐、引物 或探针设计复杂、检测费用高等缺点，特别是不能指导靶向用药，因此急需一种新型的检测 方法以满足市场和医疗的需求。
【发明内容】
[0010] 1.要解决的问题
[0011] 针对现有的非小细胞肺癌检测方法存在结果不易判读、重复性差、假阳性和假阴 性多、通量低等问题，本发明提供一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，是一种基于多 重PCR和高通量测序技术开发出一种用于检测12个致癌基因的466个突变的方法，所述的致 癌基因为AKT 1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA 和 PTEN，所述 突变可以是一个或多个碱基的置换、插入和/或缺失。
[0012] 2.技术方案
[0013]为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0014] -种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其步骤包括：
[0015] A.从待测样品中提取基因组DNA;
[0016] B.使用非小细胞肺癌靶向治疗基因特异性引物SEQ ID No. 1~SEQ ID No.96,对 步骤A中提取的基因组DNA上的目的片段进行多重PCR扩增；
[0017] C.对步骤B中得到的多重PCR扩增产物进行酶切后连接测序接头，构建测序文库；
[0018] D.对步骤C中构建的测序文库进行高通量测序，获得目的基因片段的序列信息。
[0019] 优选地，检测的基因为AKT 1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、 MET、PIK3CA或PTEN;本发明的特异性引物SEQ ID No. 1~SEQ ID No.96(见表1)是针对上述 的非小细胞肺癌12个致癌基因的466个突变位点的特定序列设计的，可以扩增致癌基因 AKT 1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA 和 PTEN的突变位点区 域，扩增产物经高通量测序获得其序列信息，从而检测出样品中这些基因的突变状况。本发 明所用引物(SEQ ID No. 1~SEQ ID No.96)，可使用多重PCR扩增技术在一管中同时有效的 扩增目标序列，所得PCR产物经限制性内切酶酶切和连接测序接头后，用于制备测序文库和 上机进行高通量测序，所构建的测序文库经NanoDrop 2000、Agilent Bioanalyzer 2100、 LabChip GX Touch和Qubit 3.0检测合格后适用于多种高通量测序平台，包括Illumina NextSeq 500/550测序仪、Illumina MiSeq测序仪、Illumina MiniSeq测序仪、Illumina HiSeq 2500/3000/4000测序仪、Ion Proton测序仪和Ion PGM等测序仪。
[0020] 表1非小细胞肺癌12个靶向治疗基因突变位点检测SEQ No. 1~SEQ No.96引物序
[0024] 备注:序列号代表引物序列的编号，Forward Primer表示正向引物序列，Reverse Primer代表反向引物序列。
[0025] 优选地，步骤A中的待测样品包括但不限于新鲜肿瘤组织、新鲜活检组织、石蜡包 埋组织、全血、血清、血浆、唾液和尿液;提取基因组DNA时，使用但不限于组织DNA提取试剂 盒、石蜡包埋组织DNA提取试剂盒、全血DNA提取试剂盒、血清DNA提取试剂盒或血浆基因组 DNA提取试剂盒。
[0026] 优选地，步骤A中提取基因组DNA后对DNA进行质量检测，用于质量检测的仪器优选 为NanoDrop2000、Agilent Bioanalyzer 2100、LabChip GX Touch和Qubit 3.0,对DNA的质 量要求为：DNA浓度大于20ng/yL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0;步骤B中的特异性引物 SEQ ID No.l~SEQ ID吣.96进行多重?0財广增时同时加入。
[0027] 优选地，步骤B中多重PCR扩增的反应体系为：5X PCR Buffer 10yL、MgCl2(25mM)3 yL、dNTPs(10mM each)2yL、Primers Mix(100nM each)10yL、DNA template 10~20ng、Taq polymerase( 5U/yL) lyL，用ddH2〇加至50yL;步骤B中多重PCR扩增的反应条件为：
[0029] 可以使用Phusion U Green Multiplex PCR Master Mix、QIAGEN Multiplex PCR Kit、NEB Multiplex PCR 5X Master Mix和MagniTaq Multiplex PCR Master Mix等试剂 盒进行扩增;多重PCR扩增后所得产物，还可以使用但不限于:QIAquick PCR Purification Kit、GeneJET PCR Purification Kit、PureLink PCR Purification Kit、GenElute PCR Clean-Up Kit和NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit等试剂盒进行纯化。步骤B所述多 重PCR扩增同时包含对阴性对照的扩增，所用阴性对照的样本为正常人基因组DNA。
[0030] 步骤B中所述的基因组DNA上的目的片段是指分别包含非小细胞肺癌12个靶向治 疗基因（AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、-MET、PIK3CA和PTEN)的 466个突变位点的基因片段，12个靶向治疗基因的466个突变位点如表2所示。
[0031]表2 12个靶向治疗基因的466个突变位点信息
[0041 ] 备注:Gene表示基因名称，如AKT1代表AKT1基因 ;Accession Number是指基因在数 据库里的登记号，如AKT1基因在GenBank中的登记号是ENST00000349310;COSMIC ID是指基 因突变在癌症基因组突变数据库中的编号，如非小细胞肺癌中AKT1基因一个最常见的突变 在癌症基因组突变数据库中的编号为⑶SM33765;⑶S Mutation代表编码序列的突变，如 c.49G>A表示编码区第49位鸟苷酸突变成为腺苷酸;AA Mutation表示氨基酸序列的突变， 如P.E17K表示蛋白序列中第17位的谷氨酸突变为赖氨酸;Position则指该突变在染色体上 的位置，如14:105246551-105246551表示突变发生在14号染色体105246551位点。此外，ins 代表插入，del代表缺失，*表不终止子，？代表对编码蛋白影响未知。
[0042] 步骤B中使用非小细胞肺癌靶向治疗基因特异性引物SEQ ID No. 1~SEQ ID No.96,对步骤A中提取的基因组DNA上的目的片段进行多重PCR扩增，扩增产物经处理后进 行高通量测序，用以检测表2中的基因突变状况。检测每个突变位点的引物对分别为：SEQ No.l 和 SEQ Νο·2 检测 AKT1 基因 C0SM33765 突变，SEQ Νο·3 和 SEQ Νο·4 检测 ALK 基因 C0SM28054、C0SM28055、C0SM28057、C0SM28059、C0SM28061、C0SM28491、C0SM99137、 ⑶SM144250和⑶SM144251突变，SEQNo·5和SEQNo·6检测ALK基因⑶SM98478突变，SEQ No · 7和SEQ No · 8检测BRAF基因⑶SM447、⑶SM449、⑶SM450、⑶SM451、⑶SM453、⑶SM457、 C0SM458、C0SM459、⑶SM460、⑶SM461、⑶SMI 112、C0SM6262和⑶SM21492突变，SEQ No · 9和 SEQ No · 10检测BRAF基因 C0SM462、C0SM463、C0SM466、C0SM467、C0SM468、C0SM469、C0SM470、 ⑶SM471、⑶SM472、⑶SM473、⑶SM474、⑶SM475、⑶SM476、⑶SM477、⑶SM478、⑶SM1115、 ⑶SM1116、C0SM1117、raSM1118、C0SM1119、TOSM1120、C0SM1123、TOSM1124、C0SM1125、 ⑶ SM1126、C0SM1128X0SM1130、C0SM1132X0SM1133、C0SM1134X0SM1135、C0SM1136、 C0SM1137、C0SM1138、C0SM6137、C0SM6265、C0SM6267、C0SM18443、C0SM21542J0SM21549、 ⑶SM26506、⑶SM26625、⑶SM27639、⑶SM28010、C0SM30730、C0SM33729、C0SM33808、 C0SM144982、C0SM219798 和 C0SM249889 突变，SEQ No. 11 和 SEQ No. 12 检测 EGFR 基因 ⑶ SM6210、C0SM6218、⑶ SM6220、C0SM6223X0SM6225、C0SM6254X0SM6255、C0SM6256、 C0SM6268、C0SM12367、C0SM12369、C0SM12370、C0SM12382、C0SM12383、C0SM12384、 C0SM12386、C0SM12678、C0SM12728、C0SM13181、C0SM13182、C0SM13184、C0SM13185、 ⑶SM13432、TOSM13556、TOSM17570、TOSM21984、C0SM23571、C0SM24267、C0SM26038、 ⑶SM26509、⑶SM26704、⑶SM27041、⑶SM27042、C0SM28517、C0SM29274、C0SM53194、 C0SM85993、C0SM96856、C0SM133189、⑶SM133197和⑶SM133207突变，SEQNo·13和SEQ No·14检测EGFR基因⑶SM6213、C0SM6224、⑶SM12366、⑶SM12374、⑶SM12429、C0SM12675、 C0SM13008、C0SM13197、C0SM13199、C0SM14070、C0SM26129、C0SM26438、C0SM28605、 C0SM28607、⑶SM33725和C0SM53292突变，SEQNo·15和SEQNo·16检测EGFR基因⑶SM6226、 C0SM6240、C0SM6241、C0SM6242、C0SM12377、C0SM12378、C0SM12427、C0SM13005、C0SM13006、 C0SM13007、C0SM13189、C0SM13190、C0SM13433、C0SM14068、C0SM20891、C0SM22940、 ⑶SM22951、⑶SM22954、⑶SM26445、⑶SM27110、C0SM27568、C0SM28513、C0SM28603、 C0SM48922和⑶SM133565突变，SEQNo·17和SEQNo·18检测EGFR基因⑶SM6239、C0SM6252、 C0SM6253、C0SM12371、C0SM12373、C0SM12988、C0SM13009、C0SM13427、C0SM13979、 ⑶SM18425、⑶SM18441、⑶SM22992、⑶SM28508、C0SM28510、C0SM28511、C0SM28601、 C0SM41603和⑶SM41905突变，SEQ No · 19和SEQ No · 20检测EGFR基因⑶SM236670突变，SEQ No·21和SEQNo·22检测ERBB4基因⑶SM12833、⑶SM48366、⑶SM131764、C0SM131765和 C0SM160825突变，SEQ No·23和SEQ No·24检测ERBB4基因 C0SM20392和C0SM95705突变，SEQ No·25和SEQNo·26检测ERBB4基因 C0SM48363、C0SM48364、C0SM96313、⑶SM131772、 C0SM138342、C0SM170797和C0SM232263突变，SEQNo·27和SEQNo·28检测ERBB4基因 C0SM48367和⑶SM209862突变，SEQ No · 29和SEQ No · 30检测ERBB4基因 C0SM48368突变，SEQ No.31和SEQNo.32检测ERBB4基因 C0SM48369突变，SEQNo.33和SEQNo.34检测ERBB4基因 C0SM108015突变，SEQNo·35和SEQNo·36检测ERBB4基因 C0SM110095突变，SEQNo·37和SEQ No·38检测FGFR1 基因 C0SM601、C0SM48380、⑶SM98900和C0SM187237突变，SEQ No·39和SEQ No. 40检测FGFR1 基因 C0SM12834突变，SEQ No. 41 和SEQ No. 42检测FGFR2基因⑶SM36901 突 变，SEQNo·43和SEQNo·44检测FGFR2基因 C0SM36902和C0SM36912突变，SEQNo·45和SEQ No. 46检测FGFR2基因 C0SM36903和C0SM49170突变，SEQ No. 47和SEQ No. 48检测FGFR2基因 C0SM36904和⑶SM36906突变，SEQNo·49和SEQNo·50检测FGFR3基因⑶SM714、⑶SM715和 C0SM29446突变，SEQNo·51和SEQNo·52检测FGFR3基因⑶SM716、⑶SM718、⑶SM721、 C0SM722、C0SM724、C0SM17461和⑶SM24842突变，SEQNo·53和SEQNo·54检测FGFR3基因 C0SM719、C0SM720、⑶SM726、C0SM731和C0SM29438突变，SEQNo·55和SEQNo·56检测FGFR3 基因 C0SM725、C0SM729和C0SM27139突变，SEQ No · 57和SEQ No · 58检测FGFR3基因 C0SM24802 突变，SEQ No · 59和SEQ No · 60检测KRAS基因 C0SM507、C0SM510、C0SM511、C0SM512、C0SM514、 ⑶SM515、⑶SM516、⑶SM517、⑶SM518、⑶SM519、⑶SM520、⑶SM521、⑶SM522、⑶SM523、 ⑶SM524、⑶SM527、⑶SM528、⑶SM529、⑶SM531、⑶SM532、⑶SM533、⑶SM534、⑶SM535、 ⑶SM536、C0SM537、C0SM538X0SM542、C0SM543、C0SM12654、C0SM12655、C0SM12703、 ⑶SM12721、⑶SM12722、⑶SM14209、⑶SM20818、C0SM25081、C0SM34144、C0SM87280、 C0SM87301 和⑶SM219781 突变，SEQ No · 61 和SEQ No · 62检测KRAS基因⑶SM546、⑶SM547、 C0SM549、C0SM550、C0SM551、C0SM552、C0SM553、C0SM554、C0SM555、C0SM28518、C0SM87288和 C0SM87298突变，SEQ No·63和SEQ No·64检测KRAS基因 C0SM19404、⑶SM19900、C0SM19905、 C0SM19940和⑶SM28519突变，SEQ No · 65和SEQ No · 66检测MET基因⑶SM691、⑶SM699和 C0SM700突变，SEQ No·67和SEQ No·68检测MET基因⑶SM696、⑶SM697、⑶SM698、⑶SM701、 C0SM702、C0SM703和⑶SM201908突变，SEQNo·69和SEQNo·70检测MET基因⑶SM706突变， SEQNo·71和SEQNo·72检测MET基因⑶SM707突变，SEQNo·73和SEQNo·74检测MET基因 C0SM710突变，SEQNo·75和SEQNo·76检测PIK3CA基因 C0SM759、⑶SM760、⑶SM762、 ⑶SM764、⑶SM765、⑶SM766、⑶SM767、⑶SM6147、C0SM12458、C0SM12459、C0SM17442、 0^]\124712、0)5]\125041、0)5]\127133、(：05]\127155、0)5]\127374、0)5]\1125370和(：05]\1249872突变， SEQ No · 77和SEQ No · 78检测PIK3CA基因⑶SM771、⑶SM772、⑶SM773、⑶SM774、⑶SM775、 C0SM776、C0SM777、C0SM12461、C0SM12463、C0SM12590、raSM1259U0SM12592J0SM12597、 C0SM13594、C0SM17444、C0SM17445、C0SM21451、C0SM24714、C0SM25085、C0SM25086、 ⑶SM27134、⑶SM27156、⑶SM27158、⑶SM27273、C0SM28938、C0SM29110、C0SM29313、 C0SM36285、C0SM36286、C0SM36289和C0SM94984突变，SEQ No · 79和SEQ No · 80检测PIK3CA基 因 C0SM778突变，SEQ No · 81和SEQ No · 82检测PIK3CA基因 C0SM17449和C0SM249908突变，SEQ No·83和SEQNo·84检测PTEN基因⑶SM4885、C0SM4894、⑶SM4896、C0SM4899、⑶SM4903、 ⑶SM4916、C0SM4932、raSM4943、C0SM4958、TOSM4982、C0SM4990、TOSM4994、C0SM5008、 ⑶ SM5093、C0SM5151X0SM5255、C0SM5290X0SM5775、C0SM5801X0SM5814、C0SM5823、 C0SM5869、C0SM19564、C0SM23626、C0SM23657和⑶SM39615突变，SEQNo·85和SEQNo·86检 测 PTEN 基因⑶ SM4889、C0SM4942、TOSM5000、C0SM5036X0SM5042、C0SM5048X0SM5127、 ⑶ SM5191、C0SM5253X0SM5257、C0SM5296X0SM5313、C0SM5317X0SM5811、C0SM5916、 ⑶SM5958、C0SM5959、⑶SM5960、C0SM5974、⑶SM5975、C0SM5976、⑶SM5979、C0SM14087、 C0SM41768和⑶SM43077突变，SEQ No · 87和SEQ No · 88检测PTEN基因 C0SM4908、C0SM4912、 ⑶ SM4986、C0SM511U0SM5125、C0SM5159、TOSM5160、C0SM5220、TOSM5230、C0SM5246、 C0SM5292、C0SM5822、C0SM5887、C0SM5888、C0SM1398U0SM17564、raSM23644J0SM26404、 C0SM43075、C0SM88109和C0SM133713突变，SEQNo·89和SEQNo·90检测PTEN基因 C0SM4929、 ⑶SM4937、C0SM4976、raSM5037、C0SM5049、TOSM5101、C0SM5133、TOSM5153、C0SM5232、 ⑶SM5270、C0SM5298、⑶SM5878和⑶SM5915突变，SEQNo·91和SEQNo·92检测PTEN基因 ⑶ SM4931、C0SM5156、C0SM5314、⑶SM5816、C0SM13452、C0SM28906和⑶SM28914突变，SEQ No·93和SEQNo·94检测PTEN基因⑶SM4969、C0SM5039、⑶SM5045、C0SM5052、⑶SM5089、 ⑶SM5091、C0SM5114、⑶SM5149、C0SM5200、TOSM5218、C0SM5244、TOSM5825、C0SM5907、 C0SM5961、C0SM28897和C0SM33702突变，SEQ No · 95和SEQ No · 96检测PTEN基因⑶SM5932、 C0SM5950、C0SM5951、C0SM5971、C0SM17561、C0SM27365、C0SM28920、C0SM30729、C0SM241294 和 C0SM249834 突变。
[0043] 优选地，步骤C中进行酶切的酶为限制性内切酶Fsel和PacI，酶切反应体系为:纯 化的多重PCR产物30yL、NEB CutSmart Buffer 5yL、NEB Fsel内切酶 10U、NEB PacI内切酶 10U，用ddH20加至50yL;酶切条件为37 °C酶切1~1.5小时。
[0044] 优选地，步骤B中多重PCR扩增产物或步骤C中的酶切产物均使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，50yL PCR反应体系或50yL酶切反应体系中加入70yL Agencourt AMPure XP磁珠。
[0045] 优选地，步骤C中连接测序接头的连接体系为:纯化的酶切产物30yL、测序接头（10 μΜ) lyL、T4连接酶Buf f er 5yL、T4DNA连接酶5U，用ddH20加至50yL;连接反应条件为16°C连 接1~2小时。本发明中的测序接头如表3(适用于Illuminate测序仪）和表4(适用于Ion Torrent测序仪)所示。
[0046] 表3用于Illuminate测序仪测序文库构建的接头引物序列（SEQ ID No.97~SEQ ID No.147)
[0050] 备注:Adapter Name代表接头的名称，Sequence表示接头的核苷酸序列信息，所有 接头的5 '端都经过磷酸化修饰，*代表修饰引物中的磷酸酯键。
[0051 ] 表4用于Ion Torrent测序仪测序文库构建的接头引物序列（SEQ ID No. 148~ SEQ ID No.165)
[0053] 备注:Adapter Name代表接头的名称，Top Adapter和Bottom Adapter分别代表组 成接头的两条寡核苷酸序列信息，所有接头的5'端都经过磷酸化修饰。
[0054] 优选地，步骤C中的连接产物使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，50yL连接 反应体系中加入70yL Agencourt AMPure XP磁珠，纯化的连接产物即为测序文库，测序文 库的 DNA 浓度大于 201^/^1^，4260/^280>1.8,4260/^230>2.0(使用恥11〇01(^2000、48丨161^ Bioanalyzer 2100、LabChip GX Touch或Qubit 3.0对测序文库的DNA进行质量检测）。
[0055]步骤C中纯化的连接产物按照不同测序方法的要求进行测序文库的缓冲液平衡， 使得上样量相当的、不同接头标记的测序文库处于测序方法需要的缓冲液体系中，能够直 接用于上机测序。
[0056]优选地，步骤D中获得目的基因片段的序列信息后，与正常的基因序列进行比对分 析，得到目的基因片段的突变信息。
[0057] 3.有益效果
[0058]相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0059] (1)本发明针对非小细胞肺癌12个临床已发现靶向药物的致癌基因的466个突变 位点的特定序列设计的引物，具有特异性强、非特异性扩增程度低、各引物间相互干扰小、 扩增效果好等优点，在进行多重PCR扩增时，这些引物混合溶解于同一管中同时加入；
[0060] (2)本发明的非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，样品要求低，起始样品DNA的 量可以低至lng，可以使用各种来源的样品进行DNA的提取，包括且不限于新鲜肿瘤组织、新 鲜活检组织、石蜡包埋组织、全血、血清、血浆、唾液和尿液等，而且可以使用已发生降解的 DNA样品；
[0061] (3)本发明的检测通量高，一次可以检测十几个到几百个样品的12个基因的466个 突变位点状况；
[0062] (4)本发明的检测方法，灵敏度高，检测灵敏度高达0.01%，检测结果明确客观，可 以直接反应相关基因的具体突变位点，可以直接用于指导临床非小细胞肺癌靶向用药以及 用于癌症早期诊断或辅助诊断及筛查和癌症愈后监测；
[0063] (5)本发明的检测方法安全快速，不含有毒有害物质，对实验人员和环境都无危 害，检测速度快，仅需一到数天就可以获得检测结果；
[0064] (6)本发明的检测方法基于多重PCR技术和高通量测序技术，可以同时检测12个临 床已有或正在测试靶向药物的基因的466个突变位点，使用的特异性引物和接头及优化的 实验体系，使得检测方法简单易行、特异性高、重复性好、准确度高，对非小细胞肺癌靶向治 疗基因的突变位点具有检测通量高、检测速度快、准确性和重复性好、安全性高等众多优 点，为指导非小细胞肺癌患者的个性化治疗，辅助非小细胞肺癌的早期诊断及癌症愈后检 测提供一种高效的方法。
【具体实施方式】
[0065] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施例对本发 明进一步详细说明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而并非要限制本发明的范 围。此外，在以下说明中，省略了对公知技术的描述，以避免不必要的混淆本发明的概念。在 阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动，这些等价形式同样落 入本发明所限定的范围。
[0066] 实施例1
[0067] 所用样本为非小细胞肺癌新鲜活检组织，采用DNA提取试剂盒提取肺癌新鲜活检 组织中的基因组DNA，应用SEQ No. 1~SEQ如.96对提取得到的基因组0嫩进行多重?0財广增 后，采用Illumina NextSeq 500测序仪进行测序分析，具体实施方法如下：
[0068] A.基因组DNA提取：使用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit，参照试剂盒说明书进 行基因组DNA的提取。获得的基因组DNA进行凝胶电泳和使用NanoDrop 2000进行质量检测， 要求基因组DNA没有明显的降解，浓度大于20ng/yL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0，并使 用Agilent Bioanalyzer 2100进行精确定量。
[0069] B.多重PCR扩增：使用SEQ No.l~SEQ吣.96对10即基因组0嫩进行多重？0財广增， 获得AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA 和PTEN这 12个目 的基因的466个突变位点区域的目标扩增片段。
[0070] 所用的多重PCR反应体系为：
[0072]所用的多重PCR反应条件为：
[0074] 多重PCR完成后，每个样品管中加入70yL Agencourt AMPure XP磁珠，用来对扩增 产物进行纯化，具体操作参照生产商提供的方法，纯化产物最终溶于30yL TE Buffer中。 [0075] C.测序文库构建:首先，对纯化的多重PCR产物进行酶切，使用限制性内切酶Fsel 和PacI，所用的酶切反应体系为：
[0077] 酶切反应条件为:37°C酶切处理1小时。酶切完成后在每管中加入70yL Agencourt AMPure XP磁珠，用来对酶切产物进行纯化，纯化产物最终溶于30yL TE Buffer中。接下来 对纯化的酶切产物进行接头连接，分别将5 μ L 2 0 μ Μ的对应上下游接头引物在9 5 °C处理 2min，然后缓慢冷却到室温用于接头连接反应。96孔板中1~12分别使用Universal Adaper (P5)+Index 1(P5)~Index 12(P5)接头，A~Η则分别加入Universal Adaper(P7)+Index 1 (P7)~Index 8(P7)接头(表3中所示），使用的连接反应体系为：
[0079] 连接反应条件为：16°C连接1小时。连接完成后在每个连接体系中加入70yL Agencourt AMPure XP磁珠，用来对连接产物进行纯化，纯化产物最终溶于30μ1 TE Buffer 中。纯化所得的连接产物即为测序文库，文库制备完成后使用Agilent Bioanalyzer 2100 进行精确定量，要求DNA浓度大于5ngAiL，A260/A280>l.8，A260/A230>2.0。
[0080] D.高通量测序：等量的DNA测序文库使用Illuminate Library Normalization Solutions进行平衡后按照Illuminate NextSeq 500测序仪操作进行上样测序，测序结束 后，对获得的序列进行拼接后使用软件进行比对分析，筛选出发生突变的基因位点。根据收 集的样本检测发现，正常人组织中未检测出任何突变位点，非小细胞肺癌样本中检测出多 个突变，特别是检测的EGFR突变结果与临床检测结果一致，临床上使用EGFR靶向药物对该 类患者产生较为理想的治疗效果。这表明本发明可以较好的作为非小细胞肺癌早期诊断或 辅助诊断及筛查、指导医生为患者选取靶向治疗药物，制定个性化的治疗方案的手段。
[0081 ] 实施例2
[0082] 使用SEQ No. 1~SEQ No.96引物，对从石蜡包埋的非小细胞肺癌组织中提取的基 因组DNA进行多重PCR扩增，扩增产物经连接接头等处理后，使用Ion PGM测序仪进行测序分 析，具体实施方法如下：
[0083] A.基因组DNA提取：使用Invitrogen MagMAX FFPE DNA Isolation Kit，按照生产 商建议的操作步骤，进行石蜡包埋组织基因组DNA的提取。所得的基因组DNA使用Qubit 3.0 荧光计进行质量检测，要求其浓度大于20ngAiL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0。基因组 DNA上包括本发明所需的。
[0084] B ·多重PCR扩增：对步骤A基因组DNA上AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、 FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA和PTEN这12个目的基因上含有的466个突变位点的区域进行多重 PCR扩增，使用引物SEQ No.l~SEQ No.96。
[0085]具体的反应体系为：
[0087] 多重PCR反应条件为：
[0089] 多重PCR完成后，按照生产商提供的PCR产物纯化方法，在每个样品管中加入70yL Agencourt AMPure XP磁珠，对扩增产物进行纯化，纯化产物溶于30yL TE Buffer中。
[0090] C.测序文库构建:使用限制性内切酶Fsel和PacI对纯化的多重PCR产物进行酶切 处理，使用的酶切反应体系为：
[0092] 酶切反应条件为：37 °C酶切处理1 .5小时。酶切完成后每个样品使用70yL Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，最终获得30yL溶于TE Buffer中的纯化产物。然后在 95°C处理5yL 20μΜ的对应上下游接头引物2min，并使其缓慢冷却到室温后，加入到纯化后 的酶切产物中，使用T4连接酶进行接头的连接。每管中均加入PlAdapter用于连接到Fsel酶 切端，AlAdapter~A8Adapter分别加入到不同管中，以连接到PacI酶切端。所用的连接反应 体系为：
[0095] 连接反应条件为：16°C连接2小时。连接完成后需对连接产物进行纯化，在每个连 接体系中加入70yL Agencourt AMPure XP磁珠，纯化产物最终溶于30μ1 TE Buffer中，此 即为测序文库。文库制备完成后使用Qubit 3.0荧光计进行精确定量，要求A260/A280>1.8， A260/A230>2 · 0，DNA 浓度大于 5ng/yL。
[0096] D.高通量测序:测序文库构建好后，在Ion One Touch 2系统上进行模板制备，具 体实验步骤遵循试剂盒说明书。经乳液PCR、乳液打破、富集珠子等过程后，将富集好的珠子 使用Qubit 3.0焚光计进行定量，要求浓度达到10%~30%。然后使用Ion OneTouch 2富集 系统将珠子上的双链变成单链并进一步富集珠子，使其浓度达到50%以上。最后将制备好 的模板上Ion PGM测序仪进行测序，配套使用Ion PGM Hi-Q Sequencing Kit试剂盒。
[0097] 测序结束后，对获得的序列进行拼接后使用软件进行比对分析，筛选出发生突变 的基因位点。根据收集的样本检测发现，正常人组织中未检测出任何突变位点，非小细胞肺 癌样本中检测出多个突变，特别是检测的EGFR突变结果与临床检测结果一致，临床上使用 EGFR靶向药物对该类患者产生较为理想的治疗效果。这表明本发明可以较好的作为非小细 胞肺癌早期诊断或辅助诊断及筛查、指导医生为患者选取靶向治疗药物，制定个性化的治 疗方案的手段。
[0098] 本发明还可以利用新鲜肿瘤组织、全血、血清、血浆、唾液和尿液进行基因组DNA的 提取，按照实施例2中的方法对基因组DNA上的目的片段进行多重PCR扩增，用到的引物为 SEQ ID No. 1~SEQ ID No.96,然后对多重PCR扩增产物进行酶切后连接测序接头，构建测 序文库，利用高通量测序手段获得目的基因片段的序列信息，最后进行比对分析，筛选出发 生突变的基因位点，这其中用到的方法基本同实施例中所述。本发明的方法对非小细胞肺 癌12个临床已有或正在测试靶向药物的基因的466个突变位点具有检测通量高、特异性强、 样本来源广泛、不易发生污染且安全性高等众多优点，检测结果具有很好的重复性和准确 性，对非小细胞肺癌具有较好的辅助诊断和指导治疗作用。
【主权项】
1. 一种非小细胞肺癌祀向治疗基因检测方法，其步骤包括： A. 从待测样品中提取基因组DNA; B. 使用非小细胞肺癌祀向治疗基因特异性引物SEQ ID No. 1~SEQ ID No.96,对步骤A 中提取的基因组DNA上的目的片段进行多重PCR扩增； C. 对步骤B中得到的多重PCR扩增产物进行酶切后连接测序接头，构建测序文库； D. 对步骤C中构建的测序文库进行高通量测序，获得目的基因片段的序列信息。2. 根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌祀向治疗基因检测方法，其特征在于:检测 的基因为AKT1、ALK、BRAF、EGFR、邸 BB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA 和 PTEN。3. 根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌祀向治疗基因检测方法，其特征在于:步骤 A中的待测样品包括但不限于新鲜肿瘤组织、新鲜活检组织、石蜡包埋组织、全血、血清、血 浆、唾液和尿液;提取基因组DNA时，使用但不限于组织DNA提取试剂盒、石蜡包埋组织DNA提 取试剂盒、全血DNA提取试剂盒、血清DNA提取试剂盒或血浆基因组DNA提取试剂盒。4. 根据权利要求3所述的一种非小细胞肺癌祀向治疗基因检测方法，其特征在于:步骤 A中提取基因组DNA后对DNA进行质量检测，DNA浓度大于20ngAiL，A260/A280〉1.8，A260/ A230〉2.0;步骤B中的特异性引物SEQ ID No. 1~SEQ ID No.96进行多重PCR扩增时同时加 入。5. 根据权利要求4所述的一种非小细胞肺癌祀向治疗基因检测方法，其特征在于:步骤 B中多重PCR扩增的反应体系为：5X PCR Buffer 10yL、25mM的MgCl2 ：3yL、10mM的dNTPs 2μ L、100nM的Primers Mix 10jiL、DNA template 10~20ng、5U/]iL的Taq polymerase ]_yL，用 d地2〇加至50化;步骤B中多重PCR扩增的反应条件为：6. 根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌祀向治疗基因检测方法，其特征在于:步骤 C中进行酶切的酶为限制性内切酶FseI和化CI，酶切反应体系为:纯化的多重PCR产物30化、 肥B CutSmart Buffer 5化、肥B Fsel内切酶10U、肥B PacI内切酶10U，用(1地2〇加至50化； 酶切条件为37°C酶切1~1.5小时。7. 根据权利要求5或6所述的一种非小细胞肺癌祀向治疗基因检测方法，其特征在于： 步骤B中多重PCR扩增产物或步骤C中的酶切产物均使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯 化，5化L PCR反应体系或SOiiL酶切反应体系中加入70μΙ Agenco脚t AMPure XP磁珠。8. 根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌祀向治疗基因检测方法，其特征在于:步骤 C中连接测序接头的连接体系为：纯化的酶切产物30化、lOiiM的测序接头lyL、T4连接酶 Buffer 5化、T4DNA连接酶抓，用d地2〇加至50化;连接反应条件为16°C连接1~2小时。9. 根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌祀向治疗基因检测方法，其特征在于:步骤 C中的连接产物使用Agencourt AM化re XP磁珠进行纯化，5化L连接反应体系中加入70化 Agencoud AMPure XP磁珠，纯化的连接产物即为测序文库，测序文库的DNA浓度大于20ng/ μΙ,Α260/Α280>1.8,A260/A230>2.0〇10.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌祀向治疗基因检测方法，其特征在于：步 骤D中获得目的基因片段的序列信息后，与正常的基因序列进行比对分析，得到目的基因片 段的突变信息。
【文档编号】C12Q1/68GK105969857SQ201610319838
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】林文楚, 王伟, 洪波, 李红, 高小平, 王伙刚
【申请人】中国科学院合肥物质科学研究院