一种长非编码rna及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用

一种长非编码rna及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用
【专利摘要】本发明涉及一种长非编码RNA及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用，所述长非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该长非编码RNA的表达量能够较好的反应NSCLC的预后情况，同时，针对性的沉默该基因能够抑制NSCLC的发展。
【专利说明】
一种长非编码RNA及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，特别涉及一种长非编码RNA及其在诊断/治疗非小细胞 肺癌中的应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是全球最常见恶性肿瘤之一，是恶性肿瘤相关死亡的主要原因，将近80%的 肺癌是非小细胞肺癌（NSCLC)，非小细胞肺癌包括多种组织学亚型如腺癌、鳞状细胞癌 (SCC)，和大细胞癌(LCC)。尽管目前外科治疗、非小细胞肺癌化疗及分子靶向治疗的得到了 长足的发展，但病人总体5年生存率仍然低于15%。随着测序技术和肿瘤生物学的快速发 展，基因诊断和分子祀向治疗成为非小细胞肺癌治疗中一个热点问题。因此，研究参与非小 细胞肺癌的发生发展和转移的分子机制，对制定特定的诊断方法和个性化的治疗策略至关 重要。
[0003] 在过去的十年里，基于快速出现的高通量测序的基因表达分析技术和生物信息学 推动了大规模的人类基因组学的研究，进而发现了非编码RNAs。人类基因组中只有2%的编 码转录成蛋白，而绝大多数转录成非编码RNAs，包括小分子核糖核酸、长非编码RNA (IncRNAs)和假基因。最近，miRNA在细胞进程的各个方面的作用已经得到证实，然而， IncRNAs的功能研究不是很透彻。ENCODE计划中GENEC0DE研究组新数据显示有成千上万的 IncRNAs，但只有其中的一些有生物学功能。有趣的是，这些IncRNAs通过染色质重塑参与调 控多种细胞进程，包括重组干细胞多能性，父母的印记和肿瘤细胞的扩散和转移以及表观 遗传修饰和吸附miRNAs。
[0004] 最近，大量的研究显示，异常IncRNAs表达与多样的人类疾病特别是恶性肿瘤相 关。例如，IncRNAROR可通过抑制甲基转移酶G9A，促进TESC的启动子区H3K9去甲基化参与肿 瘤发生。同时，A0C4P通过与波形蛋白绑定和促进其降解，抑制上皮间质转化(EMT)从而抑制 肝细胞癌转移。此外，上调的LUADT1通过与SUZ12绑定并抑制P27的表达，促进肺腺癌的细胞 增殖。这些发现表明IncRNAs在人类恶性肿瘤发生发展过程中扮演至关重要的角色。因此， 发现更多的肿瘤相关的IncRNAs并研究他们的生物功能和机制，对更好地理解NSCLC肿瘤发 生发展的的分子生物学有重要的意义。
[0005] AGAP2-AS1是一条长度为1567nt的IncRNA，其位于人类染色体12ql4.1。我们发现 AGAP2-AS1在NSCLC组织和细胞中上调，并且它的过表达与患者不良预后相关。在上调或敲 除AGAP2-AS1后，研究了 AGAP2-AS1在NSCLC肿瘤发生和发展的作用并研究了 AGAP2-AS1在 NSCLC细胞中的靶基因。。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是提供用于诊断非小细胞肺癌(NSCLC)预后情况或作为治疗非小细 胞肺癌药物靶点的长非编码RNA(AGAP2-AS1)，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1，
[0007] SEQ ID NO. 1:
[0009] 本发明还涉及识别所述的长非编码RNA的标记物在制备判断非小细胞肺癌治疗预 后情况的诊断产品中的应用，所述的标记物包括但不限于：
[0010] (1)结合所述长非编码RNA的引物/引物组或荧光标记的结合所述长非编码RNA的 弓丨物/引物组；
[0011] (2)结合所述长非编码RNA的小分子化合物；
[0012] (3)结合所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于:抗体 或抗体功能片段、荧光标记的抗体或抗体功能片段、RNA结合蛋白或其功能片段、荧光标记 的RNA结合蛋白或其功能片段。
[0013] 优选的，所述的引物组或荧光标记的引物组的核苷酸序列如SEQ ID N0.4和SEQ ID NO .5所示，
[0014] Primer F(SEQ ID NO:4):
[0015] 5 '-TACCTTGACCTTGCTGCTCTC-3 '，
[0016] Primer R(SEQ ID NO:5):
[0017] 5 '-TGTCCCTTAATGACCCCATCC-3 '。
[0018] 本发明还涉及包含所述的识别所述的长非编码RNA的标记物的用于判断非小细胞 肺癌治疗预后情况的试剂或试剂盒。
[0019] 本发明还涉及所述的识别所述的长非编码RNA的标记物或包含所述标记物的试剂 或试剂盒在判断非小细胞肺癌的治疗预后情况中的应用。
[0020] 本发明还涉及抑制所述的长非编码RNA的抑制剂在制备治疗非小细胞肺癌的药物 中的应用，所述的抑制剂包括但不限于：
[0021] (1)抑制所述长非编码RNA的siRNA、shRNA或功能类似的干扰小RNA;
[0022] (2)抑制所述长非编码RNA的小分子化合物；
[0023] (3)抑制所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于:抗体 或抗体功能片段、高底物专一性的酶或其功能片段。
[0024]优选的，所述的抑制所述长非编码RNA的siRNA的编码DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO .2或SEQ ID NO .3所示，
[0025] SEQ ID N0.2:(5'to3'）CCACTCCACCTCAAACTCTTACCTT，
[0026] SEQ ID N0.3:(5'to3'）GGGTCATTAAGGGACAGAGTTCAAG。
[0027] 本发明还涉及包含所述的抑制剂的用于治疗非小细胞肺癌的药物或药物组合物。
[0028] 本发明还涉及所述的抑制剂或包含所述的抑制剂的药物或药物组合物在治疗非 小细胞肺癌中的应用。
[0029] 本发明还涉及所述的长非编码RNA在作为筛选判断非小细胞肺癌预后情况的诊断 试剂中的应用。
[0030] 本发明还涉及所述的长非编码RNA在作为筛选治疗非小细胞肺癌的药物中的应 用。
[0031] 技术方案
[0032] 组织收集
[0033]我们收集了 80对2010年至2011年在江苏省医院接受手术，组织均经病理学诊断为 非小细胞肺癌，术前均未进行局部或全身治疗的配对的非小细胞肺癌和邻近的正常组织。 并记录临床病理的特点：包括淋巴结转移、TM1分期和肿瘤大小。组织样本收集的均为第一 时间液氮或储存在_80°C，直至RNA提取。该研究经过南京医科大学伦理委员会批准。获得所 有病人的书面知情同意。
[0034]细胞系
[0035] 五种腺癌细胞系（A549，PC9SPC-A1，H1975和H1299)，三种鳞状细胞癌（H520，SK- MES-1和H1703)和一个正常支气管上皮细胞系16HBE购自中国科学院典型培养物保藏委员 会细胞库（中国上海）DA549，H1975，H1299，H520细胞用RPMI 1640培养基培养；16HBE，PC9， SPC-A1，SK-MES-1细胞用DMEM培养基(GIBC0-BRL)培养，培养基中均含有10 %的胎牛血清、 100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素。5%C02的37°C恒温培养箱中常规培养。每2-3天更 换新鲜培养基，当细胞融合度达到80%_90%时传代。所有细胞系被短串联重复序列的DNA 分析验证。
[0036] RNA提取和定量PCR分析
[0037] 根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应应用TaKaRa Prime Script试剂盒(TaKaRa，大连，中国）。逆转录试剂盒对lyg总RNA进行逆转录，最终体积为20μ 1。结果分析:分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩 增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式 为：2~ (_ACt)，ACt = Ct gene-Ct control 〇
[0038] 质粒构建
[0039] 合成人全长AGAP2-AS1 cDNA，并将其插入真核表达载体pCDNA 3. 1中，构建 AGAP2-AS1过表达载体质粒，随后将上述质粒转化大肠杆菌，摇菌、培养、挑选单克隆菌培养 扩增。直接靶向AGAP2-AS1的shRNA的编码DNA由上海吉玛公司合成。
[0040] 细胞转染
[0041 ]用于转染的质粒载体（pCDNA-AGAP2-ASl、sh-AGAP2-ASl、pCDNA-LATS2、pCDNA-KLF2和空载体质粒），均用去除内毒素的质粒提取试剂盒(DNA Midipr印试剂盒，Qiagen)提 取。AGAP2-AS1、LATS2的干扰序列及乱序对照（si_NC)均购自Invitrogen公司（Invitrogen 公司，CA，USA)。将细胞HI299和HI975按每孔2 X 105个细胞种于6孔培养板，待细胞贴壁后， 于转染前12h吸弃原有培养基，换成无双抗培养基;取10yL脂质体稀释于250yL的0ΡΤΙ-ΜΕΜ 中，温和吹打混匀室温下孵育5min;取lOOpmol siRNA，si-NC或4ug质粒载体分别稀释于250 yL 0ΡΤΙ-ΜΕΜ中，吹打混匀室温下孵育5min;将孵育好的脂质体与siRNA或质粒稀释液混合， 温和吹打混匀。于室温下继续孵育20min;将上述混合物均匀滴入事先加好1.5mL 0ΡΤΙ-ΜΕΜ 的6孔培养板中，轻轻混匀。37 °C，5 %C02培养箱中继续培养6h后，换完全培养基。转染后 48h，收集细胞提取RNA或蛋白进行实时定量RT-PCR或免疫印迹分析。sh-AGAP2-ASl或空质 粒稳转H1299细胞系在转染sh-AGAP2-ASl或空质粒后用G418筛选两周，随后收集克隆细胞 进行体内肿瘤形成实验。
[0042] 细胞增殖活性检测
[0043] MTT实验，将处理后的细胞按每孔1500-2000个细胞接种于96孔培养板。待细胞 80%贴壁后，细胞同步化12h，弃去原有培养基。每个样本设置6个复孔，每孔总反应体积为 200μ1。每孔加入20μ1的MTT反应液(5mg/ml，溶于roS)，37°C避光孵育4h。弃去上清液，每孔 加入150μ1二甲亚砜(DMS0)，震荡10min，酶标仪测定490nm波长处的吸光度。
[0044] EdU实验，将适量处理后的细胞中在24孔板中，每孔加入10μΜ EdU试剂。2h后，用 4%多聚甲醛固定30分钟。清洗，使用Click-iTR Edu试剂盒染色30分钟，随后用DAPI染色5 分钟，随后使用荧光显微镜拍摄(奥林巴斯，日本）。最后，使用Image-Pro Plus软件分析。 [0045] 流式细胞术
[0046] 凋亡检测，用胰酶消化收集转染48小时后的H1299和H1975细胞，随后根据FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(BD)及其使用说明予以Annexin V-FITC荧光探针和碘化丙锭 (PI)染色。流式细胞仪检测和分析。
[0047] 细胞周期检测，根据说明书使用CycleTESTTM PLUS DNA试剂盒(BD)予以PI染色， 随后用FACScan分析。
[0048]细胞迀移和侵袭实验
[0049] 24孔板中放置8μπι孔径大小的Transwell小室。细胞侵袭实验，用50mg/l BD Matrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，包被好的小室放入24孔板中，孵 箱中孵育2h。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养 基重悬。调整细胞密度至lxl〇 5。取细胞悬液200μ1加入Transwe 11小室。24孔板下室加入500 μL含10 %FBS的培养基，放入孵箱中常规培养24h。细胞迀移实验，调整细胞密度至1-10xl04。取细胞悬液200μ1加入Transwell小室。24孔板下室加入500μ1含10%FBS的培养基， 放入孵箱中常规培养24h。取小室，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用0.1 %结晶紫将小 室外底面的细胞染色利用倒置显微镜对Transwell小室底膜上下室侧附着的染色的细胞拍 照计数。
[0050]肿瘤形成实验
[00511 4周龄雌性裸鼠 BALB/c小鼠，购自南京大学模式动物中心;培养H1299细胞，分别转 染sh-AGAP2-ASl或空载体;细胞转染后48小时，胰酶消化，PBS洗两遍，重新悬浮在无血清培 养基中，并计数。2组细胞均取1 X 107个细胞悬浮在0. lml无血清DMEM培养基中，皮下注射建 立体内肿瘤形成模型。每三天测量一次肿块生长情况。18天后，处死裸鼠，测量皮下肿瘤组 织大小。以上所有的实验程序均按着NIH1996年版的动物实验指导来执行的。用全价颗粒饲 料喂养小鼠，自由饮水，室温(22 ± 2) °C，湿度50~60 %，通风良好，12:12h光照/黑暗周期。 所有实验均经过南京医科大学动物保护和伦理委员会(IA⑶C)批准。
[0052] 亚细胞结构定位
[0053] 根据使用说明书使用PARIS试剂盒(Life Technologies，USA)分离NSCLC细胞系细 胞核和细胞质。使用qPCR方法检测AGAP2-ASUGAPDH和U1在细胞质和细胞核中的分布。 GAPDH为细胞质参照，U1为细胞核参照。以总RNA百分比呈现AGAP2-AS1、GAPDH和U1在细胞质 和细胞核中的表达情况。
[0054] RNA免疫印迹
[0055] 裂解H1299和H1975细胞供内源性PRC2复合物和LSD1免疫印迹实验使用。将细胞上 清与包被分别识别EZH2、LSD1、SNRNP70和对照IgG的蛋白A/G琼脂糖磁珠在4 °C孵育6个小 时。随后，清洗磁珠，用〇. 1 % SDS/0.5mg/ml蛋白酶K在55°C孵育30分钟以去除蛋白。提取RNA 供qPCR分析。
[0056]染色质免疫共沉淀
[0057] 使用4%多聚甲醛固定H1299和H1975细胞，孵育10分钟以产生DNA-蛋白交联。超声 裂解细胞以产生200_300bp的染色体碎片，随后用EZH2、H3K27me3、LSDl和H3K4me2特异性抗 体和对照IgG抗体孵育沉淀。恢复染色质DNA，随后使用qPCR检测分析。
[0058]蛋白质免疫印迹
[0059]将变性好的细胞蛋白裂解产物加入至预先制好的10%变性聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)的加样孔中，分离样本中蛋白。随后转至NC膜，并以特异性抗体孵育。最后用ECL发光 液压片曝光。GAPDH抗体为对照，LATS抗体购自CST公司，KLF2抗体购自sigma公司。
[0060] 数据处理
[0061] 实验数据皆用SPSS17.0软件分析，以三次实验的平均值土标准误表示，组间差异 用双尾31：11(16111:'8 1'检验、秩和检验和卡方检验。0?3和03分析用1^口1311-]\^丨61'方法。生存数 据还用单因素和多因素 Cox比例风险模型分析。基于Cox回归分析，单因素分析中p〈0.05的 随后再使用多因素分析。相关性分析用线性回归模型分析AGAP2-AS1和LATS2或KLF2表达间 的联系。计算双尾P值，选取a = 0.05的检验水准。
【附图说明】
[0062] 图l、lncRNA AGAP2-AS1在NSCLC组织中表达上调，并与病人预后差密切相关。
[0063] lA:lncRNA AGAP2-AS1在NSCLC组织表达较正常组织上调；
[0064] 1B:AGAP2-AS1的表达在72.5%(58/80)的癌组织中较正常组织表达增加（倍数> 1·5，Ρ〈0·01);
[0065] 1C:根据相对AGAP2-AS1肿瘤组织中的表达，将80位NSCLC患者分为两组:高AGAP2-AS1组(n = 40,倍数彡平均比率）；和低AGAP2-AS1组(n = 40,倍数彡平均比率）；
[0066] 10:总体生存率(03)，高464?2431组3年以上为17.8%，低464?2431组为34.6%。 高AGAP2-AS1组平均生存时间是24个月，低AGAP2-AS1组则为31个月；
[0067] 1E:无进展生存(PFS)，高AGAP2-AS1 组为11 · 6%，低AGAP2-AS1 组为30 · 2%。中位生 存时间，高AGAP2-AS1组是20个月，而低AGAP2-AS1组则为29个月。
[0068] 图2、RNAi技术敲低AGAP2-AS1的表达抑制NSCLC细胞的增殖能力
[0069] 图2A和图2B:AGAP2-AS1的过表达促进A549和SPCA1细胞增殖；
[0070] 图2C:克隆形成试验结果表明，下调AGAP2-AS1后H1299和H1975细胞克隆形成能力 减弱，而AGAP2-AS1过表达后增强了A549和SPCA1细胞克隆形成能力；
[0071]图2D: EDU染色证明，敲低AGAP2-AS1后减少非小细胞肺癌细胞的增殖，而过表达 AGAP2-AS1后非小细胞肺癌细胞增殖增强；
[0072] 图2E:H1299H1975细胞转染si-AGAP2-ASl后细胞周期阻滞在G1/G0期 [0073] 图3、RNAi技术敲低AGAP2-AS1的表达诱导NSCLC细胞凋亡
[0074] 3A:早期凋亡(UR)和晚期凋亡率(LR)在AGAP2-AS1敲低的H1299和H1975细胞中高 于对照组细胞；
[0075] 3B:在转染AGAP2-AS1 siRNA的H1299和H1975细胞中Tunel染色阳性细胞(绿、蓝、 核)率高于对照组细胞；
[0076] 3C和3D:敲低AGAP2-AS1后抑制了非小细胞肺癌细胞迀移能力约70%，抑制侵袭能 力60% 〇
[0077]图4、敲低AGAP2-AS1的表达抑制NSCLC细胞的体内成瘤能力
[0078] 4A: sh-AGAP2-ASl组明显小于对照组；
[0079] 4B: sh-AGAP2-ASl组肿瘤重量（0 · 22 ±0 · 09g)与空载体组（0 · 085 ±0 · 02g)比较显 著降低；
[0080] 4C:在肿瘤组织中用qPCR检测AGAP2-AS1表达水平，转染sh-AGAP2-ASl细胞形成瘤 中AGAP2-AS1表达水平低于对照组细胞形成瘤；
[0081 ] 4D:sh-AGAP2-ASl转染H1299细胞形成瘤中Ki67阳性减少Tunel阳性增加，表明敲 低AGAP2-AS1后可以在体内抑制肿瘤的生长。
【具体实施方式】
[0082]以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。
[0083] 一般性说明：
[0084]实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的 《分子克隆实验指南（第3版）》(]\1〇16。11131^1〇11；[1^:4]^1130抑1：0^]\^1111131，31(16(1.黄培堂等 译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进 行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。
[0085]本发明的材料:本申请中提及的细胞株、慢病毒干扰载体以及培养基均有商品供 应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的 工具和生物材料来代替。
[0086] 实施例1检测AGAP2-AS1在组织和细胞中的表达情况
[0087]取0. lg组织，液氮研磨充分(成粉末状)或1-5X 107细胞弃培养基，预冷的PBS润洗 2次。加入lml的Trizol裂解液，以无酶枪头吹打混匀，静置5min，将裂解液移入预先标记好 的无酶1.5ml的离心管中。4°C7500g离心5分钟，取上清加入1/5体积的氯仿，颠倒混勾30s， 静置2min。4°C，12000g离心，15min。溶液分三层(水相-白色沉淀-红色有机物），转移水相层 至新的1.5ml离心管中，尽量不要吸到白色沉淀。加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置5_ 1〇11^11。4°(：，1200(^离心，1〇1^11。吸弃上清，加入1111175%的乙醇(现配），洗涤8祖沉淀。4°(：， 7500g离心，5min，弃上清。尽量去除75%的酒精，于室温中晾干，约15min。用无 RNA酶水 (20-25μ1)溶解 RNA 沉淀。
[0088] 紫外吸收测定法测定RNA的浓度。使用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，测量 前先用溶解RNA用的DEPC水调零。在260nm处读值1为表示40ngAU，RNA溶液的Α260/Α280的 比值用于RNA纯度的检测，比值范围在1.8到2.1表明符合要求。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的 完整性。配制1 %的琼脂糖胶。加热溶解琼脂糖，冷却，加入ΙμL溴化乙锭(EB，10mg/ml)。摇匀 后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1XTAE缓冲液中平衡lOmin，待用。点样。按l:4(v/ v)将5 X核酸电泳上样缓冲液与样本混合，准确将各样本含有lyg的RNA加入凝胶孔中。80V 恒压电泳50min。电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。
[0089] Tris-乙酸(TAE)缓冲液配方（1L)50X :
[0091] 实时定量PCR
[0092] NSCLC组织及癌旁组织标本，NSCLC细胞的总RNA，逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(大连宝生物工程有限公司）。逆转录反应体系如下：
[0094] 反转录反应条件如下：37°C 15min(反转录反应）；85°C 5sec(反转录酶的失活反 应）。根据Genebank提供的基因序列，设计引物序列，
[0095] QPCR应用7300PCR系统（Applied BiosystemsJarringtor^UKhcDNA样品采用三 部法PCR扩增标准程序。反应体系：
[0097]反应条件：
[0099] 结果分析:分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。 根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GATOH进行目的基因相对表达量的分析。计算 公式为：2 (-ACt)，ACt = Ct gene-Ct control。
[0100] AGAP2-AS1 的引物如下：
[0101] Primer F(SEQ ID NO：4)：
[0102] 5 '-TACCTTGACCTTGCTGCTCTC-3 '，
[0103] Primer R(SEQ ID NO：5)：
[0104] 5 '-TGTCCCTTAATGACCCCATCC-3 '
[0105] 结果表明，IncRNA AGAP2-AS1在NSCLC组织表达较正常组织上调（图1A)。我们利用 实时定量PCR检测了 80对NSCLC组织/癌旁正常组织中AGAP2-AS1的表达水平。结果显示与癌 旁正常组织相比，AGAP2-AS1的表达在72.5% (58/80)的癌组织中较正常组织表达增加(倍 数>1.5，P〈0.01)(图1B)。此外，我们将AGAP2-AS1的表达与非小细胞肺癌患者临床特征之间 的关系进行了分析，结果表明：上调的AGAP2-AS1水平与非小细胞肺癌患者肿瘤大小（p〈 0.01)，和病理分型晚（P〈〇.〇l)有关。然而，AGAP2-AS1表达水平与其他参数如性别（p = 0.822)和年龄(p = 0.823)无关(表1)。
[0106] Kaplan-Meier生存函数进行生存分析，进一步探讨AGAP2-AS1表达与NSCLC患者预 后之间的相关性。根据相对AGAP2-AS1肿瘤组织中的表达，将80位NSCLC患者分为两组：高 AGAP2-AS1组(η = 40，倍数彡平均比率）；和低AGAP2-AS1组(η = 40，倍数彡平均比率）（图 1〇。总体生存率（03)，高厶64?2-431组3年以上为17.8%，低厶64?2431组为34.6%。高 AGAP2-AS1组平均生存时间是24个月，低AGAP2-AS1组则为31个月（图1D)。无进展生存 (PFS)，高AGAP2-AS1 组为 11 · 6 %，低AGAP2-AS1 组为30 · 2 %。中位生存时间，高AGAP2-AS1 组 是20个月，而低AGAP2-AS1组则为29个月（图1Ε)。
[0107] 表1NSCLC患者的临床表型与AGAP2-AS1表达关联情况
[0110] *0verall P<0.05.
[0111] 实施例2构建AGAP2-AS1慢病毒干扰载体转染细胞：
[0112] 设计特异性的针对AGAP2-AS1的干扰序列，其编码的DNA序列为：
[0113] Seq ID N0.2:(5，to3，）CCACTCCACCTCAAACTCTTACCTT，
[0114] Seq ID N0.3:(5，to3，）GGGTCATTAAGGGACAGAGTTCAAG。
[0115] 以干扰GATOH基因的序列片作为对照，并将其插入慢病毒载体中（以上载体及片段 由invitrogen公司合成）。将包装好的慢病毒载体感染非小细胞肺癌细胞株H1299和H1975 细胞，起到下调AGAP2-AS1表达的作用，48h后用G418筛选稳定转染细胞系，命名为sh-AGAP2-AS1 (对照为sh-NC)。
[0116] 为了研究AGAP2-AS1对NSCLC细胞表型的影响。MTT检测发现，在H1299和H1975细胞 中敲低AGAP2-AS1表达后抑制细胞生长。相比之下，AGAP2-AS1的过表达促进A549和SPCA1细 胞增殖（图2A和2B)。此外，克隆形成试验结果表明，下调AGAP2-AS1后H1299和H1975细胞克 隆形成能力减弱，而AGAP2-AS1过表达后增强了A549和SPCA1细胞克隆形成能力（图2C)。此 外，EDU染色证明，敲低AGAP2-AS1后减少非小细胞肺癌细胞的增殖，而过表达AGAP2-AS1后 非小细胞肺癌细胞增殖增强（图2D)
[0117] 实施例3 AGAP2-AS1对非小细胞肺癌细胞周期和凋亡的影响
[0118] 为了研究是否AGAP2-AS1对非小细胞肺癌细胞的增殖的影响了细胞周期转换，我 们用流式细胞术分析细胞周期。结果表明，H1299H1975细胞转染si-AGAP2-ASl后细胞周期 阻滞在G1/G0期（图2E)。此外，我们进行了流式细胞仪和Tunel染色分析细胞凋亡是否参与 了 AGAP2-AS1敲低后诱导的细胞生长受抑。如图3A所示，早期凋亡(UR)和晚期凋亡率(LR)在 AGAP2-AS1敲低的H1299和H1975细胞中高于对照组细胞。与此同时，在转染AGAP2-ASlsiRNA 的H1299和H1975细胞中Tunel染色阳性细胞率高于对照组细胞（图3B)。这些数据表明， AGAP2-AS1可促进非小细胞肺癌细胞的增殖。
[0119] 实施例4 AGAP2-AS1参与非小细胞肺癌细胞迀移和侵袭
[0120] 肿瘤细胞浸润和转移肿瘤恶性表型的一个重要方面。我们用transwells研究了 AGAP2-AS1对NSCLC细胞迀移和侵袭能力影响。结果表明，敲低AGAP2-AS1后与对照组细胞相 比，抑制了非小细胞肺癌细胞迀移能力约70%，抑制侵袭能力60% (图3C和D)。这些结果表 明，敲低AGAP2-AS1表达后抑制肿瘤恶性表型，阻碍了非小细胞肺癌细胞迀移和侵袭。
[0121 ]实施例5敲低AGAP2-AS1后抑制非小细胞肺癌细胞体内肿瘤形成 [0122] 探索AGAP2-AS1是否也会影响体内肿瘤发生，我们用sh-AGAP2-ASl(l#)或空载体 稳定转染H1299细胞。MTT分析表明体外转染sh-AGAP2-ASl后抑制H1299细胞生长，克隆形成 试验表明，转染sh-AGAP2-ASl#l后H1299细胞克隆形成能力减弱。接下来，将sh-AGAP2-ASl (1#)或空载体稳定转染H1299细胞注入小鼠皮下。注射后18天后，观察肿瘤形成情况。sh-AGAP2-AS1组明显小于对照组（图4A)。与此同时，sh-AGAP2-AS 1组肿瘤重量(0.22±0.09g) 与空载体组(0.085±0.02g)(图4B)比较显著降低。此外，在肿瘤组织中用qPCR检测AGAP2-ASl表达水平，转染sh-AGAP2-ASl细胞形成瘤中AGAP2-ASl表达水平低于对照组细胞形成瘤 (图4C)。此外，sh-AGAP2-ASl转染H1299细胞形成瘤中Ki67阳性减少Tunel阳性增加（图4D)。 这些数据表明，敲低AGAP2-AS1后可以在体内抑制肿瘤的生长。


【主权项】
1. 一种用于判断非小细胞肺癌(NSCLC)预后情况或作为非小细胞肺癌治疗靶点的长非 编码RNA(AGAP2-AS1)其特征在于，所述长非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 识别权利要求1所述的长非编码RNA的标记物在制备判断非小细胞肺癌治疗预后情 况的诊断产品中的应用，所述的标记物包括但不限于： (1) 结合所述长非编码RNA的引物/引物组或荧光标记的结合所述长非编码RNA的引物/ 引物组； (2) 结合所述长非编码RNA的小分子化合物； (3) 结合所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗 体功能片段、荧光标记的抗体或抗体功能片段、RNA结合蛋白或其功能片段、荧光标记的RNA 结合蛋白或其功能片段。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的引物组或荧光标记的引物组的核苷 酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。4. 包含权利要求2或3所述的标记物的用于判断非小细胞肺癌治疗预后情况的试剂或 试剂盒。5. 抑制权利要求1所述的长非编码RNA的抑制剂在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的 应用，所述的抑制剂包括但不限于： (1) 抑制所述长非编码RNA的siRNA、shRNA或功能类似的干扰小RNA; (2) 抑制所述长非编码RNA的小分子化合物； (3) 抑制所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗 体功能片段、高底物专一性的酶或其功能片段。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的siRNA的编码DNA的核苷酸序列如 SEQIDN0.2SSEQIDN0.3K*。7. 包含权利要求5或6所述的抑制剂的用于治疗非小细胞肺癌的药物或药物组合物。8. 权利要求7所述的药物或药物组合物在治疗非小细胞肺癌中的应用。9. 权利要求1所述的长非编码RNA在作为筛选判断非小细胞肺癌预后情况的诊断试剂 中的应用。10. 权利要求1所述的长非编码RNA在作为筛选治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105969846SQ201610299374
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】李薇, 陈建敏, 张梅玲, 何靓, 卢凯华, 徐静, 束永前
【申请人】江苏省人民医院