基于lmp-1抗原的dc细胞、靶向性免疫细胞群及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及DC细胞、靶向性免疫细胞群及其 制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是人类主要的致死性疾病类型，死亡率居高不下。卫生部最新统计数据 表明恶性肿瘤居我国居民前十位死因首位。2010年中国恶性肿瘤发病患者268万人，死亡 197万人；目前全国共有恶性肿瘤患者600余万人。每年用于恶性肿瘤病人的医疗费用约 占卫生总费用的20%，是全社会最大的医疗负担。目前的治疗手段对于达到治愈、延长恶性 肿瘤患者生存期以及改善生活质量等目标的作用仍然十分有限，尤其对于某些类型的恶性 肿瘤即使是早期诊断也难以获得满意的疗效，至于转移性、全身性或进展期的恶性肿瘤则 更难以治愈。
[0003] 目前的肿瘤治疗策略中，手术和放疗等局部治疗对局限性肿瘤有较好的疗效，而 对于全身性、转移性或局部治疗后的微小残留病灶则主要依靠化疗或免疫疗法进行系统性 治疗。肿瘤发病是多步骤、多基因作用的结果，肿瘤细胞表现出生长、分化与凋亡的失控。临 床上病人症状的多样性和个体遗传异质性，以及肿瘤远处转移病灶的出现，使肿瘤治疗必 须以全身性疾病的观点，采用个体化的综合治疗方案。即根据每个肿瘤病人的特点，采用局 部治疗结合全身治疗；不仅要消除局部病灶的肿瘤，还要控制肿瘤的复发、转移生长及肿瘤 对重要脏器的侵袭，才能真正有效地提高肿瘤病人的治愈率和生存期。通常肿瘤局部病灶 的治疗可采取手术和物理治疗（包括射频消融、热疗、放疗、冷冻、超声波及激光治疗等）方 法消除，然而对于影像学不能发现的肿瘤微小病灶（如转移复发灶、局部治疗后的残留病 灶、血液中的癌细胞），以上局部治疗手段则无能为力，必须通过全身性治疗手段加以解决。 由于肿瘤的转移、复发、扩散更为致命，因此全身性治疗显得尤为重要和紧迫。目前全身性 治疗有传统化学治疗、分子祀向药物治疗、生物治疗（包括干细胞移植治疗和免疫细胞治 疗）以及基因治疗等。传统化疗虽然在某些肿瘤治疗方面取得了一些进展，但对延长肿瘤 病人生存期方面仍然贡献不大。而且肿瘤细胞对化疗药的天然耐药和获得性多药耐药以及 化疗毒性，使化学治疗的发展受到了严重的妨碍。多年来的临床实践证明它并非是全身治 疗的优势项目。
[0004] 免疫细胞治疗是近二十年发展起来的，免疫细胞治疗主要包括CIK和DC细胞。由 于它治疗范围广（可用于实体肿瘤及白血病），特别对肿瘤微小病灶（包括转移、复发灶、 血液中的癌细胞）更为有效，无毒副作用，而且适用于肿瘤各阶段（如晚期放、化疗不能使 用），并且同样适用于病毒感染；因此它是全身治疗的一个优势项目。免疫细胞治疗对提高 生命质量、延长生存期有显著的效果，倍受国内外推崇，是目前全身治疗的最佳手段之一， 临床潜力巨大。
[0005] 然而，目前用于进行免疫细胞治疗的免疫细胞的制备方法仍有待改进。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种安全、高效的制备DC细胞和靶向性免疫细胞群的方法。
[0007] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0008] 随着生物治疗技术的发展，对恶性肿瘤进行免疫治疗已成为研宄热点，免疫治疗 是肿瘤治疗的一种崭新模式，尤其是细胞介导的过继免疫治疗已较为成熟已经进入临床应 用阶段，并取得了明显的治疗效果。细胞介导的过继免疫治疗已成为肿瘤患者放、化疗后辅 助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具 有良好效果。人们通过研宄淋巴因子一激活的杀伤（LAK)细胞、肿瘤浸润淋巴（TIL)细胞、 细胞因子诱导的杀伤（CIK)细胞等，表明CIK细胞是一种新型、高效、具有广谱杀瘤活性的 非主要组织相容性复合体（MHC)限制性免疫效应细胞，在肿瘤免疫治疗中显露出巨大的应 用价值。树突状细胞OC)是人体内功能强大的主要的抗原递呈细胞，能诱导出抗原特异性 细胞毒淋巴细胞（CTL)反应并可通过直接或间接方式影响0细胞（胰腺的胰岛中能产生 胰岛素的细胞）的增殖，活化体液免疫应答。将CIK细胞和DC联合治疗恶性肿瘤，有助于 解除肿瘤患者的T细胞免疫无能，有协同抗肿瘤的作用。越来越多的试验和临床实践表明 的细胞因子诱导的杀伤细胞联合树突状细胞对恶性肿瘤的治疗（CIK/DC细胞治疗）显示出 良好的治疗效果，有着巨大的发展潜力和应用前景。
[0009] 其中，CTL细胞是⑶8+的T细胞亚群，为一种特异T细胞，对某些病毒、肿瘤细胞 等具有直接杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤的重要防线。CTL杀伤机制 有：①释放穿孔素，颗粒酶，裂解靶细胞。②通过FasL介导靶细胞的凋亡。
[0010] 基于DC的抗原负载技术主要类型有：肿瘤抗原肽冲击DC;肿瘤细胞性抗原冲击 DC;肿瘤细胞RNA冲击DC;基因修饰DC的免疫治疗。发明人发现，肿瘤抗原多肽负载DC是 应用肿瘤抗原多肽在体外冲击致敏DC，然后回输或免疫接种至荷瘤宿主，能明显诱导机体 产生抗原特异性CTL，产生保护性免疫反应，目前所有的dc负载抗原作为疫苗来开发的，在 机体内产生抗体及CTL，没有在体外制备CTL细胞。由于抗原在体内激起的免疫反应有可能 产生系统性字体免疫的可能，发明人利用该技术在体外制备CTL细胞及综合免疫细胞群， 可以解决目前的问题。另外，目前有用各种载体作为抗原，rAAv等病毒类载体负载抗原制 备CTL技术的，ACTL技术就是其中之一，但是由于病毒的整合特性，导致DC细胞的基因组 毒性问题一直解决不了，所以发明人利用mRNA抗原技术替代病毒类或DNA类的载体，从安 全性上超过了病毒类载体，同时从产业化角度上来看，mRNA体外转录更能实现产业化，操作 简单，质控及质检可以标准化。
[0011] 换言之，本发明利用mRNA-DC-CTL技术制备靶向性免疫细胞群，具体地：将病毒相 关抗原决定簇的mRNA转染患者的外周血单核细胞（Monocytes)，经细胞因子诱导，单核细 胞转化为具有强大抗原提呈功能的DC细胞。将经此技术获得的DC细胞，在体外刺激患者 的T淋巴细胞，产生有效杀伤病毒的细胞毒性T淋巴细胞（CytotoxicTlymphocytes,CTL)。 所产生的CTL具有病毒抗原特异性，即靶向性，仅针对某种或数种特定病毒相关抗原阳性 的病毒具有杀伤作用，对抗原阴性的细胞无任何作用。
[0012] 进而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备DC细胞的方法。根据本发 明的实施例，该方法包括以下步骤：将单核细胞进行第一诱导分化培养，以便获得未成熟的DC细胞；利用LMP-1抗原mRNA转染所述未成熟的DC细胞，以便获得经过转染的未成熟DC 细胞；以及将所述经过转染的未成熟DC细胞进行第二诱导分化培养，以便获得成熟的DC细 胞，其中，所述单核细胞是从样本的外周血单个核细胞中分离获得的。
[0013] 发明人惊奇地发现，利用本发明的方法能够安全高效地制备DC细胞（即树突状细 胞），且本发明的方法成本低、效率高、且能够有效地解决细胞毒性问题，获得的DC细胞回 输患者后安全无毒，能够有效用于免疫细胞治疗，且该DC细胞还能够有效用于刺激同样患 者来源的淋巴细胞产生富含大量CTL细胞的靶向性免疫细胞群，进而用于肿瘤及人类疱瘆 病毒感染的免疫治疗后效果更好。
[0014] 另外，根据本发明上述实施例的制备DC细胞的方法还可以具有如下附加的技术 特征：
[0015] 根据本发明的实施例，所述LMP-1抗原mRNA是通过以下步骤获得的：制备LMP-1 抗原cDNA质粒，所述LMP-1抗原cDNA的核酸序列如SEQIDNO: 1所示；将所述LMP-1抗原 cDNA质粒进行线性化处理，以便获得经过线性化处理的LMP-1抗原cDNA质粒；以及将所述 经过线性化处理的LMP-1抗原cDNA质粒进行体外转录，以便获得LMP-1抗原mRNA。由此， 能够有效制备获得LMP-1抗原mRNA。
[0016] 根据本发明的实施例，以pcDNA3. 1载体为骨架载体，制备所述LMP-1抗原cDNA质 粒。由此，制备效率高，效果好。
[0017] 根据本发明的实施例，所述pcDNA3. 1载体具有BamhI、Xbal和Bstll07I酶切位 点。由此，能够有效进行质粒克隆和后续的线性化处理。
[0018] 根据本发明的实施例，基于酶切位点Bstll07I进行所述线性化处理。
[0019] 根据本发明的实施例，利用ITMessage Machine试剂盒进行所述体外转录。由此， 转录效率高、效果好。
[0020] 根据本发明的实施例，在进行所述体外转录后，进一步包括除杂纯化的步骤。由 此，有利于后续LMP-1抗原mRNA转染的进行。
[0021] 根据本发明的实施例，利用电转或PEI法进行所述转染。由此，转染效率高、效果 好。
[0022] 根据本发明的实施例，利用PEI法进行所述转染，其中，PEI与所述LMP-1抗原 mRNA的混合质量比为3:1。由此，转染效果突出。
[0023] 根据本