小细胞肺癌的诊断方法

专利名称：：小细胞肺癌的诊断方法
技术领域：
：本发明涉及对小细胞肺癌进行检测、诊断和提供预后的方法，还涉及治疗和预防小细胞肺癌的方法。
背景技术：
：肺癌是人类最常见的致命性肿瘤之一。现已报道了许多与肺癌发生和发展有关的遗传变化，但其确切的分子机制尚不明确(Sozzi,(2001)EurJCancer.;37Suppl7:S63-73)。小细胞肺癌(SCLC)在所有肺癌中占15~20%(ChuteJPetal.,(1999)JClinOncol.;17:1794-801,SimonGRetal.,(2003)Chest;123(1Suppl"59S-271S)。虽然许多患者对多药物化学治疗反应良好，^旦马上又会复发。广泛期(extensive-disease,ED)患者中只有不到5%在最初诊断后存活5年以上，而局限期(limited-stagedisease,LD)患者仅有20%通过联合用药疗法(combinedmodalitytherapy)得以治愈(ChuteJPetal"(1999)JClinOncol.;17:1794-801,AlbainKSetal,,(1991)JClinOncol.;9:1618-26，SandlerABetal"(2003)SeminOncol.;30:9-25)。SCLC^皮归类为一种特殊类型的肺肿瘤，其包括共有一定形态学、超微结构、免疫组织化学及分子特征的肺神经内分泌肺瘤。特定的副胂瘤综合征，例如抗利尿激素的不当分泌、异位库兴氏综合征(Cushing，ssyndrome)和伊顿-兰伯特综合征(Eaton-Lambertsyndrome)与SCLC具有特殊的关联性，但至今尚不十分了解神经内分泌肿瘤的详细分子特征。然而，SCLC对化学疗法的初期应答率较高，提示开发有效的新化学治疗方案及靶标化方案的可能性(SattlerM&SalgiaR,(2003)SeminOncol.;30:57-71,WolffNC,etal.,(2004)ClinCancerRes.10:3528-34)。使用cDNA微阵列的基因表达模式分析，使得进行癌细胞中基因表达的综合分析成为可能，并可以明确与之相关的详细的表型信息和生物学信息(GolubTRetal.,(1999)Science.;286:531-7，PomeroySLetal.,(2002)Nature.;415:436-42，van'tVeerLJetal.，(2002)Nature.;415:530-6)。对于数千个基因间的表达水平的系统分析还是鉴定与肺癌发生途径相关的未知分子的有用手段(KikuchiTetal.,(2003)Oncogene.;22:2192-205，KakiuchiSetal.，(2004)HumMolGenet,;13:3029-43&(2003)MolCancerRes.;1:485-99,ZembutsuH,etal.,(2003)IntJOncol.;23:29-39)，这些发现可以显示新抗癌剂和/或诊断标记开发的靶标(SuzukiCetal.，(2003)CancerRes.;63:7038-41,IshikawaNetal.，(2004)ClinCancerRes.;10:8363-70)。发明概述本发明人利用通过〗敫光孩吏束显孩支解剖(lasermicrobeammicrodissection,LMM)纯化的15例SCLC在包含32256种基因的cDNA微阵列上的综合基因表达模式，鉴定了开发肺癌治疗药物或免疫疗法的多个合适候选基因。本发明人还发现特定基因在肺癌的两种最常见组织类型即非小细胞肺癌(NSCLC)和SCLC之间差异性表达。这些结果可以应用于"个人化治疗"。为了鉴定与肺的癌发生相关的、且可以用作新诊断标记的、并且可以用作新药物和免疫治疗的靶标的分子，本发明人构建了使用cDNA微阵列的筛选系统。首先，本发明人使用了展示32256种基因的cDNA微阵列，来分析通过激光微束显微解剖纯化的15例小细胞肺癌(SCLC)的表达模式。本发明人建立了关于在SCLC中显著上调或下调的基因群的详细的全基因组数据库。与对照相比，有776种转录物在超过50%的SCLC中至少0.2倍低表达，另外，有779种基因在超过50%的SCLC中显示5倍高表达。本发明人采用半定量RT-PCR和/或northern印迹分析确认了83种基因在肺瘤组织和正常组织中的表达图式，确认了这些基因是用于新药物和免疫治疗开发以及作为肿瘤标志的合适候选。在这些基因中，本发明人等进一步表征了Zic家族成员5(odd-paired同源物，果蝇(Drosophila);)。用的小干扰RNA(siRNA)处理SCLC细胞的治疗抑制了癌细胞的生长。进而，对通过随机置换检验(random-permutationtest)鉴定的475种基因的表达数据应用聚类算法(clusteringalgorithm)，容易地区分了肺癌的两种主要组织类型，即非小细胞肺癌(NSCLC)和SCLC。特别是，本发明人获得了在SCLC中大量表达的34种基因，其中的数种基因显示出包括神经发生和神经保护在内的神经元功能特征。本发明人还鉴定了68种基因，这些基因在由接受广泛化学治疗的患者采集的晚期SCLC和晚期腺癌(ADC)中均大量表达。其中的一些是公知的转录因子和/或基因表达调控因子，例如7MF5丄、7FC尸2L4、尸7/F20、丄7W04、rCF20、iF^Y2和Z)XFZp547/^^;还有一些编码核苷酸结合蛋白，例如C9o;y76、和G/M4P4。因而，这些数据提供了鉴定此类癌症的新诊断系统和治疗靶分子的有用信息。本发明部分基于与小细胞肺癌(SCLC)相关的基因表达图式的发现。在本文中，小细胞肺癌中差异性表达的基因统称为"SCLC核酸"或"SCLC多核苷酸"，对应的由其编码的多肽称为"SCLC多肽"或"SCLC蛋白"。因而，本发明提供通过检测来源于患者的生物样品，如组织样品中SCLC相关基因的表达水平，来对受试者中的小细胞肺癌进行诊断或预后预测，或确定其发病倾向性(predisposition)的方法。术语"SCLC相关基因"或"小细胞肺癌相关基因"是指其特征在于表达水平在SCLC细胞中相比于正常细胞中的表达水平有差别的基因。正常细胞是从肺组织获得的细胞。在本发明的上下文中，SCLC相关基因是表2-3中列出的基因(即SCLCNos.1-1555所示基因)，或者与表2-3中列出的基因具有至少90%,95%,96%，97%98%或99%的序列同一性、且具有相同功能的基因(例如同源物、遗传变体及多态性)。两个以上的核酸序列的序列同一性可以使用本
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公知的算法来确定(例如BLAST,见下文)。与该基因的正常对照水平相比，基因表达水平的改变或差别，例如增加或减少，表示该受试者患有SCLC或存在发生SCLC的危险。在本发明的上下文中，短语"对照水平"是指在对照样品中检出的蛋白表达水平，其包括正常对照水平和小细胞肺癌对照水平。对照水平可以是来自单个参照群体的单个表达图式，也可以是来自多个参照群体的单个表达图式。例如，对照水平可以是得自以前检测的细胞的表达图式数据库。"正常对照水平，，是指在已知未患小细胞肺癌的正常健康个体或个体群中检出的基因表达水平。正常个体是没有小细胞肺癌临床症状的个体。另一方面，"SCLC对照水平，，是指在患有SCLC的人群中发现的SCLC相关基因的表达模式。与正常对照水平相比，在受试样品中检出的表3中列出的一种或多种SCLC相关基因(即SCLCNos.777-1555所示基因)的表达水平增力口，表明(由其获得样品的)受试者患有小细胞肺癌或存在发生小细胞肺癌的危险。相反，与正常对照水平相比，在受试样品中检出的一个或多个表2中列出的SCLC相关基因(即SCLCNos.1-776所示基因)的表达水平减少，表明该受试者患有SCLC或存在发生SCLC的危险。或者，可以将样品中一系列SCLC相关基因的表达与该系列基因的SCLC对照水平相比较。样品表达与SCLC对照表达之间的相似性表明(由其获得样品的)受试者患有SCLC或存在发生SCLC的危险。根据本发明，当基因的表达与对照水平相比增加或减少10°/。、25%、50%时，视为基因表达水平"发生改变"或"有差别"。或者，当基因的表达与对照水平相比增加或减少至少0.1倍、至少0.2倍、至少1倍、至少2倍、至少5倍、或至少IO倍或以上时，可认为基因表达水平"增加"或"减少"。基因表达通过检测SCLC相关基因探针与来自患者的组织样品的基因转录物之间的杂交(例如在阵列上杂交)来确定。在本发明的上下文中，来自患者的组织样品可以是得自测试受试者，例如已知或怀疑患有SCLC的患者的任何组织。例如，组织可以包含上皮细胞。更具体地，组织可以是来自肺癌的上皮细胞。本发明还提供SCLC参照表达模式，其中包含两个以上的表2-3中所列SCLC相关基因的基因表达水平。或者，SCLC参照表达模式可以包含两个以上的表2中所列SCLC相关基因或表3中所列SCLC相关基因的表达水平。本发明还提供通过使表达一种或多种SCLC相关基因的受试细胞与受试化合物接触，并确定SCLC相关基因的表达水平或活性或其基因产物的活性，来鉴定抑制或增强一种或多种SCLC相关基因，例如表2-3中所列一种或多种SCLC相关基因之表达或活性的物质的方法。受试细胞可以是上皮细胞，例如得自肺癌的上皮细胞。与不存在受试化合物时检出的水平或活性相比，上调SCLC相关基因的表达水平或其基因产物的活性减少，则表明该受试物质是SCLC相关基因的抑制剂，可用于减轻SCLC的症状，例如一种或多种表3中所列SCLC相关基因的表达。或者，与不存在受试化合物时检出的水平或活性相比，下调SCLC相关基因的表达水平或其基因产物的活性增加，则表明该受试物质是SCLC相关基因表达或功能的增强剂，可用于减轻SCLC的症状，例如一种或多种表2中所列SCLC相关基因的过低表达。本发明还提供试剂盒，其含有与一种或多种SCLC核酸或SCLC多肽结合的检测试剂。本发明还提供与一种或多种SCLC核酸结合的核酸阵列。本发明的治疗方法包括治疗或预防受试者中SCLC的方法，所述方法包括给受试者施用反义组合物(即包含一种或多种反义寡核苷酸的组合物)的步骤。在本发明的上下文中，反义组合物降低特定耙基因的表达。例如，反义组合物可以含有与一种或多种SCLC相关基因序列互补的一个或多个核苦酸，所述SCLC相关基因序列选自表3中所列的SCLC相关基因。或者，本发明的方法可以包括给受试者施用小干扰RNA(siRNA)组合物(即包含一种或多种siRNA寡核苷酸的组合物)的步骤。在本发明的上下文中，siRNA组合物降低选自表3中所列SCLC相关基因的一种或多种SCLC核酸的表达，例如降低ZIC5的表达。在另一种方法中，通过给受试者施用核酶组合物(即包含一种或多种核酶的组合物)来治疗或预防受试者中的SCLC。在本发明上下文中，核酸特异性核酶组合物降低选自表3中所列SCLC相关基因的一种或多种SCLC核酸的表达。因此，在本发明的一些实施方案中，一种或多种表3中所列SCLC相关基因是小细胞肺癌的治疗靶标。其它治疗方法包括给受试者施用化合物，所述化合物提高一种或多种表2中所列SCLC相关基因的表达，或者提高由一种或多种表2中所列SCLC相关基因编码之多肽的活性。本发明还包括疫苗和接种(vaccination)方法。例如，治疗或预防受试者中SCLC的方法可包括给受试者施用疫苗组合物，所述疫苗组合物含有由选自表3中所列SCLC相关基因的一种或多种核酸所编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段。在本发明的上下文中，免疫活性片段是长度短于全长天然蛋白、但其诱导的免疫应答与全长蛋白所诱导的免疫应答相类似的多肽。例如，免疫活性片段的长度应为至少8个残基，并能够刺激免疫细胞，如T细胞或B细胞。免疫细胞刺激可通过检测细胞增殖、细胞因子(如IL-2)生成(elaboration)或抗体产生来测定。参见例如HarlowandLane，C/s/"gjZ^60rato77Mawwa/，1998,ColdSpringHarborLaboratoryPress;andColigan,da/"Cw^rew/iVotoco/s/w麵wo/ogy，1991-2006,JohnWiley&Sons。本发明还部分基于下述令人惊奇的发现ZIC5的表达抑制可有效抑制包括SCLC相关癌细胞在内的多种癌细胞的细胞生长。本申请中记载的发明部分基于该发现。本发明提供抑制细胞生长的方法。在这些方法中，有些方法包括使下述组合物与细胞接触的步骤，所述组合物包含抑制ZIC5表达的一种或多种小干扰RNA寡核苷酸(siRNA)。本发明还提供抑制受试者中肺瘤细胞的生长的方法。这些方法包括对受试者施用含一种或多种小干扰RNA(siRNA)的组合物的步骤，所述小干扰RNA与来自ZIC5的序列特异性杂交。本发明的另一个方面提供抑制生物样品细胞中ZIC5基因表达的方法。通过将足以抑制ZIC5基因表达的量的一种或多种双链核糖核酸(RNA)分子导入细胞，可以抑制该基因的表达。本发明的另一个方面涉及包含核酸序列和载体的产品以及包含它们的组合物，它们对于例如本发明提供的方法是有用的。在这些产品中，提供具有被导入表达ZIC5基因的细胞时抑制该基因表达的性质的siRNA分子。在这些分子中还有这样的分子，它们包含有义链和反义链，所述有义链包含对应于ZIC5靶序列的核糖核苷酸序列，其中所述反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列。该分子的有义链和反义链相互杂交，形成双链分子。本发明的特征是抑制细胞生长的方法。通过使ZIC5的小千扰RNA(siRNA)组合物与细胞接触，抑制细胞生长。还可以使细胞与转染增强剂接触。细胞可以以体内、体外或离体形式提供。受试者可以是哺乳动物，包括人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛。细胞是肺上皮细胞。或者，细胞是肿瘤细胞(即癌细胞(cancercell))，例如癌(carcinoma)细胞或腺癌细胞。例如，细胞是小细胞肺癌细胞。"抑制细胞生长"指与未处理细胞相比，受处理的细胞的增殖速度下降或生存力下降。采用本领域公知的增殖测定法来确定细胞生长。本发明还部分基于与抗化疗性肺癌相关的基因表达图式的发现。术语"化学治疗"或"化疗"(chemotherapy)通常指使用特殊化学药物对疾病进行治疗。在本发明中，化学治疗的对象可为癌细胞或癌组织，优选为肺癌细胞或肺癌组织。在本文中，"化疗剂"指通常用于治疗癌症特别是肺癌的药物。用于治疗癌症的化疗剂包括例如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、依4乇泊普(etoposide)、长春#斤石威(vincristine)、J不石粦酰胺(cyclophosphamide)、多柔比星(doxorubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、紫杉醇(paclitaxel)、吉西他滨(gemcitabine)和多西紫杉醇(docetaxel)。更具体地，本发明的化疗剂包含包括顺铂和卡铂在内的铂类抗癌剂。术语"抗化疗性"(chemotherapy-resistant)指癌细胞或癌组织不受典型的选择性破坏恶性细胞或恶性组织的化疗剂的影响。在本文中，抗化疗性肺癌中差异性表达的基因统称为"抗化疗性肺癌核酸"或"抗化疗性肺癌多核苷酸"，对应的由其编码的多肽称为"抗化疗性肺癌多肽"或"抗化疗性肺癌蛋白"。因而，本发明提供通过检测来自患者的生物样品中抗化疗性肺癌相关基因的表达水平，来诊断受试者中的抗化疗性肺癌或确定其发病倾向性的方法。术语"抗化疗性肺癌相关基因"是指其特征在于表达水平在抗化疗性肺癌细胞和化疗敏感性肺癌细胞之间有差别的基因。在本发明的上下文中，抗化疗性肺癌相关基因是表5中所列基因。或者，在本发明中，抗化疗性SCLC相关基因是表6中所列基因。与该基因的对照水平相比，样品中的表达水平增加，表示该受试者患有抗化疗性肺癌或SCLC，或者存在发生抗化疗性肺癌或SCLC的危险。在本发明的上下文中，术语"对照水平"是指在患有化疗敏感性肺癌或SCLC的个体或群体中检出的基因表达水平。与对照水平相比，在受试样品中检出的一种或多种表5中所列化学治疗性肺癌相关基因的表达水平增力口，表明(由其获得样品的)受试者患有抗化疗性肺癌或存在发生抗化疗性肺癌的危险。类似地，与对照水平相比，在受试样品中检出的一种或多种表6中所列抗化疗性SCLC相关基因的表达水平增加，表明该受试者患有抗化疗性SCLC或存在发生抗化疗性SCLC的危险。根据本发明，当抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因的表达水平与正常对照水平相比增加至少约10%、25%、50%时，^见为基因表达水平"增加"。通过检测(例如在阵列上检测)抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因探针与来自患者的组织样品的基因转录物之间的杂交，来确定表达。在本发明的上下文中，来自患者的组织样品是得自受试者，例如已知或怀疑患有抗化疗性肺癌或SCLC的患者的任何组织。本发明还提供抗化疗性肺癌(或SCLC)参照表达模式，其中包含两种以上的表5-6中所列抗化疗性肺癌相关基因的基因表达水平。或者，当抗化疗性肺癌为小细胞肺癌时，抗化疗性肺癌参照表达模式包含两种以上的表6中所列抗化疗性肺癌相关基因的表达水平。本发明还提供通过使表达抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因的受试细胞与受试化合物接触，并测定该基因的表达水平或活性或其基因产物的活性，来鉴定抑制或增强抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因，例如表5-6中所列的抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因之表达或活性的作用物质的方法。受试细胞可以是得自抗化疗性肺癌(或SCLC)的细胞。与不存在受试物质时检出的表达水平或活性相比，上调抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因的表达水平或其基因产物的活性下降，表明该受试物质是抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因的抑制剂，可用于减轻抗化疗性肺癌(或SCLC)的症状，例如一种或多种表5一6中所列抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因的表达。本发明还提供试剂盒，其含有与一种或多种抗化疗性肺癌(或SCLC)核酸或抗化疗性肺癌(或SCLC)多肽结合的检测试剂。本发明还提供与一种或多种抗化疗性肺癌(或SCLC)核酸结合的核酸的阵列。本发明的治疗方法包括治疗或预防受试者中抗化疗性肺癌(或SCLC)的方法，该方法包括给受试者施用包含一种或多种反义寡核苷酸的反义组合物的步骤。在本发明的上下文中，反义组合物降低特异性靶基因的表达。例如，反义组合物可以含有一个或多个与抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因序列互补的核苷酸，所述抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因序列选自表5-6中所列抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因。或者，本发明的方法可以包括给受试者施用包含一种或多种siRNA寡核香酸的小干扰RNA(siRNA)组合物的步骤。在本发明的上下文中，siRNA组合物降低选自表5-6中所列抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因的一种或多种抗化疗性肺癌(或SCLC)核酸的表达。在另一种方法中，受试者中抗化疗性肺癌(或SCLC)的治疗或预防可以通过给受试者施用包含一种或多种核酶的核酶组合物来实施。在本发明上下文中，核酸特异性核酶组合物可降低选自表5-6中所列抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因的一种或多种抗化疗性肺癌(或SCLC)核酸的表达。因此，在本发明中，表5-6中所列的抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因是抗化疗性肺癌的优选治疗靶标。本发明还包括疫苗和接种方法。例如，治疗或预防受试者中抗化疗性肺癌(或SCLC)的方法可包括给受试者施用疫苗，所述疫苗含有由选自表5-6中所列抗化疗性肺癌(或SCLC)相关基因的一种或多种核酸编码的一种或多种多肽或所述多肽的免疫活性片段。在本发明的上下文中，免疫活性片段是长度短于全长天然蛋白、但其诱导的免疫应答与全长蛋白所诱导的免疫应答相类似的多肽。例如，免疫活性片段的长度应为至少8个残基，并能够刺激免疫细胞，如T细胞或B细胞。可通过^r测细胞增殖、细胞因子(如IL-2)生成或抗体产生来测定免疫细胞刺激。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属
技术领域：
中的普通技术人员所常规理解的意思相同。尽管在实施或检验本发明时可使用与本文所述类似或等同的方法和材料，本文下文仍然描述了适当的方法和材料。本文引证并入本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容。如有矛盾，以包括定义的本文为准。另外，本文描述的材料、方法和实施例仅是为了说明而非限制本发明。本文记载的方法的一个优势是可以在检测到小细胞肺癌的明显临床症状之前对疾病进行鉴定。通过以下的详细说明和权利要求书，本发明的其它特点和优势将更加显而易见。图1显示两种代表性SCLC的激光微束显微解剖(LMM)的图像。上图(j、B)显示解剖前的样品；中图(C、Z))，显微解剖后的相同切片(H.E.染色x400)。此外，下图(五、F)显示了捕获在收集帽(collectingcap)上的经显^i:解剖的癌细胞。图2J显示了83种候选基因的半定量RT-PCR，图2fi显示了使用抗两种候选蛋白标志A6636(SCAMP5)和A0245(CDC20)的抗体，针对来自受检的SCLC组织及正常肺组织的代表性样品进行的免疫组织化学染色(x100,x200)。图3使用多组织Northern印迹显示的正常器官中8种候选基因的表达。图4显示了LC319细胞中siRNA针对ZIC5的敲低(knockdown)效应。向LC319细胞中转染siRNA表达载体(si-Z/C5)、荄光素酶siRNA表达载体(si-LUC)和作为阴性对照的乱序(Scramble)siRNA表达载体(si-SCR)。X:以爿C7S的表达为定量对照，通过RT-PCR确^人了对于27C5转录物的敲低效应。5、C:si-Z/C5显示了强敲低效应，但si-LUC和si-SCR对于Z/C5转录物的水平未显示任何效应。与转染了si-LUC或si-SCR的细胞相比，转染si-ZIC5载体造成集落数(B)和活细胞数(C)的减少。图5SCLC及NSCLC(腺癌)的监督聚类分析(supervisedclusteranalysis)。涉及77例肺癌病例来源的样品的基因的二维等级聚类分析(two-dimensionalhierarchicalclusteringanalysis)的杉M犬图。各孑L的《贞色显示红色和绿色，表示转录物水平分别高于和低于该基因在所有样品中的中位值。黑色，表达无变化；灰色，表达不可检出。在表示77例肺癌的横轴上，15例晚期SCLC、35例早期NSCLC(20例ADC和15例SCC),以及27例晚期ADC被分为4个树干(trunk)。在纵轴上，根据相对表达比的相似性，将475种基因聚类于不同树枝(branch)。聚类1包含34种基因，这些基因在SCLC中与在NSCLC中相比更大量地表达。在独立的实验中进行标记和杂交的4个重复例(duplicatedcase)(No.13，20,K91和LC12)被聚类于同一组中最为接近的位置。此外，点样于载玻片上不同位置的同一基因也被聚类于相邻的行中。C:聚类2包含68种基因，它们在接受了化学治疗的晚期SCLC及晚期NSCLC中均表达。发明详述除非另有特定的说明，本文中使用的词语"一个(a)"或"一种(an)"或"该(the)"是指至少一个或至少一种。小细胞肺癌细胞一般以实体(solidmass)的形式存在，其具有高度炎性反应并含有多种细胞组分。因此，先前公开的微阵列数据可能反映不均一的模式(heterogenousprofile)。考虑到这些问题，本发明人通过激光微束显微解剖法(LMM)制备纯化的小细胞肺癌细胞群，并使用展示32256个基因的cDNA微阵列分析了15例SCLC的全基因组基因表达模式。这些数据不仅提供与小细胞肺癌癌发生相关的重要信息，还有助于候选基因的鉴定，这些候选基因的产物可作为诊断标记和/或用于治疗小细胞肺癌患者的分子靶标，并提供临床相关的化息。本发明部分地基于这一发现，即SCLC患者的上皮细胞和癌之间有多种核酸的表达图式发生变化。基因表达的差异使用综合cDNA微阵列系统进行鉴定。使用与激光显微解剖偶联的展示32256个基因的cDNA微阵列分析了来自15例SCLC的癌细胞的基因表达模式。在诊断为SCLC的患者的癌细胞的表达图式，与用激光显微解剖完全选择的正常细胞的表达图式之间进行比较，鉴定出776种在SCLC细胞中普遍下调的基因(示于表2)。类似地，还鉴定出779种在SCLC细胞中普遍上调的基因(示于表3)。此外，对可用于在患者的血清或痰(sputum)中检测癌症相关蛋白的候选分子标记进行了选择，并发现了一些对人SCLC中信号抑制策略的开发有用的靶标。其中，表2和3提供了在SCLC和正常组织之间表达发生改变的基因的列表。本发明所鉴定的差异表达的基因具有作为SCLC的标志和SCLC基因靶标的诊断用途，可改变这些基因的表达以治疗或减轻SCLC的症状。在SCLC患者中表达水平被调变(即增加或减少)的基因列于表2_3，本文中将其统称为"SCLC相关基因"、"SCLC核酸"或"SCLC多核苷酸"；对应的由其编码的多肽称为"SCLC多肽"或"SCLC蛋白，，。除非另外说明，"SCLC，，指本文公开的任何序列(例如表2-3中所列SCLC相关基因)。对于先前已经描述的基因，同时给出其数据库登录号。通过测定细胞样品中各种基因的表达，可以诊断SCLC。类似地，测定这些基因应答于各种作用物质的表达，可以鉴定用于治疗SCLC的作用物质。本发明包括确定(例如测量)至少一种直至全部的表2-3中所列SCLC相关基因的表达。使用由已知序列的GenBankTM数据库登录项提供的序列信息，可使用本领域普通技术人员公知的技术检测和测量SCLC相关基因。例如，可使用对应于SCLC相关基因的序列数据库登录项中的序列构建探针，用于在例如Northern印迹杂交分析中检测对应于SCLC相关基因的RNA序列。探针通常包括参照序列的至少10个、至少20个、至少50个、至少100个或至少200个核苷酸。作为另一个例子，可以使用这些序列构建引物，用于在例如基于扩增的检测方法，如基于逆转录的聚合酶链式反应中特异性扩增SCLC核酸。然后将受试细胞群体，例如来自患者的組织样品中的一种或多种SCLC相关基因的表达水平与参照群体中相同基因的表达水平相比较。参照细胞所述比较参数已知的细胞，即肺癌细胞(例如SCLC细胞)或正常肺细胞。与参照细胞群体相比，受试细胞群体中的基因表达图式是否能表示SCLC或其倾向性取决于参照细胞群体的组成。例如，如果参照细胞群体由正常肺细胞组成，受试细胞群体和参照细胞群体之间基因表达图式的相似性表示受试细胞群体不是SCLC。反之，如果参照细胞群体由SCLC细胞组成，受试细胞群体和参照细胞群体之间的基因表达模式的相似性则表示受试细胞群体含有SCLC细胞。如果受试细胞群体中SCLC标志基因的表达水平与参照细胞群体中相应SCLC标志基因的表达水平相差大于1.1倍、大于1.5倍、大于2.0倍、大于5.0倍、或大于10.0倍或更多，即认为其"发生改变"或"有差别"。受试细胞群体和参照细胞群体之间的差异基因表达可以相对于对照核酸，例如持家基因(housekeepinggene)进行归一化。例如，对照核酸是已知不依赖于细胞的癌性或非癌性状态而发生差异的核酸。可以利用对照核酸的表达水平对受试和参照群体中的信号水平进行归一化。例示性的对照基因包括但不限于例如p-肌动蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白Pl。可以将受试细胞群体与多个参照细胞群体相比较。所述多个参照群体各自的已知参数可以不同。因此，可将受试细胞群体与已知含有例如SCLC细胞的第一参照细胞群体和已知含有例如正常肺细胞的第二参照细胞群体相比较。受试细胞可以包含在来自受试者的组织或细胞样品中，所述组织或细胞样品已知含有或疑似含有SCLC细胞。受试细胞得自身体组织或体液，例如生物流体(如血液或痰)。例如，受试细胞可以纯化自肺组织。优选受试细胞群体包括上皮细胞。上皮细胞优选来自已知或疑似为肺癌的组织。参照细胞群体中的细胞可来自与受试细胞类似的组织类型。任选地，参照细胞群体是细胞系，例如SCLC细胞系(即阳性对照)或正常肺细胞系(即阴性对照)。或者，对照细胞群体可来源于分子信息数据库，所述分子信息来源于^1测参数或状况已知的细胞。受试者优选为哺乳动物。例示性的哺乳动物包括但不限于例如人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛。可使用本领域已知的方法，在蛋白或核酸水平上确定本文公开的基因的表达。例如，可以使用Northern杂交分析确定基因表达，所述Northern杂交分析使用特异性识别这些核酸序列中的一种或多种序列的探针。或者，可以使用例如差异表达基因序列的特异性引物，采用基于逆转录的PCR测定法来确定基因表达。还可以在蛋白水平上确定表达，即通过测定由本文所述基因编码的多肽水平或其生物活性来确定表达。这样的方法是本领域公知的，包括但不限于例如免疫测定法，该方法利用了针对所述基因编码的蛋白的抗体。由这些基因编码的蛋白的生物活性一般是公知的。参见SambrookandRussell,《M9/ecw/orC7om'"g.'^丄o6ora/o^yMawwa/》,3rdEdition:2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel，Cwr耐尸ratoco/sMo/ecw/ar1987-2006，JohnWileyandSons;和HarlowandLane,《t/s7'"gv4w/ZWes:丄a6ora組少Mawi/<3/》，1998,ColdSpringHarborLaboratoryPress。小细胞肺癌的诊断在本发明的上下文中，通过测量来自受试细胞群体(即来自患者的生物样品)中一种或多种SCLC核酸的表达水平来诊断SCLC。优选受试细胞群体含有上皮细胞，例如由肺组织获得的细胞。还可以从血液或其它体液，例如唾液或痰测量基因表达。其它生物样品可用于测量蛋白水平。例如，可采用免疫测定法或其它常规生物学测定法来测量来自待诊断受试者的血液或血清中的蛋白水平。在受试细胞或生物样品中确定一种或多种SCLC相关基因，例如表2-3中所列基因的表达，并将其与受测的一种或多种SCLC相关基因有关的正常对照表达水平进行比较。正常对照水平是通常在已知未患SCLC的人群中典型存在的SCLC相关基因表达^^式。在来自患者的组织样品中，一种或多种SCLC相关基因表达水平的差异(例如增加或减少)表示该受试者患有SCLC或存在发生SCLC的危险。例如，与正常对照水平相比，受试群体中一种或多种表2所列之下调SCLC相关基因的表达减少，表示该受试者患有SCLC或存在发生SCLC的危险。与之相对，与正常对照水平相比，受试群体中一种或多种表3所列之上调的SCLC相关基因的表达增加，表示该受试者患有SCLC或存在发生SCLC的危险。与正常对照水平相比，受试群体中一种或多种SCLC相关基因的改变表示该受试者患有SCLC或存在发生SCLC的危险。例如，一系列SCLC相关基因(表2-3列出的基因)的至少1%、至少5%、至少25%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多的改变，表示该受试者患有SCLC或存在发生SCLC的危险。通过定量分析对应于SCLC相关基因的mRNA或者由这些基因编码的蛋白，可以评估生物样品中SCLC相关基因的表达水平。mRNA的定量分析方法是本领^或技术人员^^知的。例如，可以通过Northern印迹分析或RT-PCR来估计对应于SCLC相关基因的mRNA的水平。由于SCLC相关基因的核苷酸序列是已知的，因此，任何本领域技术人员均能够设计出用于定量分析SCLC相关基因的探针或引物的核苷酸序列。例如，包含表1所列核苷S吏序列的寡核苷酸可以用作SCLC相关基因特异性引物组。此外，可以基于由SCLC相关基因编码的蛋白之活性或量(quantity),来分析这些基因的表达水平。测定SCLC相关基因编码蛋白的量的方法在后面描述。例如，免疫测定方法在确定生物材料中的蛋白方面是十分有效的。只要肺癌患者的样品中表达标志基因(即SCLC相关基因)，可以将任何生物材料用作确定蛋白或其活性的生物样品。例如，来自肺组织的上皮细胞。而体液，包括血液及痰同样可以用于分析。另一方面，为了测定由SCLC相关基因编码的蛋白的活性，可根据待分析的蛋白的活性选择适当的方法。对受试生物样品中的SCLC相关基因的表达水平进行评估，并与正常样品(例如来源于非患病受试者的样品)中的表达水平相比较。如果这样的比较显示所述基因在受试样品中的表达水平比正常样品中的表达水平高(表3所示的SCLC相关基因，即777-1555)或低(表2所示的SCLC相关基因，即1-776),则判定该受试者,i有或易患SCLC。可以同时测定来自正常受试者和待诊断受试者的生物样品中SCLC相关基因的表达水平。或者可以采用统计学方法，基于分析从已知未患SCLC个体的对照组预先采集的样品中基因表达水平所获得的结果，确定出表达水平的正常范围。将通过比较受试者样品获得的结果与正常范围进行比较，当该结果未落入正常范围时，判定受试者患有SCLC或存在发生SCLC的危险。在本发明中，还提供诊断细胞增殖性疾病，包括SCLC的诊断试剂。本发明的诊断试剂包括与SCLC相关基因的多核苷酸或多肽结合的化合物。优选地，与SCLC相关基因的多核苷酸杂交的寡核苷酸，或者与SCLC相关基因编码的多肽结合的抗体，均可用作这样的化合物。本发明的SCLC诊断方法可用于评价受试者中SCLC治疗的有效性。根据本方法，包括受试细胞群体的生物样品得自接受SCLC治疗的受试者。本评价方法可依照诊断SCLC的常规方法进行。必要时，在治疗前、治疗中和/或治疗后的不同时间点由受试者获取生物样品。然后确定受试生物样品中SCLC相关基因的表达水平，并与对照水平，例如来自包含SCLC状态已知的细胞(即癌细胞或肺癌细胞)的参照细胞群体的对照水平相比较。对照水平在未接受所述治疗的生物样品中测定。如果对照水平来自不含癌性细胞的生物样品，那么来自受试者的受试生物样品中的表达水平与对照水平的相似性表示所述的治疗是有效的。而来自受试者的受试生物样品中的SCLC相关基因表达水平与对照水平的差异，表示临床效果或预后较不理想。鉴定抑制或增强SCLC相关基因表达的作用物质使表达一种或多种SCLC相关的上调基因的受试细胞群与受试物质接触，然后确定SCLC相关基因的表达水平或其基因产物的活性，可以鉴定抑制SCLC相关基因的表达或其基因产物的活性的作用物质。与不存在受试物质条件下的表达或活性水平相比，存在受试物质条件下一种或多种种或多种SCLC相关的上调基因的抑制剂并可用于抑制SCLC。或者，使表达一种或多种SCLC相关的基因的受试细胞群与受试物质接触，然后测定SCLC相关的下调基因的表达水平或活性，可以鉴定增强一种或多种SCLC相关的下调基因的表达或其基因产物活性的作用物质。与不存在受试物质条件下的表达或活性水平相比，存在受试物质条件下一种或多种SCLC相关基因的表达水平或其基因产物的活性水平增加，表明该受试物质可增加一种或多种SCLC相关的下调基因的表达或其基因产物的活性。受试细胞群可以由表达SCLC相关基因的任何细胞构成。例如，受试细胞群可包含上皮细胞，如来源于肺组织的细胞。而且，受试细胞还可以是来源于癌细胞的永生化细胞系。或者，受试细胞还可以是用一种或多种SCLC相关基因转染的细胞，或者是用与报道基因可操作相连的来自SCLC相关基因的调控序列(例如启动子序列)转染的细胞。所述作用物质可以是例如抑制性寡核苷酸(例如，反义寡核苷酸、siRNA、核酶)、抗体、多肽、有机小分子。所述作用物质的筛选可以采用高通量方法进4亍，该方法4吏用多孔板(例如％孑L，192孔，384孑L，768孑L,1536孔)同时进行多种物质的筛选。高通量筛选的自动化系统可以从例如CaliperLifeSciences,Hopkinton,MA商购。可以用于筛选的有机小分子文库可以从例如ReactionBiologyCorp.,Malvern,PA;TimTec，Newark,DE商购。评价受试者中SCLC治疗的有效性在本文中鉴定的差异表达的SCLC相关基因，也可以用于监测SCLC的治疗过程。在该方法中，由接受SCLC治疗的受试者提供受试细胞群体。必要时，在治疗前、治疗中和/或治疗后的不同时间点由受试者获取受试细胞群体。然后确定受试细胞群体中一种或多种SCLC相关基因的表达，并与包含SCLC状态已知的细胞的参照细胞群体相比较。在本发明的上下文中，参照细胞群体未接受所述的治疗。如果参照细胞群体不含有SCLC细胞，那么受试细胞群体和参照细胞群体中一种或多种SCLC相关基因表达的相似性表示所述的治疗是有效的。而受试细胞群体和正常对照参照细胞群体中一种或多种SCLC相关基因表达的差异，表示临床后果或预后较不理想。类似地，如果参照细胞群体含有SCLC细胞，那么受试细胞群体和参照细胞群体中一种或多种SCLC相关基因表达之间的差异表示所述的治疗是有效的，而受试细胞群体和小细胞肺癌对照参照细胞群体中一种或多种SCLC相关基因表达的相似性则表示临床后果或预后较不理想。另外，可将在治疗后得到的来源于受试者的生物样品中测定的一种或源于受试者的生物样品中测定的一种或多种SCLC相关基因的表达水平(即治疗前水平)相比较。如果SCLC相关基因是上调基因，那么治疗后样品中表达水平的减少表示所述的治疗是有效的，而治疗后样品中表达水平的增加或维持则表示临床效果或预后较不理想。相反地，如果SCLC相关基因是下调基因，那么治疗后样品中表达水平的增加表示所述的治疗是有效的，而治疗后样品中表达水平的减少或维持则表示临床效果或预后较不理想。在本文中，术语"有效的"表示治疗引起受试者体内病理性上调的基因的表达减少，或病理性下调的基因的表达增加，或肺癌的大小、发病率(prevalence)或转移潜力降低。当预防性施用所述的治疗时，术语"有效的"指治疗延迟或防止小细胞肺癌的形成，或者延迟、防止或减轻SCLC的临床症状。小细胞肺癌的评价可以使用标准的临床规程进行。此外，可以与任何已知的诊断或治疗SCLC的方法相关联来确定有效性。例如，可以通过确定症状性异常(symptomaticanomalies)进行SCLC的诊断，所述症状性异常例如体重减轻、腹痛、背痛、食欲减退、恶心、呕吐和全身不适(generalizedmalaise)、虛弱和黄疽。选择适于具体个体的用于治疗SCLC的治疗剂个体基因组成(geneticmakeup)的差异可导致其代谢多种药物的相对能力的差异。在受试者体内代谢从而起到抗SCLC剂作用的物质，可以通过诱导受试者细胞中癌症状态特征性基因表达图式向非癌症状态特征性基因表达图式的转变而显现自己。因此，本文公开的差异表达的SCLC相关基因，可以用来在来自选定受试者的受试细胞群体中测试SCLC的治疗性或预防性抑制剂，来确定该物质在所述受试者中是否是合适的SCLC抑制剂。为了鉴定出适于具体受试者的SCLC抑制剂，将来自受试者的受试细胞群体暴露于治疗剂，然后确定一种或多种表2-3的SCLC相关基因的表达。在本发明方法的上下文中，受试细胞群体含有表达一种或多种SCLC相关基因的SCLC细胞。优选受试细胞群体包含上皮细胞。例如，可以在存在候选物质的条件下温育受试细胞群体，测量受试细胞群体的基因表达图式(即表达模式)，并与一种或多种参照模式，例如SCLC参照表达模式或非SCLC参照表达模式进行比较。相对于含有SCLC的参照细胞群体，受试细胞群体中一种或多种表3中所列的SCLC相关基因表达减少，或者一种或多种表2中所列的SCLC相关基因表达增加，表示该物质具有治疗用途。在本发明的上下文中，受试物质可以是任何化合物或组合物。例示性的受试物质包括但不限于免疫调节剂(例如抗体)、抑制性寡核苷酸(例如，反义寡核苷酸、抑制性短链寡核苷酸及核酶)和小分子有机化合物。鉴定治疗剂的筛选测定选治疗剂。本发明的方法包括筛选候选治疗剂，以确定该候选治疗剂是否能够将一种或多种SCLC相关基因(包括SCLC1-1555)的SCLC状态特征性表达模式转变为非SCLC状态特征性基因表达图式。在本发明中，SCLC1-1555对于筛选用于治疗或预防SCLC的治疗剂是有用的。在一个实施方案中，将受试细胞暴露于一种或多种受试物质(依次或组合)，并测定这些细胞中一种或多种SCLC1-1555基因的表达。将在受试群体中测得的SCLC相关基因的表达模式与未暴露于受试物质的参照细胞群体中相同SCLC相关基因的表达模式进行比较。能够刺激过低表达基因的表达或抑制过高表达基因的表达的物质具有潜在的临床益处。可以在动物或受试者中进一步测试该物质防止SCLC生长的能力。在另一个实施方案中，本发明提供在SCLC治疗中有用的候选物质的筛选方法。正如上文所详细讨论的，通过控制一种或多种标志基因的表达水平或它们基因产物的活性，可以控制SCLC的发生和发展。因此，采用将所述表达水平和活性作为癌性或非癌性状态指标的筛选方法，可以鉴定出在SCLC治疗中有用的候选物质。在本发明的上下文中，所述筛选可包括例如下述步骤a)使受试化合物与多肽接触，其中所述多肽由选自SCLC1-1555的多核苷酸编码；b)检测多肽与受试化合物之间的结合活性；和c)选择与多肽结合的受试化合物。用于筛选的标志基因编码的一种或多种SCLC多肽可以是重组多肽，也可以是来源于自然界的蛋白，或它们的部分肽。与受试化合物相接触的多肽例如可以是例如纯化的多肽、可溶性蛋白、与载体结合的形态或与其它多肽融合的融合蛋白。可使用本领域技术人员公知的许多方法来筛选与由标志基因编码的一种或多种SCLC多肽结合的蛋白。这样的筛选可通过，例如免疫沉淀法，具体地以下述方式进行。通过将一种或多种标志基因插入外源基因表达载体，如pSV2neo，pcDNAI,pcDNA3.1,pCAGGS和pCD8,使之在宿主(例如动物)细胞等中表达。用于表达的启动子可以是通常使用的任何启动子，并包括，例如SV40早期启动子(RigbyinWilliamson(ed.)，(1982)GeneticEngineering,vol.3,AcademicPress,London,83-141)、EF-a启动子(Kimda/.,Gene91:217-23(1990》、CAG启动子(Niwa"a/.,(1991)Gene108:193-9)、RSVLTR启动子(Cullen,(1987)MethodsinEnzymology152:684-704)、SRa启动子(Takebeda/.，(1988)MolCellBiol8:466-72)、CMV立即早期启动子(CMVimmediateearlypromoter)(SeedandAruffo,(1987)ProcNatlAcadSciUSA84:3365-9)、SV40晚期启动子(GheysenandFiers，(1982)JMolAppIGenet1:385-94)、！^病毒晚期启动子(Adenoviruslatepromoter)(Kaufman"a/.,(1989)MolCellBiol9:946-58)、HSVTK启动子等。可以根据任何方法将基因导入欲表达外源基因的宿主细胞，这些方法例如电穿孔法(Chu"a/.,(1987)NucleicAcidsRes15:1311-26)、磷酸4丐法(ChenandOkayama，(1987)MolCellBiol7:2745-52)、DEAE葡聚糖法(Lopatawa/.,(1984)NucleicAcidsRes12:5707-17;SussmanandMilman,(1984)MolCellBiol4:1641-3)、脂质转染(Lipofectin)法(DerijardB，"a/"(1994)Cell76:1025-37;Lamba/"(1993)NatureGenetics5:22-30:Rabindran"a/.，(1993)Science259:230-4)等。通过将特异性已知的单克隆抗体的识别位点(表位)导入多肽的N末端或C末端，可以以包含单克隆抗体的识别位点的融合蛋白的形式表达由标志基因编码的一种或多种SCLC多肽。也可以使用可商购的表位-抗体系统(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。可以利用其多克隆位点表达与例如P-半乳糖苷酶、麦芽糖-结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)等所成的融合蛋白的载体是可商购的。还报道了通过以不因融合而改变多肽的特性的方式仅引入由几个到十几个氨基酸组成的小表位而制备的融合蛋白。表位，如聚组氨酸(His标签)、流感病毒聚集体(influenzaaggregate)HA、人c-myc、FLAG、水泡性口膜炎病毒糖蛋白(Vesicularstomatitisvirusglycoprotein)(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7才示签)、人单纯疱渗病毒冲唐蛋白(humansimpleherpesvirusglycoprotein)(HSV标签)、E标签(单克隆噬菌体上的表位)等，以及识别它们的单克隆抗体都可以用作表位-抗体系统来筛选结合由标志基因编码的多肽的蛋白(ExperimentalMedicine13:85國卯(1995))。在免疫沉淀中，向用合适的洗涤剂(detergent)制备的细胞裂解物中添加这些抗体，形成免疫复合物。所述免疫复合物由标志基因所编码的SCLC多肽、具有与该多肽结合的能力的多肽和抗体组成。除使用抗上述表位的抗体之外，还可以使用抗标志基因所编码的SCLC多肽的抗体进行免疫沉淀，所述抗体可以如上所述制备。当所述抗体是小鼠IgG抗体时，可以通过例如蛋白ASepharose或蛋白GSepharose沉淀免疫复合物。如果将由标志基因编码的一种或多种SCLC多肽制备成带有表位，如GST的融合蛋白，可使用与这些表位特异性结合的物质，例如谷胱甘肽-Sepharose4B,按照与使用抗多肽的抗体相同的方式形成免疫复合物。免疫沉淀可以才艮据或遵照，例如文献(HarlowandLane,Antibodies,511-52,ColdSpringHarborLaboratorypublications,NewYork(1988》中的方法进行。通常使用SDS-PAGE对免疫沉淀的蛋白进行分析，可以使用合适浓度的凝胶通过蛋白的分子量来分析结合的蛋白。由于采用常规染色法例如考马斯(Coomassie)染色或银染色难以检测与标志基因所编码的SCLC多肽结合的蛋白，可以通过下述方法改进所述蛋白的检测灵敏度在含有放射性同位素"S-曱硫氨酸或"S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，在细胞中标记蛋白，并检测蛋白。在已知蛋白的分子量时，可以从SDS-聚丙烯酰胺凝胶直接纯化目标蛋白并测定其序列。作为使用多肽来篩选与标志基因所编码的SCLC多肽结合的蛋白的方法，可以采用例如West-Western印迹分析(Skolnik"a/,(1991)Cell65:83-90)。具体地说，可以通过下述方法获得能够结合标志基因所编码的SCLC多肽的蛋白使用噬菌体载体(例如ZAP)，由期望表达与标志基因所编码的SCLC多肽结合的蛋白的细胞、组织、器官(例如，组织包括睾丸、卵巢)或者培养的细胞(例如DMS114、DMS273、SBC-3、SBC-5、NCI-H196和NCI-H446)制备cDNA文库；使该蛋白在LB-琼脂糖(LB-agarose)上表达，将表达的蛋白固定在滤膜(filter)上，再使经纯化和标记的多肽与上述滤膜反应，然后根据标记来检测表达与标志基因所编码的多肽结合的噬斑(plaques)。可以利用生物素与抗生物素蛋白之间的结合，或者利用抗体，来对由标志基因编码的一种或多种SCLC多肽进行标记，其中上述抗体与标志基因编码的SCLC多肽特异性结合，或者与融合于标志基因编码的SCLC多肽的肽或多肽(例如GST)特异性结合。也可以采用使用放射性同位素或焚光等的方法。或者，在本发明的筛选方法的另一实施方案中，可以使用利用细胞的双杂交系统(two-hybridsystem)("MATCHMAKER双杂交系统"、"哺乳动物MATCHMAKER双杂交测定试剂盒"、"MATCHMAKER单杂交系统"(Clontech);"HybriZAP双杂交载体系统，，(Stratagene);参照"DaltonandTreisman，(1992)Cell68:597-612"，"FieldsandSternglanz,(1994)TrendsGenet10:286-92")。在双杂交系统中，将本发明的多肽与SRF-结合区或GAL4-结合区融合，并在酵母细胞中表达。由预期表达与本发明多肽结合之蛋白的细胞制备cDNA文库，使得该文库在表达时与VP16或GAL4转录活化区域融合。然后将cDNA文库导入上述酵母细胞，并从检测为阳性的克隆分离出来源于所述文库的cDNA(当在酵母细胞中表达与本发明多肽结合的蛋白时，两者的结合激活报道基因，使得阳性克隆能够被检测到)。将上述分离的cDNA导入大肠杆菌并表达蛋白，可以制备由该cDNA编码的蛋白。就报道基因而言，除HIS3基因外，还可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。采用亲和层析法同样可以筛选可与由标志基因编码的一种或多种SCLC多肽结合的化合物。例如，可以将由标志基因编码的SCLC多肽固定于亲和层析柱的载体上，并将受试化合物施加于该层析柱，所述受试化合物包含能与由标志基因编码的SCLC多肽结合的蛋白。此处的受试化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。在将所述受试化合物上样后，对层析柱进行洗涤，可制备出已与所述多肽结合的化合物。当受试化合物是蛋白时，分析所获蛋白的氨基酸序列，基于该序列合成寡聚DNA,以该寡聚DNA为探针筛选cDNA文库，从而获得编码所述蛋白的DNA。在本发明中，可以将利用表面等离子体共振现象(surfaceplasmonphenomenon)的生物传感器(biosensor)用作对结合的化合物进行检测或定量的手段。当使用这类生物传感器时，而且只使用极少量的多肽且不需标记(例如BIAcore,Pharmacia),可通过表面等离子体共振信号实时》见察本发明多肽和受试化合物之间的相互作用。因此，可以使用生物传感器诸如BIAcore来评价由标志基因编码的一种或多种SCLC多肽和受试化合物之间的结合。当固定化的由标志基因编码的SCLC多肽暴露于合成化合物、天然物质库或随机噬菌体肽展示文库时，筛选与之结合的分子的方法，以及用于分离所述蛋白及结合所述蛋白的化合物(包括激动剂和拮抗剂)的、基于组合化学技术的高通量筛选方法(Wrighton等，Science273:458-64(1996);Verdine,Nature384:11-13(1996);Hogan,Nature384:17-9(1996)),是本领域技术人员公知的。或者，本发明提供使用由标志基因编码的一种或多种多肽筛选用于治疗或预防小细胞肺癌的化合物的方法，该方法包括以下步骤(a)使受试化合物与多肽接触，所述多肽由选自SCLC1-1555的多核苷酸编码；(b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和(c)选择下述化合物(i)与不存在受试化合物的条件下检出的生物活性相比较，该化合物抑制由选自SCLC777-1555的多核芬酸编码的多肽的生物活性，或者(ii)与不存在受试化合物的条件下检出的生物活性相比较，化合物增强由选自SCLC1-776的多核苷酸编码的多肽的生物活性。可以使用标志基因的核苷酸序列，以重组蛋白的形式获得可用于本发明的筛选方法的蛋白。任何具有由标志基因编码的多肽的生物活性的多肽均可用于筛选。基于与标志基因及其编码的蛋白有关的信息，本领域技术人员可以选择蛋白的任何生物活性作为筛选指标，并可以选择任何适当的测量方法来测定选择的生物活性。通过这种筛选分离的化合物是由标志基因编码的多肽的激动剂或拮抗剂的候选物。术语"激动剂"指通过与所述多肽结合而活化其功能的分子。同样地，术语"拮抗剂"指通过与所述多肽结合而抑制其功能的分子。而且，通过这种筛选而分离的化合物将抑制或刺激由标志基因编码的多肽与分子(包括DNA和蛋白)在体内的相互作用。当本发明的方法中片t测的生物活性为细胞增殖时，可以通过如下方法进行检测制备表达由标志基因编码的多肽的细胞，在存在受试化合物的条件下培养所述细胞，确定细胞增殖速度，测量细胞周期等，以及如实施例所述测量集落形成活性。在另一个实施方案中，本发明提供筛选用于治疗或预防SCLC的化合物的方法。如上详细描述，通过控制标志基因的表达水平，可以控制SCLC的发病和进展。因而，通过以标志基因的表达水平为指标进行筛选，可以鉴定能够用于治疗或预防SCLC的化合物。在本发明的上下文中，这样的筛选可包括例如以下步骤(a)使候选化合物与表达一种或多种标志基因的细胞接触，其中所述一种或多种标志基因选自SCLC1-1555;和(b)选择下述候选化合物与不存在候选化合物的条件下检出的表达水平相比，所述化合物抑制选自SCLC777-1555的一种或多种标志基因表达水平、或提高选自SCLC1-776的一种或多种标志基因表达水平。表达标志基因的细胞，包括例如由SCLC建立的细胞系；这样的细胞可以用于本发明的上述筛选(例如DMS114，DMS273,SBC-3，SBC-5,NCI-H196和NCI-H446)。表达水平可以采用本领域技术人员熟知的方法进行评估。在本筛选方法中，降低或增强一种或多种标志基因的表达水平的化合物具有治疗或预防SCLC的用途。或者，本发明的筛选方法可以包括以下步骤a)使候选化合物与导入了载体的细胞接触，其中所述载体含有一种或多种标志基因的转录调控区及在该转录调控区的调控下表达的报道基因，其中所述一种或多种标志基因选自SCLC1-1555;b)测定该报道基因的表达水平或活性；和c)选择下述候选化合物与没有该候选化合物时检测到的表达水平相比，当所述一种或多种标志基因为选自SCLC777-1555的上调标志基因时，所述候选化合物减少报道基因的表达或活性水平，或，所述一种或多种标志基因为选自SCLC1-776的下调标志基因时，所述候选化合物增加报道基因的表达水平。合适的报告基因和宿主细胞是本领域公知的。可以使用标志基因的转录调控区制备筛选所需的报道分子构建体。当本领域技术人员已知标志基因的转录调控区时，可以使用先前的序列信息来制备报道分子构建体。当标志基因的转录调控区仍未鉴定时，可以基于标志基因的核苷酸序列信息从基因组文库中分离含有转录调控区的核苷酸区段。可用于结合蛋白的支持物(support)的实例包括不溶性多糖，包括琼脂糖、纤维素和葡聚糖；及合成树脂，包括聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；优选使用由上述材料制备的可商购的珠子和板(例如多孔板，生物传感器芯片等)。使用珠子时，可以将其填入柱子。蛋白与支持物的结合可根据常规方法进行，这些方法例如化学结合或物理吸附。或者，蛋白可藉由特异性识别它的抗体而与支持物结合。此外，还可以利用抗生物素蛋白和生物素来进行多肽与支持物的结合。蛋白之间的结合在緩冲液中进行，緩沖液例如但不限于磷酸盐緩冲液和Tris緩冲液，只要所述緩冲液不抑制蛋白之间的结合即可。本发明中，利用表面等离子体共振现象的生物传感器可用作检测或定量已结合的蛋白的装置。使用这样的生物传感器(例如BIAcore,Pharmacia)时，仅使用少量的多肽，而且无需标记，即可通过表面等离子体共振信号实时观察蛋白之间的相互作用。或者，可以对标志基因编码的多肽进行标记，结合蛋白的标记可用于检测或测量已结合的蛋白。具体地，对一种蛋白进行预标记之后，在受试化合物存在的条件下使标记的蛋白与其它蛋白接触，然后在洗涤之后根据标记检测或测定已结合的蛋白。本发明的方法中，可以使用标记物质来标记蛋白，所述标记物质如放射性同位素(例如3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、p-葡糖苷酶)、荧光物质(例如，异為H氰酸焚光素(FITC)、罗丹明)和生物素/抗生物素蛋白。当用放射性同位素标记蛋白时，可通过液体闪烁法(liquidscintillation)进行检测或测量。或者，可以通过加入该酶的底物，用吸收光度计(absorptiometer)4企测或测定底物的酶促变化(如产生颜色)，来检测或测量酶标记的蛋白。此外，将荧光物质用作标记的情况中，可利用荧光光度计检测或测量已结合的蛋白。在本发明的筛选中使用抗体的情况下，所述抗体优选利用上述标记物质之一进行标记，并基于标记物质进行;险测或测量。或者，也可以将抗标志基因编码的多肽或抗生物素的抗体用作第一抗体(primaryantibody),使用以标记物质标记的第二抗体对其进行检测。此外，本发明的筛选中与蛋白结合的抗体，可使用蛋白G或蛋白A柱进行检测或测量。在本发明的筛选方法中可以使用任何受试化合物，这些化合物包括但不限于细胞提取物、细胞培养物上清、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗制蛋白、肽、非肽化合物、合成的小分子化合物以及天然化合物。在本发明中，受试化合物还可以使用本领域已知的组合文库法中多种方法中的任何方法获得，所述方法包括(l)生物学文库，(2)空间可寻址平4亍固相或溶液相文库(spatiallyaddressableparallelsolidphaseorsolutionphaselibraries),(3)需要去巻积(deconvolution)的合成文库法，(4)"一珠一化合物(onebeadonecompound)"文库法和(5)使用亲和层析选择的合成文库法。其中，使用亲和层析选择的生物学文库法仅限于肽文库，而其它四种方法适用于肽，非肽寡聚体或化合物小分子文库(Lam(1997)AnticancerDrugDes.12:145)。合成分子文库的方法的举例可见于本
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(DeWittW"/.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6909-13;Erbe/"/.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422-6;ZuckermannWa/.(1994)J.Med.Chem.37:2678-85;Choda/.(1993)Science261:1303-5;Carell"a/.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl,33:2059;Carell"a/.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;Gallop"a/.(1994)J.Med.Chem.37:1233-51)。化合物文库可存在于溶液中(参见Houghten(1992)Bio/Techniques13:412-21),和珠子上(Lam(1991)Nature354:82-4),芯片(Fodor(1993)Nature364:555-6),细菌(美国专利5,223,409)，孢子(美国专利5,571,698;5,403,484和5,223,409)，质粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1865-9)或噬菌体(ScottandSmith(1990)Science249:386-90;Delvin(1990)Science249:404-6;Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378-82;Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-10;美国专利申请2002103360)。通过本发明的筛选方法分离的化合物可用于抑制或刺激由标志基因编码的一种或多种SCLC多肽的活性，来治疗或预防起因于例如细胞增殖性疾病的疾病，例如SCLC。此外，通过本发明的筛选方法获得的化合物，还而得的化合物。用于治疗或预防SCLC的药物组合物本发明提供用于治疗或预防SCLC的组合物，其含有通过本发明的筛选方法选择的任意化合物。当将通过本发明的筛选方法分离的化合物作为药物施用于人或其它哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、绵羊、猪、牛、猴、狒狒和黑猩猩时，分离的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的药物制备方法配制成剂型。例如，根据需要，所述药物可以作为糖衣片剂、胶嚢剂、酏剂和微胶嚢口服施用；或者用水或任何其它药学可接受的液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如，可以在一般接受的药物施用方式所需的单位剂型中将化合物与药学可接受的载体或介质混合在一起，所述载体或介质具体说有无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂(excipient)、溶々某(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。这些制剂中活性成分量使指定范围内的合适剂量能够获得。能够混合到片剂和胶嚢中的添加剂的例子包括但不限于粘合剂如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶(tragacanthgum)和阿拉伯胶，赋形剂例如结晶纤维素，溶胀剂例如玉米淀粉、明胶和海藻酸(alginicacid)，润滑剂例如硬脂酸镁，增甜剂例如蔗糖、乳糖或糖精，和调味剂例如薄荷(peppermint)、Gaw/AeWa^fewoAWx油和櫻桃。当单位剂型为胶嚢剂时，上述成分中还可以包括液体载体，例如油。注射用无菌组合物可以使用溶媒例如注射用蒸馏水，按照标准的药物配制方式进4于配制。生理盐水、葡萄糖以及包含辅料如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠的其它等渗液体，可用作注射用水溶液。这些可以与合适的增溶剂组合使用，所述增溶剂例如醇例如乙醇，多元醇例如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂例如Polysorbate80(TM)和HCO-50。芝麻油或大豆油可以用作油质液体，可以与苯曱酸千酯或苯曱醇组合使用作为增溶剂，还可与緩冲液如磷酸盐緩冲液和乙酸钠緩冲液、镇痛剂如盐酸普鲁卡因、稳定剂如苯曱醇和酚和/或抗氧化剂配制在一起。制备的注射剂可以装入到合适的安瓿(ampoule)中。可以利用本领域技术人员所公知的方法给患者施用本发明的药物组合物，例如作为动脉内、静脉内或经皮注射，或作为鼻内、经支气管、肌内或口服给药施用于患者。施用剂量和方法根据患者的体重和年龄以及施用方法而变化；不过，本领域技术人员能够按常规选择合适的施用方法。如果所述化合物可以由DNA编码，可将该DNA插入到基因治疗载体中，并给患者施用该载体以进行治疗。施用的剂量和方法因患者的体重、年龄和症状而异，但是本领域技术人员能够合适地选择它们。举例来说，当向普通成年人(体重约60kg)口服给药时，虽然根据症状存在一些差异，但与本发明的蛋白结合并调节其活性的化合物的剂量通常为约0.1mg-约100mg每天，优选为约1.0mg-约50mg每天，更优选为约l.Omg-约20mg每天。当以注射剂形式向普通成年人(体重约60kg)非消化道给药时，虽然根据患者、靶器官、症状和给药方法存在一些差异，但方便的做法是静脉内注射约0.01mg-约30mg每天，优选约0.1mg-约20mg每天，更优选约0.1mg-约10mg每天的剂量。而且，在其它动物的情况下，可以按60kg体重的标准常规换算出合适的施用量。评估患小细胞肺癌的受试者的预后本发明还提供评估患有SCLC的受试者的预后的方法，所述方法包括将受试细胞群体中的一种或多种SCLC相关基因的表达与的来自一系列疾病阶段的患者的参照细胞群体中的相同SCLC相关基因的表达相比较的步骤。通过比较受试细胞群体与参照细胞群体中一种或多种SCLC相关基因的基因表达，或随时间比较来源于受试者的受试细胞群体中基因的表达图式，可以评估受试者的预后。例如，与正常对照中的表达相比，一种或多种上调SCLC相关基因，包括表3中所列的那些基因的表达增加，或与正常对照中的表达相比，一种或多种下调的SCLC相关基因，包括表2中所列的那些基因的表达减少，表示预后不佳。相反地，一种或多种表2-3中所列的SCLC相关基因的表达与正常对照中的表达相似，表示受试者预后比较良好。优选地，可以通过比较选自表2和3中所列基因的一种或多种基因的基因表达模式来评估受试者的预后情况。区分SCLC和NSCLC本发明还提供通过比较一种或多种表4所列标志基因的表达水平来区分SCLC和NSCLC的方法。与NSCLC表达水平相比，一种或多种表4所列标志基因的表达水平增加，表示受试者患有SCLC。在本发明的上下文中，短语"NSCLC表达水平"是指在NSCLC患者来源的样品中检出的、一种或多种标志基因或其编码的蛋白的表达水平。在一些实施方式中，NSCLC表达水平作为对照水平。对照水平可以是来自单个参照群体的单个表达沖莫式，或来自多个表达图式的单个表达模式。例如，对照水平可以是以前检测的来自NSCLC对照样品的表达图式的数据库。在本发明中，优选的NSCLC对照样品可以是采用标准诊断方法，例如病理组织学试验鉴定的NSCLC组织或NSCLC细胞。或者，"NSCLC表达水平"是指在来源于NSCLC患者的样品或来源于已知患有NSCLC的个体群的样品中检出的基因表达水平。抗化疗性相关基因的鉴定在本发明中，鉴定了晚期SCLC和晚期NSCLC中上调的基因，并与化疗敏感性肺癌进行了比较。这些抗化疗性肺癌相关基因列于表5(SLC1590-1657)。SLC1590-1657中的一种或多种基因可用作确定包括SCLC和NSCLC在内的抗化疗性肺癌的诊断标志。因此，在一些实施方式中，本发明提供诊断受试者中的抗化疗性肺癌或抗化疗性肺癌发病倾向性的方法，包括确定来源于患者的生物样品中选自表5所列基因的一种或多种抗化疗性肺癌相关基因的表达水平，其中与该基因的对照水平相比，该样品的表达水平增加，表示该受试者患有抗化疗性肺癌或存在发生该抗化疗性肺癌的危险。在本发明中，对照水平可以得自化学治疗敏感性肺癌样品。例如，对照水平可以通过得自化学治疗敏感性肺癌受试者的细胞或组织中的SLC1590-1657的表达才莫式来确定。或者，可使用得自化学治疗敏感性肺癌受试者的细胞或组织作为对照样品。表5所列的抗化疗性肺癌相关基因还可以用作治疗或预防抗化疗性肺癌的治疗靶标。因而，本发明进一步提供治疗或预防抗化疗性肺癌的化合物的筛选方法。或者，本发明还提供治疗或预防受试者中抗化疗性肺癌的方法。在本发明中，本说明书中记载的SCLC相关的筛选方法或治疗方法，还可以适用于抗化疗性肺癌，使用SLC15卯-1657中的一个和多个基因作为耙标基因。例如，本发明的治疗方法包括下述步骤减少其表达在抗化疗性肺癌中异常增加("上调，，或"过高表达"基因)的一种或多种基因的基因产物的表达或活性、或者表达和活性。可以采用本
技术领域：
内公知的若干方法中的任何一种来抑制表达。例如，通过给受试者施用能抑制或拮抗一种或多种过高表达基因之表达的核酸可以抑制表达，所述核酸例如破坏一种或多种过高表达基因之表达的反义寡核香酸或小干扰RNA。此外，本发明中，鉴定了与化疗敏感性SCLC相比在晚期SCLC中上调的基因。这些抗化疗性SCLC相关基因列于表6(SCL1658-1663)。表6所列的基因是在表3所列的上调基因中作为抗化疗性SCLC相关基因选出的。SCLC1658-1663可以用作确定抗化疗性SCLC受试者的"^断标记。因此，在一些实施方式中，本发明提供诊断受试者中的抗化疗性SCLC或抗化疗性SCLC发病倾向性的方法。本方法包括测定来源于患者的生物样品中选自表6所列基因的一种或多种抗化疗性肺癌相关基因的表达水平的步骤，与该基因的对照水平相比，该样品表达水平增加，表示该受试者患有抗化疗性SCLC或存在发生抗化疗性SCLC的危险。在本发明中，对照水平可以得自化疗敏感性SCLC样品。例如，对照水平可以根据从化疗每丈感性SCLC受试者获得的细胞或组织中SLC1658-1663的表达模式来确定。或者，可使用从化学治疗敏感性SCLC受试者获得的细胞或组织作为对照样品。表6所列的抗化疗性肺癌相关基因还可以用作治疗或预防抗化疗性SCLC的治疗靶标。因而，本发明进一步提供治疗或预防抗化疗性SCLC的化合物的筛选方法。或者，本发明还提供治疗或预防受试者中抗化疗性肺癌的方法。在本发明中，本文中记载的SCLC相关的筛选方法或治疗方法还可以适用于抗化疗性SCLC，使用SLC1658-1663作为靶标基因。试剂盒本发明还包括SCLC检测试剂，例如特异性结合或鉴定一种或多种SCLC核酸的核酸，包括与SCLC核酸的一部分互补的寡核苷酸序列，或者与由SCLC核酸编码的一种或多种蛋白结合的抗体。所述检测试剂可以以试剂盒的形式包装在一起。例如，可以将检测试剂包装在不同的容器中，例如核酸或抗体(可与固体基质结合，或与使其同基质结合的试剂分开包装)、对照试剂(阳性和/或阴性)和/或可检测标记。试剂盒内还可以包括实施所述测定的说明(如书面说明书、磁带、VCR、CD-ROM等)。试剂盒的测定样式可以为Northern杂交或夹心ELISA，二者都是本领域已知的。参见例如SambrookandRussell,Mo/ecw/arC7om'wg:jZ^oratojMa咖a/，3rdEdition:2001，ColdSpringHarborLaboratoryPress;andHarlowandLane,^w说ck^s,同上。例如，可以将SCLC检测试剂固定于固体基质如多孔片条(porousstrip)上，以形成至少一个SCLC检测位点。多孔片条的测量区或检测区可以包括多个位点，每个位点都含有核酸。测试片条也可以含有阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可以设置于与测试片条不同的片条上。任选地，不同的检测位点可以含有不同量的固定化核酸，即第一个检测位点量较多，随后的位点量较少。添加受试样品时，显示可检测信号的位点数目提供样品中存在的SCLC的量的定量指标。检测位点的形状可以是任何适宜的可检测的形状，一般为跨越测试片条宽度的条状或点状。或者，试剂盒还含有包含一种或多种核酸的核酸基质(nucleicacidsubstrate)阵列。阵列上的核酸特异性地鉴定由表2-3中所列的SCLC相关基因表示的一种或多种核酸序列。通过与阵列测试片条或芯片的结合水平可以鉴定由表2-3中所列的SCLC相关基因表示的2,3，4,5,6,7,8,9,10,15,20，25，40,50或更多种核酸的表达。基质阵列可以存在于例如固体基质上，所述固体基质如美国专利5，744，305(本文引证并入其全部内容)中描述的"芯片"。本发明中使用的阵列基质可从例如Affymetrix，SantaClara,CA购置。阵列和核酸群(。luralities):本发明还包括含有一种或多种核酸的核酸基质阵列。阵列上的核酸特异性地对应由表2-3中所列的SCLC相关基因所示的一种或多种核酸序列。通过检测与阵列结合的核酸，可鉴定由表2-3中所列的SCLC相关基因表示的2，3，4，5,6，7，8，9，10，15，20，25,40，50或更多种核酸的表达水平。本发明还包括分离的(isolated)多种核酸的群(即两种以上核酸的混合物)。核酸可以存在于液相或固相中，例如固定于如硝酸纤维素膜的固体支持物上。核酸群包含由表2-3中所列的SCLC相关基因表示的一种或多种核酸。在多个实施方案中，核酸群包含由表2-3中所列的SCLC相关基因表示的2，3,4,5，6,7,8,9,10,15，20，25，40，50或更多种核酸。抑制小细胞肺癌的方法本发明还提供通过减少一种或多种表3中所列的SCLC相关基因的表达(或其基因产物的活性)、或者增加一种或多种表2中所列的SCLC相关基因的表达(或其基因产物的活性)来治疗或减轻受试者中的SCLC症状的方法。可以将适当的治疗化合物预防性或治疗性地施用于患有SCLC或处于SCLC发病危险中(或对SCLC易感)的受试者。采用标准的临床方法或者通过检测一种或多种表2-3中所列的SCLC相关基因的异常表达水平或其基因产物的异常活性，可以鉴定出上述受试者。在本发明的上下文中，适当的治疗剂包括，例如细胞周期调控、细胞增殖和蛋白激酶活性的抑制剂。本发明的治疗方法包括增加一种或多种下述基因的表达和/或其基因产物的活性的步骤与获取SCLC细胞的相同组织类型的正常细胞相比，所述基因在SCLC细胞中表达减少("下调"或"过低表达"基因)。在这些方法中，使用有效量的化合物对受试者进行治疗，所述化合物提高受试者中一种或多种过低表达(下调)的基因的量。给药可以是全身给药或局部给药。适宜的治疗化合物包括过低表达基因的多肽产物，其生物活性片段，和编码过低表达基因且具有允许在SCLC细胞中表达的表达调控元件的核酸；例如提高SCLC细胞内源性的此类基因的表达水平(即其上调一种或多种过低表达基因的表达水平)的物质。施用这样的化合物对抗受试者小细胞肺癌细胞中一种或多种异常过低表达基因的影响，并改善受试者的临床状况。或者，本发明的治疗方法可包括如下步骤减少在肺细胞中表达异常增加的基因("上调的"或"过高表达的"基因)的一种或多种基因产物的表达和/或活性。可以按照本领域已知的几种方法中的任何一种来抑制表达。例如，通过给受试者施用抑制或拮抗一种或多种过高表达基因的表达的核酸可以抑制表达，所述核酸例如破坏一种或多种过高表达基因的表达的反义寡核苷酸或小干扰RNA。抑制性核酸如上所述，使用与表3中所列的SCLC相关基因的核苷酸序列互补的抑制性核酸(例如，反义寡核苷酸、siRNA、核酶)，可以减少所述基因的表达水平。例如，对于小细胞肺癌的治疗，与表3中所列的在小细胞肺癌中上调的SCLC相关基因互补的抑制性核酸是有用的。具体地说，本发明的抑制性核酸通过与表3中所列的SCLC相关基因或与之对应的mRNA结合，抑制基因的转录或翻译，促进mRNA降解和/或抑制表3中所列的SCLC相关基因所编码的蛋白的表达，由此抑制蛋白的功能来发挥作用。在本文中，术语"抑制性核酸，，包括与靶序列完全互补的核苷酸和具有一个或多个核苷酸错配的核苷酸，只要该反义核酸能与靶序列特异性杂交。本发明的抑制性核酸包括那些在至少15个连续核苷酸的范围内，具有至少70%,75%,80%，85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更高的同源性的多核香酸。两个或两个以上的核酸序列的同源性可使用本领域已知的算法确定。Altschul等最初发表于(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLAST2.0是一个有用的算法。进行BLAST分析的软件通过美国国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)对公众开放(可以从万维网www.ncbi.nlm.nih.gov获4寻)。该算法首先通过鉴定查询序列(querysequence)中长度为W的短字串(word)来鉴定高得分序列对(highscoringsequencepair,HSP)，在与数据库序列中的等长字串进行比对时，所述短字串与之一致或满足正值阈值得分(positive-valuedthresholdscore)T。T称为邻域字串得分阈值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschuletal.,同前)。以这些最初的邻域字串命中(neighborhoodwordhit)作为种子(seed)来开始检索以寻找包含它们的更长的HSP。接着，沿各序列向两边延长字串命中，只要累积比对得分(cumulativealignmentscore)增加。对于核苷酸序列，可以使用参数M(对于匹配的残基对的奖分，总大于0)和N(对于不匹配的残基对的罚分，总小于0)来计算出累积得分。对于氨基酸序列，可以使用打分矩阵来计算出累积得分。字串向各方向的延长在下述情况下终止累积比对得分由其最大达到值(maximumachievedvalue)下降了量X时，由于一个或多个负分残基比对的累积而使累积得分为0或其以下时，或者到达任何一个序列的终点时。BLAST算法中的参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)作为缺省值使用字串长(W)11、期望值(E)10、截留值(cutoff)100、M=5、N=4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序作为缺省值使用字串长(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)。另一个有用的序列比对算法是PILEUP。PILEUP使用循序逐对比对(progressivepairwisealignment)由一组相关序列制作多序列比对。PILEUP它还可以绘制显示在比对的制作中使用的聚类关系的树图(tree)。PILEUP使用Feng&Doolittle,(1987)J.Mol.Evol.35:351-60的循序比对方法的简易版本。所采用的方法与Higgins&Sharp,(1989)CABIOS5:151-3描述的方法类似。该程序例如，最多可以比对300个最长为5000个字符的序列。多重比对的过程始于通过2个最相似序列的逐对比对来生成2个对比序列的聚类。接着，可以将该聚类与次最相关序歹'J(nextmostrelatedsequence)或比对序列的聚类进行比对。2个序列聚类可以通过2个单独序列的逐对比对的简单延伸进行比对。通过一系列循序逐对比对可以实现最终比对。该程序还用于绘制显示聚类关系得树状图(dendogram)或树图。通过将一定序列及其氨基酸或核苷酸的坐标指定为序列比较区域，可以执行该程序。例如，可以比对本发明的序列或编码核酸，使其提供结构-功能信息，以确定单体域家族中的保守氨基酸，或者比4交家族内的单体域的序列。本发明的反义核酸通过如下方式作用于产生由SCLC相关标志基因编码的蛋白的细胞结合编码该蛋白^DNA或mRNA，抑制它们的转录或翻译，促进mRNA降解，并抑制蛋白的表达，由此导致蛋白功能的抑制。通过与合适的基质混合，可以将本发明的反义核酸制成外用制剂，如搽剂(liniment)或罨剂(poultice),其中所述合适的基质对核酸是无活性的。并且根据需要，通过添加赋形剂、等渗剂(isotonicagents)、增溶剂、稳定剂、防腐剂、镇痛剂等，可以将本发明的反义核酸配制成例如片剂、粉末、颗粒、胶嚢、脂质体胶嚢、注射剂、溶液、滴鼻剂和冻干剂。这些剂型可通过如下的公知方法制备。给患者施用本发明的反义核酸，可以直接将其施于患处，也可以将其输入血管以使其到达患处。使用反义封固介质(antisense-mountingmedium)可以提高持久性和膜通透性。所述反义封固介质的例子包括但不限于脂质体、聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、聘质转染试剂或它们的衍生物。本发明的反义核酸衍生物的剂量，可以根据患者的状况适当调整，并以所需的量使用。例如，可以施用的剂量范围为0.1至100mg/kg，优选O.l至50mg/kg。本发明的反义核酸抑制本发明蛋白的表达，因而可以用于抑制本发明4蛋白的生物活性。此外，含有本发明的反义核酸的表达抑制剂也可以用于抑制本发明的蛋白的生物活性。本发明的方法可以用于改变上调的SCLC相关基因在细胞中的表达，所述基因表达上调的原因例如细胞的恶性转化。在靶细胞中，siRNA与对应于表3中所列SCLC相关基因之一的转录物结合，导致细胞蛋白产生减少。本发明的反义核酸包括经修饰的寡核苷酸。例如，可以使用硫羰酸化(thioated)寡核苷酸赋予寡核苦酸核酸酶抗性。而且，可以使用针对标志基因的siRNA以降低标志基因的表达水平。本文中，术语"siRNA"指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。可以采用将siRNA导入细胞的标准技术，这其中包括以DNA为RNA转录的模板的技术。在本发明的上下文中，siRNA含有有义核酸序列，以及针对上调标志基因，包括表3中所列的SCLC相关基因的反义核酸序列。构建siRNA以使其单一转录物具有来自靶基因的有义序列和互补的反义序列，例如为发夹结构。如表3中所列的SCLC相关基因的siRNA与靶mRNA杂交，并由此通过与通常为单链的mRNA转录物结合，并藉此干扰蛋白的翻译和表达，从而减少或抑制由表3中所列的SCLC相关基因编码的多肽的产生。因此，本发明的siRNA分子可以根据其在严紧条件下与表3中所列的mRNA或cDNA特异性杂交的能力来定义。就本发明而言，术语"杂交"或"特异性杂交，，用来指两种核酸分子在"严紧杂交条件"下杂交的能力。短语"严紧杂交条件，，指如下条件，在该条件下核酸分子，通常在核酸的复杂混合物中，与其靶序列杂交，但不与其它序列发生可检测的杂交。严紧条件依赖于序列，并且在不同情况中是不同的。较长序列在较高温度下特异性杂交。关于核酸杂交的全面指南见于Tijssen，rec/m々wS/o/ogy—外6nWz加.oww油iVwc/efcPraZ)as，"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)。一般;也,选4%的严紧条件为比在限定的离子强度、pH下具体序列的热解链温度(TJ低约定的离子强度、pH和核酸浓度下)的温度(由于靶序列过量，Tm温度下，有50%的探针在平衡状态下被占用)。此外，通过添加去稳定剂，如甲酰胺，也可以实现严紧条件。对选择性或特异性的杂交而言，阳性信号为至少2倍于背景，优选为10倍于背景杂交。示例性的严紧杂交条件可为如下在50%曱酰胺、5xSSC、1%SDS中于42。C保温，或者在5xSSC、1%SDS中于65°C保温，然后用0.2xSSC、0.1%SDS于50。C进行洗涤。在本发明的上下文中，siRNA的长度优选为少于500、200、100、50或25个核苷酸。更优选地，siRNA的长度为约19-约25个核苷酸。为了增强siRNA的抑制活性，可以将一个或多个核苷酸"u"添加到靶序列的反义链的3，端。待添加的"u"的数目为至少2，通常为2-10,优选2-5个。添加的"u，，在siRNA的反义链的3'端形成单链。SCLC相关基因(包括表3所列的那些)的siRNA,可以以能与mRNA转录物结合的形式直接导入细胞。在这些实施方案中，本发明的siRNA分子典型地如上述反义分子相关描述那样进行修饰。而其它的修饰也是可能的，例如胆固醇偶联的siRNA显示了改善的药理学性质。Songetal.NatureMed.9:347-51(2003):或者，编码siRNA的DNA可以携带于载体中。例如，通过将SCLC相关基因靶序列以两条链均能表达的方式(通过DNA分子的转录)克隆到表达载体中来制备上述载体，其中所述表达载体具有位于该耙序列侧翼的、可操作连接的调控序列(Lee,N.S.,"a/.，(2002)NatureBiotechnology20:500-5.)。作为SCLC相关基因mRNA反义链的RNA分子由第一启动子(例如位于所克隆的DNA3'侧的启动子序列)转录，作为SCLC相关基因mRNA的有义链的RNA分子由第二启动子(例如位于所克隆的DNA5，侧的启动子序列)转录。所述有义链和反义链在体内杂交，产生用于沉默SCLC相关基因的siRNA构建体。或者，可以利用两个构建体制备siRNA构建体的有义链和反义链。克隆的SCLC相关基因可编码具有二级结构(例如发夹)的构建体，其中，单一转录物具有来自靶基因的有义序列和互补的反义序列。为了形成发夹环结构，可在有义序列和反义序列之间放置由任意核苷酸序列组成的环序列(loopsequence)。因此，本发明还提供具有通式5'-[A]-[B]-[A，]-3，的siRNA,其中，[A]为核糖核苷酸序列，其对应于与表3所列的mRNA或cDNA特异性杂交的序列。在优选的实施方案中，[A]为对应于选自表3的基因之序列的核糖核苷酸序列，[B]为由约3~约23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，和[A，]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。区域[A]和[A，]杂交，然后形成由区域[B]构成的环。所述环序列的长度优选为3-23个核苦酸。所述环序列，例如，可以选自由如下序列组成的组(在可见于万维网http:〃www.ambion.com/techlib/tb/tb—506.html)。jt匕夕卜，由23个核苷酸组成的环序列也4是供活性siRNA(Jacque,J,M.，&a/.，(2002)Nature418:435-8.)。CCC，CCACC或CCACACC:Jacque，J.M.,ea/"(2002)Nature418:435-8。UUCG:Lee,N.S.，&a/.,(2002)NatureBiotechnology20:500-5.Fruscoloni，P"""/"(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4):1639-44.UUCAAGAGA:Dykxhoorn，D.M.，"a/"(2003)NatureReviewsMolecularCellBiology4:457-67.例如，具有本发明的发夹环结构的优选siRNA如下所示。相应地，在一些实施方式中，环序列[B]可以选自CCC，UUCG,CCACC,CCACACC和UUCAAGAGA。优选的环结构是UUCAAGAGA(DNA中为"ttcaagaga")。对于ZIC5-siRNA:UCAAGCAGGAGCUCAUCUG-[B]-CAGAUGAGCUCCUGCUUGA(耙序列为SEQIDNO:171时)。适当的siRNA的核苷酸序列可4吏用从Ambion网站(http:〃www,ambion.com/techlib/misc/siRNA一finder.html)可4寻到的siRNA"i殳计计算机程序来设计。所述计算机程序基于如下规程选择核苷酸序列用于siRNA合成。选才奪siRNA靶位点1.从目标转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描，寻找AA二核苷酸序列。记录每个AA的出现及其3'侧邻近的19个核苷酸作为潜在的siRNA靶位点。Tuschl等在(1999)GenesDev13(24):3191-7中，不推荐针对5'和3'非翻译区(UTRs)和邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA,因为上述区域可能富含调控蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰与siRNA内切核酸酶复合物的结合。2.将所述潜在靶位点与人基因组数据库进行比较，不考虑与其它编码序列具有显著序列同一性的任何靶序列。可采用BLAST(AltschulSF,etal.,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-402.;(19卯)JMolBiol,215(3):403-10.)进行序列同一性搜索，该程序可见于NCBI服务器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASIY。3.选择合格的靶序列用于合成。使用Ambion算法，可优选沿待评价的基因的长度选择几个把序列。包含靶序列例如SEQIDNO:171的核苷酸的核酸序列的分离的核酸分子、或与SEQIDNO:171的核苷酸的核酸序列互补的核酸分子也包括在本发明中。在本文中，"分离的核酸"是被从其固有环境(例如，当天然存在是为天然环境)中取出的核酸分子，因而是从其天然状态被以人工(synthetically)的方式改变的核酸分子。在本发明中，分离的核酸包括DNA、RNA及它们的衍生物。在本发明中，当分离的核酸为RNA或其书t生物时，应在核苷酸序列中将-威基"t"替换为"u，，。本文中，术语"互补的"指核酸分子的核苷酸单位之间形成Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，而术语"结合"指两种核酸或化合物、或者相关核酸或化合物、或者其组合之间的物理或化学相互作用。互补的核酸序列在适宜条件下杂交，以形成几乎不含或不含错配的稳定双链体。用于本发明的目的时，两个序列的错配不超过5个即认为互补。此外，本发明的分离的核苦酸的有义链和反义链可以通过杂交形成双链核苷酸或发夹环结构。在优选的实施方案中，这样的双链体的平均每IO个配对中出现的错配不超过1个。在特别优选的实施方案中，双链体的链完全互补，即这样的双链不含错配。核酸分子少于4612个核苷酸(对于ZIC5)。例如，核酸分子的长度为少于约500、约200、或约75个核苷酸。本发明还包括包含一种或多种本文中描述的核酸的载体，以及包含该载体的细胞。对于针对ZIC5的siRNA或者编码这些siRNA的DNA而言，本发明的分离的核酸是有用的。将这些核酸用于siRNA或编码该siRNA的DNA时，有义链优选为长于约19个核苦酸，更优选长于约21个核香酸。本发明部分基于下述发现与非癌性肺细胞相比，编码ZIC5的基因在小细胞肺癌(SCLC)中过高表达。ZIC5的cDNA长4612个核苷酸。ZIC5的核酸序列及多肽序列示于SEQIDNO:175和SEQIDNO:176。转染含SEQIDNO:171的siRNA造成SCLC细胞系的生长抑制。Z/C5被鉴定为在SCLC中上调的基因，其是在大部分SCLC中活化的癌-睾丸抗原，在细胞的生长/生存中起核心作用，如northern印迹分析和siRNA实验所证实的。该基因编码663个氨基酸的蛋白，其包含5个C2H2ZNF域。从结构上，该分子为核酸结合型锌离子结合蛋白(nucleicacidbindingZincionbindingprotein)。siRNA组合物的结构.本发明提供通过抑制ZIC5的表达来抑制细胞生长，即癌细胞生长的方法。例如，通过特异性以ZIC5基因为耙标的一种或多种小干扰RNA(siRNA)寡核普酸来抑制ZIC5的表达。ZIC5靶标包括例如SEQIDNO:171的核苦酸。SCLC相关基因序列侧翼的调节序列可以相同也可以不同，使得这些基因地表达应能够独立地，或者以时间性或空间性方式得到调控。通过将SCLC相关基因的模板分别克隆到载体上，在细胞内转录siRNA,其中所述载体含有例如来自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III转录单元或人HIRNA启动子。为了将载体导入细胞，可以使用转染增强剂(transfection-enhancingagent)。FuGENE(Rochediagnostices)，Lipofectamine2000(Invitrogen)，Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofactor(WakopureChemical)可以用作转染增强剂。根据标准方法，在体外检测ZIC5mRNA的多个部分的寡核苷酸或者与这些部分互补的寡核苷酸的降低肿瘤细胞(例如，使用肺癌细胞系例如小细胞肺癌细胞系)中ZIC5产生的能力。使用ZIC5特异性抗体或其它检测策略，检测与不存在候选siRNA组合物的情况下培养的细胞相比，与所述候选siRNA组合物接触的细胞中ZIC5转录物产物的减少。对于在体外基于细胞的测定或无细胞测定中减少ZIC5产生的序列，进一步试验其对细胞生长的抑制作用。对于在体外基于细胞的试验或无细胞试验中抑制细胞生长的序列，在大鼠或小鼠中进行体内试验，以确认ZIC5产生的减少和患有恶性肿瘤的动物中肿瘤细胞生长的减少。恶性肿瘤的治疗方法通过施用ZIC5的siRNA，可以治疗具有以ZIC5过高表达为特征的肿瘤的患者。siRNA治疗用于例如抑制含有小细胞肺癌(SCLC)或存在其发病风险的患者中的ZIC5的表达。采用针对特定肿瘤类型的标准方法可以鉴定这样的患者。采用例如计算机断层摄影术(CT)、磁共振成象(MRI)、内镜逆行胰胆管造影术(ERCP)、磁共振胰胆管造影术(MRCP)或超声波法，可以诊断小细胞肺癌(SCLC)。当治疗导致受试者体内ZIC5表达减少或肿瘤的大小、患病率(prevalence)或转移潜力降低等临床效益时，其是有效的。当预防性施用所述的治疗时，"有效的"意味着治疗延迟或防止肿瘤的形成，或者延迟、防止或减轻肿瘤的临床症状。可以与任何已知的诊断或治疗特定肿瘤类型的方法相结合来判别有效性。参见/^厅"o"/V/wci^/asA/e<iz'c/we，Kasper，ef"/.,eds，2005，McGraw-Hill。siRNA治疗是通过对患者施用一种或多种siRNA寡核苷酸来进行的，施用是利用编码本发明的siRNA的标准载体，和/或通过基因送递系统，例如送递合成siRNA分子。典型地，对合成性siRNA分子进行化学稳定化，以防止在体内被核酸酶降解。化学稳定化RNA分子的制备方法是本
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公知的。典型地，这样的RNA分子包含经修饰的骨架和核苷酸，以防止核糖核酸酶作用。而其它的修饰也是可能的，例如胆固醇偶联的siRNA显示改善的药理学性质(Songetal.(2003)NatureMed.9:347-51)。特别是这其中，适宜的基因送递系统可包括脂质体、受体介导的送递系统或病毒载体包括疱渗病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒等。治疗用核酸组合物可以配制在药学可接受的载体中。治疗组合物还可以包含诸如上述的基因送递系统。药学可接受的载体是适于给动物施用的生物相容性媒介物(vehicles),例如生理盐水。化合物的治疗有效量是可以在受治疗的动物中取得满意的医疗结果的量，例如减少ZIC5基因产物的产生、减少细胞生长例如增殖，或减少肿瘤生长。非消化道给药，包括静脉内、皮下、肌肉内和腹腔内送递途径，可以用于送递ZIC5的siRNA组合物。对于肺肿瘤的治疗，向肺动脉中直接输注是有用的。对于任何一位患者的剂量依赖于多种因素，例如患者的身材(size)、体表面积、年龄、施用的具体核酸、性别、给药时间及给药途径、总体健康情况以及同时施用的其它药物。核酸的静脉内施用剂量为约106~1022拷贝的核酸分子。多核苷酸采用标准方法施用，例如，注射到肌肉、皮肤等组织间隙中、导入循环系统或体腔、或者吸入或吹入。多核苷酸与水性或部分水性的药学可接受的液体载体一起注射到或者其它方式送递到动物体内。多核苷酸可以与脂质体(例如阳离子或阴离子脂质体)结合。多核苷酸包含在靶细胞中表达所必需的基因信息，例如启动子。本发明的抑制性寡核苷酸抑制一种或多种本发明的多肽的表达，因而有用于抑制一种或多种本发明多肽的生物活性。此外，包含本发明的反义寡核苦酸或siRNA的表达抑制剂可以抑制一种或多种本发明的多肽的生物活性，因而是有用的。因此，包含一种或多种本发明的反义寡核苷酸或siRNA的组合物可以用于治疗小细胞肺癌。抗体或者，可以通过施用与基因产物结合或以其它方式抑制基因产物功能的化合物，来抑制在SCLC中过高表达的基因的一种或多种基因产物的功能。例如，所述化合物是与一种或多种过高表达的基因产物结合的抗体。本发明涉及抗体特别是针对由上调的标志基因所编码的蛋白的抗体、或所述抗体的片段的用途。如本文中使用的，术语"抗体"指一种具有特定结构的免疫球蛋白分子，其仅与用于合成该抗体的抗原(即上调标记的基因产物)或与其紧密相关的抗原相互作用(即结合)。此外，抗体可以是抗体片段或修饰的抗体，只要其可以结合一种或多种标志基因编码的蛋白。例如，所述抗体片段可以是Fab、F(ab，)2、Fv、或将来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接而成的单链Fv(scFv)(Hustonaa/.,(1988)ProcNatlAcadSciUSA85:5879-83)。更具体地，可以用酶包括木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体以产生抗体片段。或者，'可以构建编码该抗体片段的基因，将其插入合适的表达载体，并在适合的宿主细胞中表达(参见例如CoM.S."o/.，(1994)JImmunol152:2968-76;BetterM.andHorwitzA.H.(1989)MethodsEnzymol178:476-96;PluckthunA.andSkerraA.(1989)MethodsEnzymol178:497-515;LamoyiE.(1986)MethodsEnzymol121:652-63;Rousseauxda/.，(1986)MethodsEnzymol121:663-9;BirdR.E.andWalker,B.W.(1991)TrendsBiotechnol9:132-7)。抗体可以通过与各种分子如聚乙二醇(PEG)偶联来加以修饰。本发明提供这样的修饰抗体。可通过将抗体进行化学修饰来获得修饰抗体。这些修饰方法是本领域常规的。50人抗体的恒定区之间的嵌合抗体，或者作为含有来源于非人抗体的互补决定区(CDR)、来源于人抗体的框架区(FR)及恒定区的人源化抗体。所述抗体可利用已知技术制备。人源化可通过用啮齿类的CDRs或CDR序列取代人抗体的相应序歹寸的方式进4亍(见例如Verhoeyen"<a/.，(1988)Scz'e"ce239:1534-1536)。因而，这样的人源化抗体是嵌合抗体，其中实质上小于完整人可变域的区域已被来自非人物种的相应序列取代。除人框架区和恒定区外还包含人可变区的完整人抗体也是可以利用的。这样的抗体可利用本领域已知的各种技术制备。例如，体外方法包括使用在噬菌体上展示的人抗体片段的重组文库(例如，Hoogenboom&Winter(1992)J.Mol.Biol.227:381-8)。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠，来制备人抗体。该方法描述于例如美国专利Nos.6,150,584;5，545，807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016。指向癌细胞中发生的特异性分子变化的癌症疗法已经通过下述抗癌药的临床开发和管理机构的批准得到了验证用于治疗晚期小细胞肺癌的曲妥单抗(trastuzumab)(Herceptin)，用于治疗慢性髓性白血病的甲磺酸伊马替尼(imatinibmethylate)(Gleevec)，用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的gefitinib(Iressa)和用于B细胞淋巴瘤和外膜细胞(mantlecdl)淋巴瘤的rituximab(抗CD20mAb)(CiardielloFandTortoraG.(2001)ClinCancerRes.;7(10):2958-70.Review.;SlamonDJ,da/.,(2001)NEnglJMed.;344(11):783-92.;RehwaldU,da/.,(2003)Blood.;101(2):420-4.;FangG，da/.,(2000).Blood，96,2246-53.)。这些药物临床上是有效的，并且比传统抗癌剂具有更好的耐受性，因为它们仅仅靶向转化的细胞。因此，这些药物不仅改善了癌症患者的存活率和生活质量，而且证明了分子靶向癌症疗法理念的合理性。另外，当耙向药物与标准化疗组合使用时，可以增强标准化疗的效力(GianniL.(2002).Oncology,63Suppl1，47-56.;KlejmanA，da/.,(2002).Oncogene,21，5868-76.)。因此，未来的癌症治疗将很可能涉及将常规药物与针对肿瘤细胞不同特性如血管生成(angiogenesis)和浸润性(invasiveness)的靶特异性试剂组合。这些调节方法可以离体OxvzVo)、体外(例如通过在药物的存在下培养细胞)或体内(例如通过给受试者施用药物)进行。所述方法包括作为对抗(counteract)差异表达基因的异常表达或其基因产物的异常活性的疗法，施用蛋白或蛋白的组合、或者核酸分子或核酸分子的组合。可以用拮抗(即降低或抑制)一种或多种过高表达基因之活性的治疗剂来治疗以所述基因和基因产物的表达水平或生物活性(相对于未患有疾病或病症的受试者)分别增加为特征的疾病和病症。可以治疗性或预防性地施用拮抗活性的治疗剂。因此，可以用于本发明上下文中的治疗剂包括例如(i)过高表达或过低表达的一种或多种基因的多肽或其类似物、衍生物、片段或同源物；(ii)抗过高表达基因或基因产物的抗体；(iii)编码过高表达或过低表达的一种或多种基因的核酸；(iv)反义核酸或"功能障碍(dysfimctional)性"核酸(即，由于在一种或多种过高表达基因的核酸内的异源插入所致)；(v)小干扰RNA(siRNA);或(vi)调节剂(即，改变过高表达或过低表达多肽与其结合配偶物(bindingpartner)之间的相互作用的抑制剂、激动剂和拮抗剂)。使用功能障碍性反义分子，通过同源重组来"敲除"多肽的内源性功能(参见例如Capecchi，(1989)Science244:1288-92)。以生物活性下降(相对于未患有疾病或病症的受试者)为特征的疾病和病症，可以使用提高活性(即，对该活性是激动剂)的治疗剂进行治疗。上调活性的治疗剂可以以治疗或预防的方式施用。可用的治疗剂包括但不限于提高生物利用度(bioavailability)的激动剂或多肽(或其类似物、衍生物、片段或同源物)。通过获取患者组织样品(例如从活;险组织)，并在体外4企测其RNA或肽水平、表达的肽(或表达有所改变的基因的mRNA)的结构和/或活性，来定量肽和/或RNA，^v而可以容易地;险测出水平的上升或下降。本领域<^知的方法包括但不限于免疫测定法(例如在Western印迹分析、免疫沉淀后进行十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫细胞化学等)和/或检测mRNA表达的杂交测定(例如Northern测定、点印迹、原位杂交等)。预防性施用在出现疾病的明显临床症状之前进行，以阻止疾病或病症的出现或者延迟其进程。本发明的疗法可以包括使细胞与调节剂接触的步骤，所述调节剂调节一种或多种差异表达基因的基因产物的活性。蛋白活性调节剂的例子包括但不限于核S吏、蛋白、这些蛋白的天然存在的关连配体(naturally-occurringcognateligands)、肽、肽模拟物及其它小分子。例如，合适的试剂可以刺激一种或多种差异性过低表达基因的一种或多种蛋白的活性。针对小细胞肺癌的预防接种(vaccinate)本发明还涉及治疗或预防受试者中的小细胞肺癌的方法，该方法包括如下步骤对所述受试者施用疫苗，其中所述疫苗包含由选自表3中所列的SCLC相关基因(即上调基因)的一种或多种核酸编码的一种或多种多肽、所述多肽的免疫活性片段(即表位)或者编码所述多肽或其片段的多核香酸。施用所述一种或多种多肽在受试者中诱导抗肿瘤免疫。为了诱导抗肺瘤免疫，给有需要的受试者施用由选自表3中所列的SCLC相关基因的一种或多种核酸编码的一种或多种多肽，所述多肽的免疫活性片段或者编码所述多肽或其片段的多核苦酸。多肽或其免疫活性片段可以用作针对SCLC的疫苗。在一些情况下，蛋白或其片段可以以结合于T细胞受体(TCR)或由抗原呈递细胞(APC)，包括巨噬细胞、树突状细胞(DC)或B细胞呈递的形式进行施用。由于DC具有强抗原呈递能力，所以在APC中使用DC是最优选的。免疫学活性片段(即表位)的鉴定是本
技术领域：
公知的。B细胞表位是由邻近氨基酸或通过蛋白质的三维折叠而并置的非邻近氨基酸所形成的。典型地，由邻近氨基酸形成的表位即使暴露在变性溶剂中仍能得以维持，而通过三维折叠形成的(即由立体构象决定的)表位，则典型地会在变性溶剂处理时丧失。典型地，在表位的特有空间立体构象中包含至少3个，更通常为至少5个或810个氨基酸。确定表位的空间构象的方法有例如X射线晶体学及二维核磁共振法。参见例如五p/topeMap//"g尸ratoco/sfwMeAodsz'"ilfo/ecw/ar5z.o/ogy,Vol.66,GlennE.Morris,Ed.(1996)。通过简单的免疫测定(例如竟争结合ELISA或固相ii射免疫测定法(SPRIA))可以鉴定识别相同表位的抗体，其中所述免疫测定显示一种抗体具有阻止另一抗体与靶抗原结合的能力。T细胞对于CD8细胞而言识别约9个氨基酸的连续表位，对于CD4细胞而言识别约1315个氨基酸的连续表位。通过测量抗原依赖性增殖的体外测定可以鉴定识别这些表位的抗原，所述抗原依赖性增殖可以通过受刺激的T细胞应答于表位的3H-胸苷摄取(Burke"a/.,/170,1110-9(1994))、抗原依'赖性杀伤(细胞毒性T淋巴细胞测定，Tiggesda/"///wmmo/.(1996)156:3901-10)或细胞因子的分泌来确定。免疫原'1"生表4立的确定方法见例^口Reineke,efaZ"Cwr7bp_Mfcra&o/im附w"o/(1999)243:23-36;Mahler，da/.,C7z.w/www"o/(2003)107:65-79;AnthonyandLehmann,M"Ws(2003)29:260-9;ParkerandTomer,Mo/脂(2000)146:185-201;DeLisser,MdWsM/脂(1999)96:11-20;VandeWater,da/.,/画歸//画,;a^zo/(1997)85:229-355Carter,Md/zc^M/B/o/(1994)36:207-23;和Pettersson,Mo/历o/i印(1992)16:149-53的描述。在本发明中，针对SCLC的疫苗是指具有接种于动物后诱导抗肿瘤免疫之能力的物质。根据本发明，由表3中所列的SCLC相关基因编码的多肽或其片段被认为是HLA-A24或HLA-A*0201限制性表位肽，它们可诱导针对表达表3中所列的SCLC相关基因的SCLC细胞的强力且特异的免疫反应。因此，本发明还包括使用多肽诱导抗肿瘤免疫的方法。一般而言，抗肿瘤免疫包括诸如以下的免疫应答-诱导抗肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，-诱导识别肿瘤的抗体，和-诱导抗肿瘤细胞因子的产生。因此，当某蛋白接种动物后诱导上述任一种免疫应答时，确定该蛋白具有抗肿瘤免疫诱导效果。由蛋白诱导的抗肿瘤免疫可以通过在体内或体外观察宿主中的免疫系统针对该蛋白的应答来加以检测。例如，检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是公知的。具体地，进胞。以抗原特异性方式应答于APC所呈递抗原的T细胞由于该抗原的刺激而分化为细胞毒性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞；CTL),然后增殖(这称为T细胞活化)。因此，某个肽的CTL诱导可以通过将该肽经由APC呈递于T细胞，然后检测CTL的诱导，来进行评估。此外，APC具有激活CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞，嗜酸粒细胞(eosin叩hil)和NK细胞的功效。由于CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗肿瘤免疫中也是重要的，可使用这些细胞的激活效应作为指标来评价肽的抗肿瘤免疫诱导作用。参见Coligan，CwrewfiVotoco/sTwmwwo/ogy,同前。使用树突状细胞(DC)作为APC评价CTL诱导作用的方法在本领域中是众所周知的。在APC中，DC是具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在该方法中，首先使受试多肽与DC接触，然后使这些DC与T细胞接触。在与DC接触后，如果检测出具有针对目标细胞的细胞毒性作用的T细胞，则表示该受试多肽具有诱导细胞毒性T细胞的活性。CTL的抗肿瘤活性可以例如采用"Cr标记的肿瘤细胞的裂解(lysis)作为指标来进行^r测。或者，采用3&胸苷摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指标来评价肿瘤细胞损伤程度的方法也是众所周知的。除DC外，外周血单核细胞(PBMC)也可用作APC。已报道通过在存在GM-CSF和IL-4的情况下培养PBMC来增强CTL的诱导。相似地，已显示在存在钥孔戚血蓝蛋白(KLH)和IL-7的条件下培养PBMC可诱导CTL。通过这些方法确定为具有CTL诱导活性的受试多肽视为具有DC激活效应和随后的CTL诱导活性的多肽。因此，诱导针对肿瘤细胞的CTL的多肽可用作抗肿瘤的疫苗。此外，通过与所述多肽接触而获得诱导针对肿瘤的CTL的能力的APC也可用作抗肿瘤的疫苗。此外，通过APC呈递多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可用作抗肿瘤的疫苗。利用由APC和CTL产生的抗肺瘤免疫的这些肿瘤治疗方法称为细胞免疫疗法。一般来说，当细胞免疫疗法使用多肽时，已知通过组合多种具有不同结构的多肽并使它们与DC接触可增加CTL诱导的效率。因此，当用蛋白片段刺激DC时，使用多种类型的片段的混合物是有利的。或者，多肽对抗肺瘤免疫的诱导可以通过观察针对肿瘤的抗体产生的诱导来进行确认。例如，当用多肽免疫的实验动物中诱导产生抗该多肽的抗体并且这些抗体抑制肿瘤细胞生长时，所述多肽视为具有诱导抗胂瘤免疫的能力。施用本发明的疫苗诱导抗肿瘤免疫，而该抗肿瘤免疫的诱导为治疗和预防SCLC提供了可能。抗癌治疗或对癌症发病的预防可以包括任何下述步骤，包括癌性细胞生长的抑制，癌症的退缩(involution)以及癌发生的抑制。癌症的治疗或预防还包括患有癌症的个体死亡率和发病率降低、血液中肿瘤标志水平减少、癌症伴发的可^r测症状的緩解等。所述治疗性和预防性效果优选是统计学上显著的。例如，在观察中显著性水平为5%或更低，其进行比较。例如，可将Student'st-检验，Mann-WhitneyU-检验或ANOVA用于统计学分析。上述具有免疫活性的蛋白或编码该蛋白的载体可与佐剂组合。佐剂是指当与具有免疫活性的蛋白共同(或相继)施用时能增强针对该蛋白的免疫应答的化合物。例示性的佐剂包括但不限于霍乱毒素(choleratoxin)、沙门氏菌毒素(salmonellatoxin)、明矾(alum)等。此外，本发明的疫苗可适宜地与药学可接受的载体组合。这样的载体的例子包括但不限于无菌水、生理盐水、磷酸盐緩沖液、培养液等。此外，疫苗可根据需要包含稳定剂，悬浮剂，防腐剂，表面活性剂等。疫苗可全身或局部地进行施用，例如通过真皮内、肌肉内、皮下、经皮、含服或鼻内途径。疫苗施用可以通过单次给药进行，或者通过多次给药来强化(boost)。当使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可以例如通过离体方法治疗或预防肿瘤。更具体地，可以收集接受治疗或预防的受试者的PBMC，佳_细胞与多肽在离体条件下接触，-秀导APC或CTL,然后将该细胞施用于受试者。也可通过将编码多肽的载体在离体条件下导入PBMC中来诱导APC。体外诱导的APC或CTL可以在施用前进行克隆。通过克隆和培养具有高靶细胞破坏活性的细胞，可以更有效地实施细胞免疫治疗。此外，以该方式分离的APC和CTL不仅可以用于针对提供细胞的受试者进行细胞免疫治开发疫苗的一4殳方'法侈'J^口Fiacc/"e/Votoco/s，RobinsonandCranage,Eds"2003,HumanaPress;Marshall,Z/aw^ooA:.-^尸raWc"/Gw油/b/-C7/m'c/am1，2003,LippincottWilliams&Wilkins;andFacc/weDe/fve^y5Vra&g/ey，Dietrich,"<a/.，Eds"2003,SpringerVerlag中的描述。用于抑制SCLC的药物组合物进一步提供含有药学有效量的本发明的多肽的药物组合物，其用于治疗或预防包括例如SCLC等癌症在内的细胞增殖性疾病。该药物组合物可以用于引发抗肿瘤免疫。本发明中，适宜的药物制剂包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括含服或舌下)、阴道或非消化道(包括肌内、皮下和静脉内)施用的制剂，或者适于通过p及入或吹入(insufflation)施用的制剂。优选静脉内施用。制剂可以任选包装在离散的剂量单位(dosageunit)中。适于口服施用的药物制剂包括胶嚢剂、扁嚢剂(cachet)或片剂，它们各含有预定量的活性成分。适合的制剂还包括粉末、颗粒，溶液，悬浮液或乳液。活性成分可以任选以大丸药糖剂(boluselectuary)或糊剂(paste)的形式施用。用于口服给药的片剂和胶嚢剂可含有常规赋形剂，包括粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或湿润剂。片剂可通过压缩或成型来制备，其中任选含有一种或多种配方成分。压缩片剂可通过如下方法制备将活性成分以自由流动的形式(如粉末或颗粒)任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂和/或分散剂混合，在适当的机器中进行压缩。成型片剂可通过如下方法制备在适当的机器中对利用无活性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物进行成型。所述片剂可根据本领域已知的方法进行包衣(coated)。口服液体制备物可以是例如水性或油性的悬浊液、溶液、乳液、糖浆或酏剂的形式，或者也可以作为干燥产物提供，在使用前用水或其它适宜溶媒构建。所述液体制备物可含有常规添加剂，包括悬浮剂，乳化剂，非水性溶媒(可包括食用油)和/或防腐剂。片剂可任选地配制以提供其中活性成分的緩释或控释。片剂的包装中可以包含每月服用的一片药物。适于非消化道施用的制剂包括水性和非水性的无菌注射溶液，其中任选地含有抗氧化剂、緩冲剂、抑菌剂(bacteriostat)和使得制剂与目标受体的血液等张的(isotonic)溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其中含有悬浮剂和/或增稠剂。所述制剂可以在单位剂量或多剂量容器中提供，例如作为密封的安瓿和小瓶；还可以在冷冻-干燥(冻干的)条件下保存，这样仅需要在即将使用前添加无菌液体载体例如盐水、注射用水。或者，可提供所述制剂用于连续输注(continuousinfUsion)。即配即用的注射溶液和悬浮液可由前述的无菌粉末、颗粒及片剂的类型制备。适于直肠给药的制剂包括栓剂(suppository)及标准载体如可可脂或聚乙二醇。适于口内局部给药，例如口腔或舌下给药的制剂包括锭剂(lozenge)和软锭剂(pastille),其中锭剂在调味基质，如蔗糖和阿拉伯胶(acacia)或黄蓍胶中包含活性成分，而软锭剂在基质，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分。鼻内给药时，本发明的化合物可以用作液体喷雾剂、可分散粉末，或以滴鼻剂(drop)的形式。滴剂可用水性或非水性基质配制，该基质中也含有一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂。吸入给药时，可以由吹入器、雾化器、加压包装(pressurizedpack)或其它输送气溶胶喷雾的便利装置方便地送递化合物。加压包装可含有适宜的喷射剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜气体。在加压气溶胶的情况下，可通过提供输送计量量(meteredamount)的阀门来确定剂量单位。或者，通过吸入或吹入给药时，化合物可以是干粉組合物的形式，例如该化合物与适宜粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂型提供，例如作为胶嚢、药筒(cartridge),凝胶(gelatin)或发泡包(blisterpack)，借助吸入器或吹入器，可由上述剂型施用所述粉末。其它的制剂包含可释放治疗剂的可植入装置及粘性贴片(adhesivepatches)。需要时，可以采用适于緩释活性成分的上述制剂。药物组合物中还可以含有其它活性成分，诸如抗微生物剂，免疫抑制剂和/或防腐剂。应当理解除上述具体提及的成分外，本发明的制剂可含有本
技术领域：
对于所述制剂类型常规的其它试剂，例如适于口服给药的制剂可以含有调味剂。优选的单位剂型制剂含有如下述有效量的有效成分或其适宜的部分。对于前述的各种情况，可以以约0.1-约250mg/kg每天的剂量范围口服或通过注射施用所述组合物，例如多肽和有机化合物。成人的剂量范围通常为约5mg-约17.5g/天，优选为约5mg-约10g/天，更优选为约100mg-约3g/天。片剂或其它以分散单元提供的单位剂型可适宜地含有以这样的剂量或者作为多个这样的剂量有效的量，例如含有约5mg-约500mg，更通常为约100mg-约500mg。所用剂量依赖于多种因素，包括受试者的年龄和性别，治疗的确切疾患及其严重程度。此外，施用途径也依赖于病症及其严重程度而变化。然而无论怎样，本领域技术人员都能在考虑上述因素的基础上常规地计算出合适的最佳剂量。下面的实施例中记载了本发明的实施方式，这些实施例并不意图限制权利要求书中记载的本发明的范围。下面的实施例例将对在SCLC细胞中差异表达的基因的鉴定及表征进行说明。实施例材料与方法细月包系本实施例中使用的人SCLC细胞系如下DMS114,DMS273,SBC-3,SBC-5，NCI-H196和NCI-H446。所有的细胞均在添加了10%胎牛血清(FCS)的合适的培养基中进行单层培养，并于37。C,在含5。/。C02的湿润空气的气氛中维持。患者及组织样品晚期SCLC组织样品(IV期)是在知情同意(informedconsent)的情况下由死者材料(post-mortemmaterial)(15个个体)获得的。本研究及全部临床材料的使用均经各自机构伦理委员会认可。全部癌组织均经病理学学者确认为组织学意义上的SCLC。患者生活型(patientprofile)得自医疗记录。病理学阶,殳才艮据UnionInternationaleContreleCancer的分类(TravisWDWa/"WorldHealthOrganizationInternationalHistologicalclassificationoftumours1999)确定。临床阶段才艮据由VeteransAdministrationLungStudyGroup(ZelenM，(1973)CancerChemotherRep3.;4:31-42)引入的分期系统确定。15个病例中的14例接受过化学疗法治疗。全部样品立即冷冻，包埋在TissueTekOCT介质(Sakura，Tokyo,Japan)中，于-80。C保存直到用于微阵列分析。激光微束显微解剖、RNA提取和基于T7的RNA扩增采用激光微束显微解剖从保存的样品中选择性地采集癌细胞(KakiuchiS&a/"HumMolGenet2004;-13(24):3029画43&MolCancerRes.2003;l(7):485-99)。为了检查RNA的品质，将由各病例的残留组织提取的总RNA在变性(degenerative)琼脂糖凝胶上进行电泳，通过核糖体RNA条带的存在确认了其品质。按先前的描述(KakiuchiSWa/.，(2004)HumMolGenet.;13:3029-43&(2003)MolCancerRes.2003;l:485-99)进行了总RNA提取和基于T7的RNA扩增。作为对照探针，采用同样方法扩增了正常人肺的poly(A)RNA(CLONTECH);将2.5吗等份的从各癌性组织和对照扩增出的RNA(aRNA)在Cy5-dCTP和Cy3-dCTP的存在下分别进行逆转录。cDNA孩i阵列在本分析中使用了"全基因组"(genomewide)cDNA微阵列系统，其包含从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的UniGene数据库中选出的32256种cDNA。按先前的描述进行了微阵列制备、杂交、洗涤和信号强度^r测(KikuchiTWa/.，(2003)Oncogene.;22:2192-205，KakiuchiSWa/.，(2004)HumMolGenet;13:3029-43&(2003)MolCancerRes.;1:485-99,OchiKWa/.，(2004)IntJOncol.;24:647-55.)。数据分析对来自32256个点的Cy3和Cy5的信号强度进行定量，并利用ArrayVision软件(ImagingResearch,Inc.,St.Catharines,Ontario,Canada)通过替换背景来分析信号。随后，调整各靶标点(targetspot)的Cy5(肿瘤)和Cy3(对照)的荧光强度以使阵列上52个持家基因的平均Cy5/Cy3比等于1。因为由低信号强度获得的数据的可信度低，因此如前所述(KakiuchiS"a/.,(2003)MolCancerRes.;l:485-99)规定了各载玻片的截留值(cutoffvalue),如果Cy3和Cy5两种染料产生的信号强度均低于截留值，则在进一步的分析中排除该基因。对于其它基因，我们使用各样品的原始数据计算出了Cy5/Cy3比。半定量RT-PCR我们选择了高度上调基因，通过半定量RT-PCR实验考察了^^们的表达水平。使用随机引物(Roche)和SuperscriptII(Invitrogen)将来自各样品的总共3pgaRNA的等分试样逆转录为单链cDNA。对各cDNA混合物进行了稀释，以进行其后的PCR扩增，所述PCR扩增使用为与靶标DNA或(3-肌动蛋白(^CT8)特异性反应而制备的引物组(表1)。使用^CT5的表达作为内部对照。PCR反应中循环数经过了优化，以确保的产物强度(productintensity)在线性扩增阶段内。表l半定量RT-PCR用引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>选择的neo盒一起克隆到该基因特异性序列(来自靶转录物的19个核苷酸的序列，通过短间隔区TTCAAGAGA与该序列的反向互补链相分隔)的上游。用于RNAi的合成寡核苷酸的靶序列如下对照1(萤光素酶(LUC):尸/7o""^荥光素酶基因)，5，-CGTACGCGGAATACTTCGA-3，(SEQIDNO:163);对照2(乱序(SCR):编码5S和16SrRNA的叶绿体小眼虫(Euglenagracilis)基因)，5，隱GCGCGCTTTGTAGGATTCG画3，(SEQIDNO:167);si隱ZIC5，5'-TCAAGCAGGAGCTCATCTG-3'(SEQIDNO:171)。插入序列如下LUC对照CGTACG(SEQIDNO:164)，和CGTACG(SEQIDNO:165);SCR对照TCCCGCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCGC(SEQIDNO:168),和GCGCGC(SEQIDNO:169);ZIC5:GCTTGA(SEQIDNO:172),和AAAATCAAGCAGGAGCTCATCTGTCTCTTGAACAGATGAGCTCCTGCTTGA(SEQIDNO:173)。将LC319细胞接种于10-cm皿(1.5xl(^细胞/皿)，按生产商的说明书使用Lipofectamine2000(Invitrogen)使用包含LUC、SCR和ZIC5的靶序列的psiHlBX载体进行了转染。将细胞在含1mg/ml遗传霉素(Invitrogen)的培养基中进行7天选择，4天后回收细胞，通过RT-PCR分析考察各基因的敲低效果。这些RT-PCR的引物与前述的引物相同。温育7天后，用Giemsa溶液对转染细胞进行染色以评价集落形成，通过3-(4，5-二曱基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)测定确定细胞数。聚类分析及区分SCLC与NSCLC(腺癌)的基因的鉴定我们对于基因和肿瘤均采用了等级聚类(hierarchicalclustering)法。为了获得重现性的聚类用于15例SCLC和一个62例NSCLC(20例早期ADC、15例早期SCC和27例晚期ADC)样品的独立群体的分类，我们从它们中选择了这样的基因在80%的实验中可以为它们获得有效数据，且它们的表达比变化的标准差超过1.7;其中，上述62例NSCLC样品先前已经使用包含我们现有微阵列系统中32256种基因的子集(27648种基因)的cDNA微阵列进行了分析(数据得自KikuchiT，"a/.,(2003)Oncogene22:2192-205.;KakiuchiS,a(2004)HumMolGenet13:3029-43的数据，以及我们关于同一35例早期SCLC群组中的4608种基因表达的未发表数据)。本分析使用由M.Eisen(http:〃rana.lbl.gov/index.htm)编写的、可从互联网获得的软件("Cluster"和"TreeView")(BallCA,etal"NucleicAcidsRes.2005;33(Databaseissue):D580-2，GollubJ,Wa/.，NucleicAcidsRes.2003;31(l):94-6，SherlockG,"a/.，NucleicAcidsRes.2001;29(l):152-5)。在应用聚类算法之前，我们对各点的荧光比进行了对数变换(logtransform),并对各样品的数据进行了中值中心化(median-center)以排除实验偏差。结果使用LMM分离SCLC细胞为了获得SCLC细胞的准确表达模式，我们使用了LMM以避免样品中混入非癌性细胞。图l显示了显微解剖前(A、B)、显微解剖后(C、D)的两个代表性癌症，以及经解剖的癌细胞(E、F)的显微镜图像。SCLC中普遍下调/上调的基因的鉴定我们根据以下标准鉴定了SCLC中普遍下调/上调的基因(1)在超过50%(15个病例中的至少8个)的受检癌症中，我们可以获得其表达数据；并且(2)在至少50%的信息病例中，其在SCLC中的表达比超过5.0或不足0.2。SCLC中普遍下调的总共776种基因列于表2,普遍上调的779种基因列于表3。其中，83种基因通过半定量RT-PCR(图2A)和/或Northern印迹分析(图3)确认了它们肺瘤和正常组织中的表达图式。为了在蛋白水平进一步证实这些数据，我们利用A6636(SCAMP5)或A0245(CDC20)的抗体，使用成对的(paired)肺瘤组织切片和正常组织切片进行了免疫组织化学分析(图2B)。经确认这两种蛋白在SCLC中均大量表达，但在正常的肺中基本上无法检出。Z/C5小干扰RNA对LC319细胞生长的效应我们构建了特异性针对在肺癌中高度表达的ZJC5的序列的siRNA表达载体，并将它们转染到内源性表达高水平Z/C5mRNA的LC319细胞中。当我们使用si-27C5构建体时，通过RT-PCR确认了敲低效果(图4A)。使用LC319的集落形成测定(图4B)和MTT测定(图4C)发现，转染了si-ZIC5的细胞的数量急剧减少。表2SCLC中下调的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>编号LMMIDGenBankID符号基因名41A5937BC028315GABARAPL1GABA(A)受体相关蛋白样142A0417L03840FGFR4成纤维细胞生长因子受体443A0657U37283MFAP5微原纤维关联蛋白544A0765BC004102ALDH3A1醛脱氬酶3家族，成员Al45A0878L13288VIPR1血管活性肠肽受体146A1387BC038588AEBP1AE结合蛋白147A1414画001855COU5A1胶原，XV型，alpha148A1516U24488TNXB生腱蛋白XB49A1815丽002664PLEK普列克底物蛋白(Pleckstrin)50A1951AL833268MEF2CMADS框转录增强因子2,多肽C(肌细胞增强因子2C)51A2049BC062358IG腿免疫球蛋白重链恒定区mu52A2487D10923GPR109BG蛋白偶联受体109B53A2811X00570APOC1载脂蛋白C-I54A2747NM004347CASP5胱天蛋白酶5，凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶55A3250BC066956VIM波形蛋白56A3333AK223210CD79BCD79B抗原(免疫球蛋白相关的beta)57A3360画031850AGTR1血管紧张素n受体，i型58A3154BC012160TNFRSF7肺瘤坏死因子受体超家族，成员759A3429M28696FCGR2BIgG的Fc片段，低亲和力lib,受体(CD32)60A3631丽005908MANBA甘露糖香酶，betaA,溶酶体的61A6250NM—006144GZMA粒酶A(粒酶1,细胞毒T-淋巴细胞相关的丝氨酸酯酶3)62A3829NM002182IL1RAP白细胞介素1受体辅助蛋白63A4440画182643DLC1在肝癌中缺失164A4579L29394HP触珠蛋白65A4234AI079183IFI30干扰素，gamma诱导型蛋白3066A4641J02854MYL9肌球蛋白，轻链多肽9,调节性67A4890Ml6973C8B补体组分8，beta多肽编号LMMIDGenBankID符号基因名68A5154画004120GBP2鸟苷酸结合蛋白2,干扰素诱导型69A5991BX537522FLJ3術7微弱地类似于锌指蛋白19570A0212M77349TGFBI转化生长因子，beta诱导的，68kDa71A0571X64652RBMS1RNA结合模体，单链的相互作用性蛋白172A1032M87790IGLC2免疫球蛋白lambda可变区3-2173A1455M58603NFKB1B细胞中kappa轻链多肽基因增强子的核因子1(pi05)74A2202A廳016RAMP3受体(降钩素)活性修饰蛋白375A2408CR590167CD74CD74抗原(主要组织相容性复合物的不变多肽，n类抗原相关)76A2467AF035752CAV2窖蛋白277A2182CR749540C1R补体组分1,r亚组分78A2418M96789GJA4间隙连接蛋白，alpha4,37kDa(连接蛋白37)79A2530CA310505APOD载脂蛋白D80A2644BC062476ADH1C醇脱氢酶1C(I类)，gamma多肽8A2852X83006LCN2脂笼蛋白2(癌基因24p3)82A3044BC092518IGHG3免疫球蛋白重链恒定区mu83A2802CR592117CASP1胱天蛋白酶l,凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶(白细胞介素1,beta,转化酶)84A2972X72475HRVFab027-VL85A3214XI7042PRG1蛋白聚糖1，分泌颗粒86A3324BC057792CA4碳酸酐酶IV87A3412NM000552VWFVonWillebrand因子88A3875BC025717CCRL2趋化因子(C-C模体)受体样289A4601BCO16758H(XS1造血细胞特异性Lyn底物190A0084BC075838LAMB3层粘连蛋白，beta391A0694M91211AGER高度糖基化终产物特异性受体92A0970BX648382SLASrc样-衔接头(adaptor)93A0593NM002290LAMA4层粘连蛋白，alpha4<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>膜)氨肽酶(氨肽酶N,氨肽酶M,微粒体氨肽酶，CD13,pl50)216A3027M28827CD1CCD1C抗原，c多肽<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>编号LMMIDGenBankID符号基因名242A2822BQ015859CSTA抑半胱氨酸蛋白酶蛋白A(stefinA)243A3073NM—002192INHBA抑制素，betaA(激活素A,激活素ABalpha多肽)244A3338M93056SERP誰l丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，分化体B(卵清蛋白)，成员1245A3127D29642ARHGAP25RhoGTP酶活化蛋白25246A3288BU626950TIMP1金属蛋白酶的组织抑制剂1(红系增能活性(erythroidpotentiatingactivity),胶原酶抑制剂)247A3730AB191261FN1纤连蛋白1248A6251M25460IFNB1干扰素，betal,成纤维细胞249A4111BC033040SLC1A1溶质栽体蛋白家族l(神经元/上皮高亲和力谷氨酸转运蛋白，系统Xag)，成员1250A3738画—002332LRP1低密度脂蛋白相关蛋白1(alpha-2-巨球蛋白受体)251A4202BC053578GSTA1谷胱甘肽S-转移酶Al252A0184NM—000426LAMA2层粘连蛋白，alpha2(分区蛋白，先天性肌萎缩症)253A0611BC037236DUSP6双特异性磷酸酶6254A0931顧001774CD37CD37抗原255A1496NM000104CYP1B1细胞色素P450,家族l,亚家族B,多肽l256A1739J02761SFTPB表面活性剂，肺相关蛋白B257A2534M21119LYZ溶菌酶(肾淀粉样变)258A3079J04599BGN双糖链蛋白聚糖259A3416BC033583CD2CD2抗原(p50),绵羊红细胞受体260A4608NM001814CTSC组织蛋白酶C261A4794AF064493LDB2LIM域结合2262A4830NM004557NOTCH4刻缺蛋白同源物4(果蝇)263A5083AK125193LIPA脂肪酶A,溶酶体酸，胆固醇酯酶(Wolman病)264A56卯AB028952SYNPO突触足蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>编号LMMIDGenBankID符号基因名366A8744NM001233CAV2窖蛋白2367B4206CR594594STK17B丝氨酸/苏氨酸激酶17b(凋亡-诱导的)368A2257NBC052998DDR2网柄菌凝素域受体家族，成员2369A3161NCR597101ZFP36锌指蛋白36，C3H型，同源物(小鼠)370A3496BC028129HK3己糖激酶3(白细胞)371B4130BC059394LYNV-yes-l山口肉瘤(Yamaguchisarcoma)病毒相关的癌基因同源物372B4750NM004665VNN2血管非炎性蛋白2373B5421AA648414MS4A1跨膜4-域，亚家族A，成员1374B5842NAF545852MK2S4蛋白激酶底物MK2S4375B6305H03606NPLN-唾液酸丙酮酸裂合酶(二氢吡啶二羧酸合酶)376B7289NAF146761SLAMF8SLAM家族成员8377A1871N画198235RNASE1核糖核酸酶，RNA酶A家族，1(胰腺的)378A2547NBMO17946S100A10S100钙结合蛋白A10(膜联蛋白II配体，依钙蛋白I,轻链多肽(pll))379A4385NBC03卯31IL1R2白细胞介素1受体，II型380A0560N画000618IGF1胰岛素样生长因子1(促生长因子C)381A3439NBM994174HBB血红蛋白，beta382A7760NBC047390ARID5A富AT的相互作用域5A(MRF1样)383B3893AY549722ITLN1Intelectin1(呋喃型半乳糖结合的)384B4440AB040120SLC39A8溶质栽体蛋白家族39(锌转运蛋白)，成员8385B4597AK125090CDNAFLJ43100fis，克隆CTONG2003100386B7122AA480009DEPDC2含DEP域2387B2559CA426475HBE1血红蛋白，印silon1388B4852NBC010954CX(XIO趋化因子(C-X-C模体)配体10389B5372BM995690YME1L1YME1样1(酿酒酵母(S.cerevisiae))390B5699NM033515ARHGAP18RhoGTP酶活化蛋白18391B6688NM—003042SLC6A1溶质载体蛋白家族6(神经递质转运蛋白，GABA),成员1<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>编号LMMIDGenBankID符号基因名517C8846AL023657SH2D1ASH2域蛋白1A,邓肯病(淋巴组织增生综合征)518C9305AI080640AGR2前梯度(Anteriorgradient)2同源物(非洲爪蛙(Xenopuslaevis))519C9513AA094308MK2S4蛋白激酶底物MK2S4520C1412BX648776MSRB3曱辟L氨酸亚砜还原酶B3521CI603BQ446275HBD血红蛋白，delta522CI660NM001001927MTUS1线粒体胂瘤抑制物1523C4979BC091497HLA-B主要组织相容性复合物，I类，B524C8228AK124641CXCX12趋化因子(C-X-C模体)配体12(基质细胞来源的因子1)525C7997J03565CR2补体组分(3d/EpsteinBarr病毒)受体2526C8052U28977CASP4胱天蛋白酶4，凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶527C8345NM006889CD86CD86抗原(CD28抗原配体2，B7-2抗原)528D0735AA740582被转录的座位529D1185AA451886CYP1B1细胞色素P450,家族l,亚家族B,多肽l530D1274BF435815MRNA;cDNADKFZp56400862(来自克隆DKFZp56400862)531C1019NM024997ATF7IP2活化转录因子7相互作用性蛋白2532C5025AA931221被转录的座位，强烈地类似于XP_531118.1PREDICTED:假设蛋白XP_531118[黑猩猩(Pantroglodytes)]533C7138BM678096TNAC-型凝集素域家族3，成员B534C7879NM000688ALAS1氨基酮戊酸，delta-，合酶l535C0629H16793C8orf4染色体8可读框4536CI604AA044381537C4459NM—012276ILT7白细胞免疫球蛋白样受体，亚家族A(无TM域)，成员4538C5014AI185804FN1纤连蛋白1539C5174AL832259LOC284749假设蛋白LOC284749<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>编号LMMIDGenBankID符号基因名589D8933BX538309MAMDC2含MAM域2590E0289AK098225R-spondin很可能为小鼠顶板特异性spondin的直向同源物591E0644画000610CD44CD44抗原(归巢功能和Indian血型系统)592El622画001753CAV1窖蛋白1，胞膜窖蛋白，22kDa593D3086AK123160MGC24133假设蛋白MGC24133594D3831AW978852被转录的座位595D4744AW504569被转录的座位，中度类似于XP—522527.1PREDICTED:类似于心室中表达的肉碱缺陷相关基因1[黑猩猩(Pantroglodytes)]596D5083BM673802ACE血管紧张素I转化酶(肽基-二肽酶A)1597D8527CR613409CA2碳酸酐酶II598D9397BX360819KJSEC3IQ模体和Sec7域3599D3194AA634405被转录的座位，微弱地类似于NP—908973.1环指蛋白29同种型1;肌肉特异性环指2[人]600D4050C06094LRAP白细胞来源的精氨酸氨肽酶601D4885AI139813类似于多囊蛋白l样3602D4980AA919126MHC2TAMHCII类反式激活蛋白603D7349AI016360FLJ40873假设蛋白FLJ40873604D8515画002345LUM腔蛋白聚糖605D1767BC014357CCND2细胞周期蛋白D2606D6360NM021233DNASE2B脱氧核糖核酸酶IIbeta607D92卯丽022153PP2135染色体10可读框54608E0706AW298180MMP7基质金属蛋白酶7(基质溶解因子(matrilysin)，子宫的)609E0716BG012035NPC2Niemann-Pick病,C2型610D4128NM173060CAST钙蛋白酶抑制蛋白611D4189W93113WNT2无翅型MMTV整合位点家族成员2612D4428BM992880NF1神经纤维瘤蛋白1(神经纤维瘤病，von<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>编号LMMIDGenBankID符号基因名765F6698丽001295CCR1趋化因子(C-C模体)受体1766G2317AL512703767F1371AJ271684CXECSF5C-型凝集素域家族5，成员A768G3132AL713738IL7R白细胞介素7受体769G3911AK097866CDH4钙黏着蛋白4,型1,R-钙黏着蛋白(视网膜的)770G6001H87471KYNU犬尿氨酸酶(L-犬尿氨酸水解酶)771G8416CR626671TFPI组织因子途径抑制剂(脂蛋白相关的凝固抑制剂)772F0889AK022052EPHA6EPH受体A6773G1752AL390176FP6778774G2698CA306377ALOX5AP花生四烯酸5-脂加氧酶-活化蛋白775G3001雨003956CH25H胆固醇25-羟化酶776G8762AA778816CD36CD36抗原(胶原I型受体，血小^反反应蛋白受体)表3SCLC中的上调基因编号LMM1DGenBankID付"T777A0289U46838MCM6MCM6微型染色体维持缺陷的6(MIS5同源物，粟酒裂殖酵母(S.pombe))(酉良酒酵母)778A0692X57548CDH2钙黏着蛋白2,l型，N-钩黏着蛋白(神经元)779A0627NM一003185TAF4TAF4RNA聚合酶II,TATA框结合蛋白(TBP)相关的因子，135kDa780A0777M58583CBLN1小脑肽1前体781A1957U20979CHAF1A染色质装配因子l，亚基A(pl50)782A2361NM一003362UNG尿嗜咬-DNA糖基化酶783A6175AI967994LOC8薩外切核酸酶NEF-sp784A2955BM921123TFF3三叶因子3(肠)785A3526BQ423966RQCD1细胞分化所需的RCD11同源物(粟酒裂殖酵母)编号LMMIDGenBankID符号基因名786A3565L10678PFN2肌动蛋白抑制蛋白2787A3700U87864NEURL神经化的样(果蝇)788A4513Z21488CNTN1接触蛋白1789A4616A则7669FANCG范科尼贫血，互补群G790A4831D83017NEIX1NEL样1(鸡)791A5243AF070541LOC2842444艮设蛋白LOC284244792A5313BM462481KIF1A驱动蛋白家族成员1A793A5821AI671006DKFZP564B167DKFZP564B167蛋白794AO167NM一0017卯CDC25C细胞分裂周期25C795A0238U01828MAP2微管相关蛋白2796A0748M76180DDC多巴脱羧酶(芳族L-氨基酸脱羧酶)797A6111NM—018105THAP1含THAP域，凋亡相关的蛋白1798A0833BC021085SORD山梨糖醇脱氢酶799A1286AF034633GPR39G蛋白偶联受体39800A1589U97188IMP-3IGF-IImRNA-结合蛋白3801A1294BC041382CAPON神经元氧化氮4、酶的C末端PDZ域配体802A2466AJ223728CDC45LCDC45细胞分裂周期45样(酉良酒酵母)803A2755BCO11262PHGDH磷酸甘油酸脱氢酶804A3315BQ876913NPY神经肽Y805A6223AF456477MAPT微管相关蛋白tau806A3477NM—000920PC丙酮酸羧化酶807A3717U93869POLR3F聚合酶(RNA)III(针对DNA的)多肽F,39kDa808A4024AK091336STMN2Stathmin样2809A4873BC017723MAGEA4黑素瘤抗原家族A,4810A5324AI357641CDKN2C细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2C(pl8,抑制CDK4)811A6102R71596被转录的座位812A0547NM—001527HDAC2组蛋白脱乙酰酶2<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>编号LMMIDGenBankID符号基因名917A4383Z97029RNASEH2A核糖核酸酶H2,大亚基918A4417BC025381CUJU簇蛋白样1(视网膜的)919A5207CA422300MAC30假设蛋白MAC30920A5157AF027153EST921A5579R41754KIAA1906KIAA1906蛋白922A5696BC050464MGC16824食管癌相关的蛋白923A0207M73812CCNE1细胞周期蛋白El924A0724NM一001520GTF3C1通用转录因子IIIC,多肽1,alpha220kDa925A1257BC006992RAD51AP1RAD51相关的蛋白1926A1641NM—002968SALL1Sal样1(果蝇)927A簡U腿8ETV4Ets变体基因4(E1A增强子结合蛋白，E1AF)928A6152XM—376018KIAA1644KIAA1644蛋白929A2498L11932S画T2丝氨酸羟甲基转移酶2(线粒体的)930A2448AF010314ENC1外胚层-神经皮质(具有BTB样域)931A2996U11287G腿2B谷氨酸受体，亲离子型，N-甲基D-天冬氨酸2B932A4021D38081EST933A4563J04088TOP2A拓朴异构酶(DNA)IIalpha170kDa934A4849NM—000555DCX双重皮质(doublecortex);无脑回，X连锁(双重皮质激素(doublecortin))935A4946NM—005284GPR6G蛋白偶联受体6936A5400AK122818BTBD11含BTB(POZ)域11937A6073AI290541CDNAFLJ11723fis,克隆HEMBA1005314938A5918BX648117ZNF6锌指蛋白6(CMPX1)939A1787U30872CENPF着丝粒蛋白F,350M00ka(核分裂激素)940A1995Ml4745BCL2B-细胞CLL/'淋巴瘤2941A4259BC073991EN01烯醇化酶1,(alpha)942A4807AJ001515RYR3兰诺定(Ryanodine)受体3943A4814NM—004209SYNGR3突触循环蛋白3<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>编号LMMIDGenBankID符号基因名1120B8902AI280015FLJ25555假设蛋白FLJ255551121B9303AK129960LOC92558假设蛋白LOC925581122B3010BX537920SENP1SUMOl/sentrin特异性蛋白酶11123B3732BC014851LFNG狂热(Lunaticfringe)同源物(果蝇)1124B3942AA191573SYNJ2突触小泡磷酸酶21125B3971AF290612NUSAP1核仁和纺锤体相关的蛋白i1126B4030AK055793C20orfl29染色体20可读框1291127B5434NNM一152329PPIL5肽酰脯氨酰异构酶(亲环蛋白)样51128B5992NM一003045SLC7A1溶质载体蛋白家族7(阳离子氨基酸转运蛋白，y+系统)，成员11129B8059BC011000CDCA5细胞分裂周期相关51130B8234AF070632克隆24405mRNA序列1131B9542AA001410DKFZP434I2117具有序列类似性的家族57，成员B1132B9855F10439EST1133A0907NNM—016083CNR1大麻素受体1(脑的)1134A2515XI6396MTHFD2亚曱基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2,次曱基四氫叶酸环化水解酶1135A6857NBC015152MGC33584假设蛋白MGC335841136B3950AK023245FLJ21144假设蛋白FLJ211441137B3876BG354581CDCA8细胞分裂周期相关81138B4587AB096683MGC57827类似于RIKENcDNA2700049P18基因1139B5013T90472TBC1D7TBC1域家族，成员71140B5281BC050525USP1遍在蛋白特异性蛋白酶l1141B6647XM一350880PPM1H蛋白质磷酸酶1H(含PP2C域)1142B6柳AW968496PAX5成对框基因5(B-细胞谱系特异性活化物)1143B7367CR616479AMACRAlpha-曱基酰基-CoA消旋酶1144B7889NAB051529DISP2Dispatched同源物2(果蝇)1145A4045NBE538546PMCH原-黑色素-浓缩'激素(pro-melanin-concentrating<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>与NSCLC相比在SCLC中差异表达的上调基因的鉴定为了鉴定表征SCLC的性质并将其与NSCLC的区别开来的基因，我们比较了15例晚期SCLC病例与先前使用相同cDNA微阵列系统获得的35例早期NSCLC(ADC和SCC)和27例晚期NSCLC(ADC)(P期；IIIB或IV)(KakiuchiSetal.,HumMolGenet.2004;13(24):3029-43，KikuchiTetal.,Oncogene2003;22:2192-2205)的表达模式(图5A)。由于对所述62个NSCLC样品已经就我们现有微阵列系统上32256种基因中一个亚群(27648种基因)进行了分析，因此，我们分析了该27648种基因的一个亚群，该亚群在超过80。/。的受^r病例中可获得有效值。并且，我们排除了观察到的标准差小于1.7的基因。对通过了该截留滤器(cut-offfilter)的475种基因进行了进一步分析。在图5A的样品轴(横轴)上，将来自77个病例的81个样品(为了证实我们的实验方法的重现性和可信性，其中的4个病例进行了重复试验)基于它们的表达模式聚类为两大组。图5上部所示的树状图显示了各个病例之间表达图式上的相似性。树枝越短相似性越大。在独立实^r中^^皮标记和杂交的四个重复的病例(No.13，20,K91和LC12)聚类于同一组中最接近的位置(图5B)。点样于载玻片上不同位置的相同基因也被聚类于邻近的列中(图5B)。这些结果支持我们的实验方法具有高重现性和可信性。在77例病例中，15例SCLC被聚类于一个大组中，20例早期ADC、15例SCC和27例晚期ADC被聚类于单独的组中。这清楚地表明，SCLC与NSCLC显示出具有不同的基因表达模式，这些表达模式反映了它们在病因学和临床病理学性质上的差异。在本分析中，我们获得了在SCLC中大量表达的34种基因，它们中的一些基因揭示了的特定神经元功能(例如神经发生和神经保护)的特征(图5A，5B中的聚类-1;表4;即D尸KSZ2,^CW尸等)。表4与NSCLC相比在SCLC中上调的基因编号LMMIDGenBankID符号基因名1556AI341170P10-结合蛋白1557AA788924C5补体组分51558AL365454愿W胰岛素受体1559AK054999CDNAFLJ30437fis，克隆BRACE20090451560A簡242转录因子CP2样11561雨—172164崩S尸核自身抗原性精子蛋白(组蛋白结合)1562NM—001609酰基-辅酶A脱氬酶，短的/支链1563NM一O15458MTM砂Myotubularin相关蛋白91564AA058578尸丄刀柳5CDNAFLJ34585fis，克隆KIDNE20087581565AA921341溶血磷脂酰甘油酰基转移酶11566CA503163活性依赖性神经保护蛋白1567BC042688W咖RAS,地塞米+>-诱导的11568AK096960RAD1同源物(粟酒裂殖酵母)1569AL832815跨膜蛋白30A1570CR596214异源核核糖核蛋白AO1571BQ016211假设蛋白FLJ101541572BX647115二氢嘧啶酶样21573AL137572染色体1可读框241574NM—133265赢orAngiomotin1575AA602499糖皮质激素诱导转录物11576U337497777^/甲状腺转录因子11577BQ002875/^柳聚(ADP-核糖)聚合酶家族，成员81578AK124953类似于假设蛋白FLJ361441579NM—033632F-框和WD-40域蛋白7(群岛(archipelago)同源物，果蝇)1580AK096344假设蛋白FLJ35220<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>抗化疗性相关基因的鉴定对癌症治疗而言，抗化疗性是一个主要阻碍，而在从特定化学治疗失败的患者获得的癌细胞中鉴定普遍上调的基因，则是理解抗化疗性的机理、建立克服该问题的癌症新疗法有效途径之一。我们获得了68种基因，它们在从抗化疗性肺癌患者获得的晚期SCLC和晚期ADC中均大量表达(图5A、C的聚类2，表5)"抗化疗性肺癌患者，，指接受过一次或多次化疗治疗(尽管对这些患者所提供化学治疗方案不同)的、存活或死亡的肺癌患者。它们中某些是公知的转录因子和/或基因表达调控因子，包括7^F兄、r尸CP2丄4、户//尸20、丄7\^04、rCF20、iF^2禾口Z)XFZp547/04S。而且，表中还示出了一些编码核香酸结合蛋白的基因，包括C9or/76,￡/ffi>3和G/M4尸4。进一步，我们鉴定了作为抗化疗性肺癌的治疗靶标的候选基因，与化疗敏感性肺癌相比，这些候选基因在晚期SCLC中特异性上调(表6)。上述抗化疗性肺癌相关基因是选择如下基因而获得的确定晚期SCLC和晚期NSCLC(表5)或晚期SCLC(表6)中的基因表达水平，并选择其表达水平与化疗敏感性肺癌中的对照表达水平相比有所增加的基因。对照表达水平可以参照已知的化学治疗敏感性肺癌表达模式而获得，也可以用从化疗敏感性肺癌患者制备的对照样品作为模板同时确定。<table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage135</table讨论肺癌是世界范围内最为常见的癌症。对于所有SCLC患者而言，化学治疗仍然是治疗的核心要件，不论疾病阶段(LD或ED)或表现状态如何。对于LD，与单独的化学治疗相比，配合放射线治疗可以改善生存率。通常，SCLC最初对化学治疗和放射治疗是敏感的，但这种响应却很少能够持续。令人失望的是，大部分SCLC患者均复发高度抗治疗性病情，患者最终结果4艮差，其5年生存率不足10%。因此，亟需开发纟全测原发癌症和/或复发的早期阶段的新诊断工具、包含基于小分子和抗体的方案的分子靶标化学疗法和以癌特异性抗原为靶标的新免疫疗法。因而，SCLC基因表达模式是甄别药物耙标的第一步。为了分析SCLC的基因表达模式，我们使用了包含32256种cDNA的全基因组cDNA微阵列。激光^f效束显微解剖技术的出现大大改善了由间隙组织分离癌细胞的能力。据估计，采用本方法时，周围非癌性细胞的混入率不到0.3%(YanagawaR"a/"(2001)Neoplasia.;3:395-401,Kakiuchia/"(2004)HumMolGenet.;13:3029-43&(2003)MolCancerRes.;1:485-99)，这与该数据表示高纯度SCLC细胞群体的表达模式的结论相一致。我们构建了关于在SCLC中差异表达的基因群的详细全基因组数据库。至今为止，我们鉴定了在癌症中特异性上调的779种候选基因作为肿瘤标志或治疗靶标(参照表3)。这些上调基因显示了各种功能，包括神经内分泌功能相关基因或癌-睾丸抗原或编码肿瘤胎儿抗原的基因，以及细胞生长、增殖、生存和转化的重要基因。这些基因编码具有各种功能的蛋白，包括跨膜型/分泌型蛋白、癌-睾丸抗原或编码肿瘤胎儿抗原，以及细胞粘着、细胞骨架结构、信号转导和细胞增殖的重要蛋白。它们中某些可以用作诊断/预后标志，以及用作治疗肺癌的新分子靶向药物或免疫疗法之开发的治疗靶标。肿瘤特异性的跨膜型/分泌型蛋白展示在细胞表面，这使得它们作为分子标记和治疗靶标容易接近，因此是非常有利的。现在可以获得的一些肿瘤特异性标记，包括CYFRA或Pro-GRP,是跨膜型/分泌型蛋白(MiyakeY,"a/"(1994)CancerRes.;54:2136-斗0.;PujolJL，"a/"(1993)CancerRes.;53:61-6.)。rituximab(Rituxan)——种针对CD20阳性淋巴肿瘤的嵌合单克隆抗体一的例子证实了下述理念以特定细胞表面蛋白为靶标可以使我们获得巨大的临床利益(HennessyBT，"a/.，(2004)LancetOncol.;5:341-53.)。另一方面，在目前鉴定的肿瘤抗原中，癌-睾丸抗原(CTA)是一群非常引人注意的癌疫苗靶标。虽然其它因素，例如蛋白在体内的免疫原性也是重要的，并且还需要进一步实验，但我们的候选基因中实际上包含TSGA14等公知的CTA。使用该表达模式进行进一步的研究，一定可以鉴定出新的CTA，作为SCLC的免疫治疗的良好靶标。这些靶标可以用作诊断/预后标志，及作为治疗肺癌的新分子靶向药物或开发免疫疗法的治疗靶标。在上调基因中，我们选择了83种基因用半定量RT-PCR加以证实，并确认了它们的癌症特异性表达(图2A)。我们还发现正如northern印迹分析和siRNA实验所证实的那样，鉴定为上调基因的Z/C5(编码SEQIDNO:176的SEQIDNO:175)是在绝大部分SCLC中活化的癌-睾丸抗原，其在细胞的生长/生存中发挥核心作用。该基因编码具有5个C2H2ZNF域的663个氨基酸的蛋白。在结构上，该分子是核酸结合型锌离子结合蛋白。在目前已鉴定的肿瘤抗原中，对癌疫苗而言，癌-睾丸抗原是一群非常引人注意的癌疫苗靶标。虽然其它因素，例如该蛋白在体内的免疫原性也是重要的，并且还需要进一步实验，但ZIC5是适合免疫疗法的良好靶标，同时也是适合新抗癌药开发的良好靶标。为了改善临床晚期或末期癌症患者的治疗，抗化疗性是我们需要克服的临床上非常重要的问题。我们认为，我们从15例尸检样本和经化疗的晚期ADC获得的基因表达模式(图5A,5C的聚类2;表5),反映了具有获得性化学治疗抗性的晚期肺癌的特征。通过这些亚群的无监督聚类分析(unsupervisedclusteranalysis)鉴定'了上调基因，其中包括公知具有转录因子活性的7MF5丄、7FC尸2W、尸//尸20、丄M04、rCF20和^FZ2。据才艮道，一些转录因子与获得性抗化疗性有关。例如，与多种细胞过程相关的转录因子NF-kappaB的组成性活化，似乎可支持癌细胞的生存，并減少对于化学治疗药物的敏感性(ArltA&SchaferH.(2002)IntJClinPharmacolTher.;40:336-47.)。另一方面，本列表中的一些基因包含C9or/76,五/7D3和G/M4/M，这三者已被发现与核苷酸结合。已知一些DNA结合蛋白在DNA修复过程中担负着重要任务，因此上面所示的基因还在DNA修复中具有某些功能，有可能增强抗化疗性。该组中的基因的进一步分析对于针对抗化疗性肿瘤的新疗法的开发是重要的。'肺的神经内分泌肿瘤包括从高度分化(典型的类癌)到中度分化(非典型癌)的神经内分泌肿瘤，或高浸润性的低分化病灶(大细胞神经内分泌癌(LCNECO)及SCLC)。一般认为，SCLC是肺的主要神经内分泌肿瘤，其引起一些富)J月中瘤性神经内分泌综合征(paraneoplasticneuroendocrinesyndromes)。这些综合征在SCLC患者中表现出不同的临床症状。上调的基因中包括一些与神经内分泌功能有关的基因，例如胰岛素瘤相关基因1(insulinoma-associated1/A/5M7)，嗜铬粒蛋白A(曱状旁腺分泌蛋白1;和achaete-scute复合物样1(果蝇；ASC"),这些进一步支持了SCLC与神经内分泌综合征在分子水平密切相关的观点。我们的基因列表中还包含了一些与恶病质等癌症相关综合征有关的基因。总的来说，我们的与LMM系统组合的cDNA微阵列分析，阐明了上调基因所涉及的SCLC的最全面的基因表达模式，这些上调基因编码具有细胞周期/生长及信号转导功能的蛋白、或具有未知功能的产物、以及跨膜型/分泌型蛋白及CTA。进一步使用动物模型分析，将缩小可能的肺癌治疗靶标和诊断靶标的范围。人癌症和正常器官组织的综合基因表达数据库与siRNA的联合使用，不仅用于27C5等候选基因的选择，还为个人化治疗的靶分子的迅速鉴定和进一步评估提供了强有力的策略。工业实用性本文中描述的小细胞肺癌的基因表达分析是通过激光捕获解剖(laser-capturedissection)和全基因组cDNA微阵列的组合获得的，利用该基因表达分析鉴定了特定基因作为治疗和预防癌症的靶标。基于这些差异表达基因中的一个亚群的表达，本发明提供用于鉴定和检测小细胞肺癌的分子诊断标志。本文中所述的方法还用于鉴定其它用来预防、诊断和治疗小细胞肺癌的分子靶标。本发明中报导的数据增加了对小细胞肺癌的全面理解，促进新型诊断策略的开发，提供用于鉴定治疗药物和预防药物的分子靶标的线索。这样的信息有助于对膀胱肿瘤发生的更深的理解，为开发用于诊断、治疗和最终预防d、细胞肺癌的新战略提供了指示。本发明人还提示，特异性以ZIC5基因为靶标的小干扰RNA(siRNA)可以抑制细胞生长。因而，对抗癌药物开发而言，这些新的siRNA是有用的靶标。例如，阻断ZIC5的表达或抑制其活性的药物具有作为抗癌剂的治疗用途，具体而言是作为治疗肺癌包括小细胞肺癌的抗癌剂的治疗用途。进一步，对随机置换检验鉴定的34种基因的表达数据应用了聚类算法，简便地区分了肺癌的两种主要组织类型即非小细胞肺癌(NSCLC)和SCLC。这些数据为鉴定针对此类癌症的新诊断系统和治疗靶标分子提供了有价值的信息。对于小细胞肺癌和非小细胞肺癌，肺癌的化学治疗是完全不同的。因而，为了确定肺癌的治疗策略，识别SCLC与NSCLC是重要的。但是，传统的病理组织学诊断方法要求识别它们的专门技术。因此，本发明中鉴定的基因在肺癌的治疗中是非常有用的。本发明还提供鉴定的抗化疗性肺癌相关基因或SCLC相关基因。这些基因在抗化疗性肺癌或SCLC中是上调的。因而，抗化疗性肺癌或SCLC可以使用这些基因的表达水平作为诊断标志进行预测。其结果，可以避免无效化学治疗产生的任何不良作用，而选择更适合且有效的治疗策略。本文？1证并入本文提及的所有专利、专利申请和出版物的全部内容。另外，尽管已经详细地并且参考本发明的具体实施方案描述了本发明，其优选实施方案。通过常规的实验，本领域技术人员将容易地认识到，可对本发明进行各种变化和修饰而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明并不意欲受到上述说明的限定，而由如下权利要求及其等同物限定。权利要求1.一种诊断受试者中的小细胞肺癌或小细胞肺癌发病倾向性的方法，该方法包括测定来自该受试者的生物样品中小细胞肺癌相关基因的表达水平，其中，该样品中表达水平与该基因的正常对照水平相比增加或减少表明该受试者患有小细胞肺癌或存在发生小细胞肺癌的危险。2.权利要求1所述的方法，其中所述小细胞肺癌相关基因选自SCLCNos.777-1555所示基因，且其中所述样品中的表达水平与正常对照水平相比增加表明该受试者患有小细胞肺癌或存在发生小细胞肺癌的危险。3.权利要求2所述的方法，其中所述样品表达水平比所述正常对照水平高至少10%。4.权利要求1所述的方法，其中所述小细胞肺癌相关基因选自SCLCNos.l-776所示基因，且其中所述样品表达水平与正常对照水平相比减少表明该受试者患有小细胞肺癌或存在发生小细胞肺癌的危险。5.权利要求4所述的方法，其中所述样品表达水平比所述正常对照水平低至少10%。6.权利要求l所述的方法，其中该方法还包括测定多个小细胞肺癌相关基因的表达水平。7.权利要求1所述的方法，其中基因表达水平用选自下组的方法测定(a)检测小细胞肺癌相关基因的mRNA;(b)检测小细胞肺癌相关基因编码的蛋白；以及(c)检测小细胞肺癌相关基因编码的蛋白的生物活性。8.权利要求7所述的方法，其中所述检测在DNA阵列上进行。9.权利要求l所述的方法，其中所述生物样品包含上皮细胞。10.权利要求l所述的方法，其中所述生物样品包含小细胞肺癌细胞。11.权利要求1所述的方法，其中所述生物样品包含来自小细胞肺癌细胞的上皮细胞。12.—种小细胞肺癌参照表达模式，其包含选自SCLCNos.l-1555所示基因中两个以上小细胞肺癌相关基因的基因表达图式。13.—种小细胞肺癌参照表达^f莫式，其包含选自SCLCNos.l-776所示基因中两个以上小细胞肺癌相关基因的基因表达图式。14.一种小细胞肺癌参照表达冲莫式，其包含选自SCLCNos.777-1555所示基因中两个以上小细胞肺癌相关基因的基因表达图式。15.—种筛选用于治疗或预防小细胞肺癌的化合物的方法，该方法包括下列步骤(a)使受试化合物与选自SCLCNos.l-1555所示基因的多核苷酸编码的多肽接触；(b)检测所述多肽与受试化合物之间的结合活性；以及(c)选择与所述多肽结合的受试化合物。16.筛选用于治疗或预防小细胞肺癌的化合物的方法，该方法包括下列步骤(a)使候选化合物与表达一种或多种标志基因的细胞接触，其中所述一种或多种标志基因选自SCLCNos.l-1555所示基因；以及(b)选择下述候选化合物与没有该候选化合物时检测到的表达水平相比，所述候选化合物降低选自SCLCNos.777-1555所示基因的一种或多种标志基因的表达水平，或提高选自SCLCNos.l-776所示基因的一种或多种标志基因的表达水平。17.权利要求16所述的方法，其中所述细胞包括小细胞肺癌细胞。18.—种筛选用于治疗或预防小细胞肺癌的化合物的方法，该方法包括下列步骤(a)使受试化合物与选自SCLCNos.l-1555所示基因的多核苷酸编码的多肽接触；(b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；以及(c)选择下述受试化合物与没有该受试化合物时检测到的所述多肽的生物活性相比，所述受试化合物抑制选自SCLCNos.777-1555所示基因的多核香酸编码的多肽的生物活性，或者，与没有该受试化合物时检测到的所述多肽的生物活性相比，所述受试化合物增强选自SCLCNos.l-776所示基因的多核芬酸编码的多肽的生物活性。19.筛选用于治疗或预防小细胞肺癌的化合物的方法，该方法包括下列步骤(a)使候选化合物与导入了载体的细胞接触，所述载体含有一种或多种标志基因的转录调控区以及在所述转录调控区控制下表达的报道基因，其中所述一种或多种标志基因选自SCLCNos.1-1555所示基因；(b)测定所述报道基因的表达或活性；以及(c)选择下述候选化合物与没有该受试化合物时检出的所述报道基因的表达水平或活性水平相比，当所述标志基因是选自SCLCNos.777-1555所示基因的上调标志基因时，所述候选化合物降低所述报道基因的表达或活性，或者，当所述标志基因是选自SCLCNos.l-776所示基因的下调标志基因时，所述候选化合物提高所述报道基因的表达水平或活性水平。20.—种试剂盒，包含检测试剂，其中所述检测试剂与(a)选自SCLCNos.1-1555所示基因的2种以上核酸序列，或者与(b)由其编码的多肽结合。21.—种阵列，其含有与选自SCLCNos.1-1555所示基因的l种或多种核酸序列结合的2种以上核酸。22.—种治疗或预防受试者中的小细胞肺癌的方法，其包括对所述受试者施用反义组合物，其中所述反义组合物包含与选自SCLCNos.777-1555所示基因的编码序列互补的核苷酸序列。23.—种治疗或预防受试者中的小细胞肺癌的方法，其包括对所述受试者施用siRNA组合物，其中所述siRNA组合物减少选自SCLCNos.777-1555所示基因的核酸序列的表达。24.—种治疗或预防受试者中的小细胞肺癌的方法，其包括对所述受试者施用药学有效量的抗体或其免疫学活性片段的步骤，其中，所述抗体或其免疫学活性片段与由选自SCLCNos.777-1555所示基因的任一基因编码的蛋白结合。25.—种治疗或预防受试者中的小细胞肺癌的方法，其包括对所述受试者施用疫苗，所述疫苗包含(a)由选自SCLCNos.777-1555所示基因的核酸编码的多肽；(b)所述多肽的免疫学活性片段；或(c)编码所述多肽的多核苷酸。26.—种诱导抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括使抗原呈递细胞与多肽、编码该多肽的多核苷酸或者含有该多核苷酸的载体接触的步骤，其中，所述多肽是选自SCLCNos.777-1555所示基因的基因所编码的多肽或其片段。27.权利要求26的诱导抗肿瘤免疫的方法，所述方法进一步包括对受试者施用抗原呈递细胞的步骤。28.—种治疗或预防受试者中的小细胞肺癌的方法，所述方法包括施用根据权利要求15-19中任一项的方法获得的化合物的步骤。29.—种治疗或预防受试者中的小细胞肺癌的方法，其包括对所述受试者施用药学有效量的药物，所述药物含有(a)选自SCLCNos.l-776所示基因的多核苷酸，或者(b)由该多核苷酸编码的多肽。30.—种治疗或预防小细胞肺癌的组合物，所述组合物含有药学有效量的反义多核苷酸或siRNA,所述反义多核苷酸或siRNA针对选自SCLCNos.777-1555所示基因的多核香酸。31.—种治疗或预防小细胞肺癌的组合物，所述组合物含有药学有效量的抗体或其片段，所述抗体或其片段与由选自SCLCNos.777-1555所示基因的基因编码的蛋白结合。32.—种治疗或预防小细胞肺癌的组合物，所述组合物含有药学有效量的通过权利要求15-19中任一项的方法选择的化合物作为有效成分，和药学可接受的载体。33.—种区别小细胞肺癌和非小细胞肺癌的方法，该方法包括以下步骤(a)检测采集自待诊断受试者的标本中一种或多种标志基因的表达水平，其中所述一种或多种标志基因选自SCLCNos.l556-1589所示基因；(b)将所述一种或多种标志基因的表达水平与非小细胞肺癌的表达水平进行比较，其中，与非小细胞肺癌相比，所述标志基因的表达水平提高指示小细胞肺癌。34.—种治疗或预防受试者中的小细胞肺癌的方法，其包括对所述受试者施用组合物，所述组合物含有抑制Z/C5的表达的小干扰RNA(siRNA)。35.权利要求34的方法，其中所述siRNA包含有义核酸序列和与来自Z/C5的序列特异性杂交的反义核酸序列。36.权利要求35的方法，其中所述siRNA包含对应于由SEQIDNO:171构成的序列的核糖核苷酸序列作为耙序列。37.权利要求36的方法，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，，式中[A]为对应于由SEQIDNO:171所示核苷酸构成的序列的核糖核苷酸序列，[B]为由3-23个核苷酸组成的核糖核普酸环序列，和[A，]为由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。38.权利要求34的方法，其中所述组合物包含转染增强剂。39.—种双链分子，包含有义链和反义链，其中所述有义链含有对应于由SEQIDNO:171构成的靶序列的核糖核苷酸序列，且其中所述反义链含有与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链相互杂交形成所述双链分子；且其中将所述双链分子导入表达Z/C5基因的细胞时，所述双链分子抑制所述基因的表达。40.权利要求39的双链分子，其中所述靶序列含有来自SEQIDNO:175所示核苷酸序列的至少约IO个连续的核苷酸。41.权利要求40的双链分子，其中所述靶序列含有来自SEQIDNO:175所示核苷酸序列的约19~约25个连续的核苷酸。42.权利要求41的双链分子，其中所述双链分子为单一核糖核苷酸转录物，包含通过单链核糖核苷酸序列连接的有义链和反义链。43.权利要求40的双链分子，其中所述双链分子为长度少于约100个核苷酸的寡核苦酸。44.权利要求43的双链分子，其中所述双链分子为长度少于约75个核苷酸的寡核苷酸。45.权利要求44的双链分子，其中所述双链分子为长度少于约50个核苷酸的寡核苦酸。46.权利要求45的双链分子，其中所述双链分子为长度少于约25个核香酸的寡核苷酸。47.权利要求46的双链寡核苷酸，其中所述双链分子为长度约19约25个核普酸的寡核苦酸。48.—种载体，其编码权利要求40的双链分子。49.权利要求48的载体，其中该载体编码具有二级结构的转录物，并且包含有义链和反义链。50.权利要求49的载体，其中所述转录物进一步包括连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列。51.—种载体，其含有多核苷酸，所述多核苷酸包含有义链核酸和反义链核酸的组合，其中所述有义链核酸包含SEQIDNO:171所示核香酸序列，所述反义链核酸由与所述有义链互补的序列构成。52.权利要求51的载体，其中所述多核普酸具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3',式中[A]为SEQIDNO:171所示的核香酸序列，[B]为由3-23个核苦酸组成的核苷酸序列，[A，]为与[A]互补的核苷酸序列。53.—种治疗或预防小细胞肺癌的药物组合物，其含有药学有效量的抑制27C5表达的小干扰RNA(siRNA)作为活性成分，和药学可接受的载体。54.权利要求53的药物组合物，其中所述siRNA包含由SEQIDNO:171构成的核苷酸序列作为靶序列。55.权利要求54的组合物，其中，所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，，式中[A]为对应于SEQIDNO:171所示核苷酸序列的核糖核香S吏序列，[B]为由3-23个核苷酸组成的核糖核香酸序列，和[A，]为与[A]互补的核糖核普酸序列。56.—种诊断受试者中抗化疗性肺癌或抗化疗性肺癌发病倾向性的方法，该方法包括测定来自患者的生物学样品中选自表5所列基因的抗化疗性肺癌相关基因的表达水平，其中，与该基因的对照水平相比，所述样品表达水平增加表示所述受试者患有抗化疗性肺癌或存在发生抗化疗性肺癌的危险。57.权利要求56的方法，其中所述样品表达水平比所述对照水平高至少10%。58.权利要求56的方法，其中所述抗化疗性肺癌为小细胞肺癌，所述抗化疗性肺癌相关基因选自表6所列的基因。59.权利要求56的方法，其中该方法还包括测定多个抗化疗性肺癌相关基因的表达水平.60.权利要求56的方法，其中所述基因表达水平用选自下组的方法测定(a)4企测抗化疗性肺癌相关基因的mRNA，(b)检测抗化疗性肺癌相关基因编码的蛋白，以及(c)检测抗化疗性肺癌相关基因编码的蛋白的生物活性。61.权利要求60的方法，其中所述检测在DNA阵列上进行。62.权利要求56的方法，其中所述生物样品包括肺癌细胞。63.权利要求56的方法，其中所述生物样品包括来源于肺癌细胞的上皮细胞。64.—种抗化疗性肺癌参照表达模式，其包含选自表5所列基因的两种以上抗化疗性肺癌相关基因的基因表达图式。65.权利要求64的表达模式，其中所述抗化疗性肺癌为小细胞肺癌，所述抗化疗性肺癌相关基因选自表6所列的基因。66.—种筛选用于治疗或预防抗化疗性肺癌的化合物的方法，该方法包括下列步骤(a)使受试化合物与选自表5所列基因的多核苷酸编码的多肽接触；(b)检测所述多肽与受试化合物之间的结合活性；以及(c)选择与所述多肽结合的受试化合物。67.—种筛选用于治疗或预防抗化疗性肺癌的化合物的方法，该方法包括下列步骤(a)使候选化合物与表达一种或多种标志基因的细胞接触，所述一种或多种标志基因选自表5所列的基因；(b)选择下述候选化合物与没有该候选化合物时检测到的表达水平相比，所述候选化合物减少选自表5所列基因的一种或多种标志基因的表达水平。68.权利要求67所述的方法，其中所述细胞包括抗化疗性肺癌细胞。69.—种筛选用于治疗或预防抗化疗性肺癌的化合物的方法，该方法包括下列步骤(a)使受试化合物与选自表5所列基因的多核苷酸编码的多肽接触；(b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；以及(c)选择下述受试化合物与没有该受试化合物时检测到的所述多肽的生物活性相比，所述受试化合物抑制选自表5所列基因的多核苷酸编码之多肽的生物活性。70.—种筛选用于治疗或预防抗化疗性肺癌的化合物的方法，该方法包括下列步骤(a)使候选化合物与导入了载体的细胞接触，所述载体含有一种或多种标志基因的转录调控区以及在所述转录调控区控制下表达的报道基因，其中，所述一种或多种标志基因选自表5所列的基因；(b)测定所述报道基因的表达或活性；以及(c)选择下述候选化合物与没有该受试化合物时检测到的所述报道基因的表达水平或活性水平相比，所述候选化合物减少所述报道基因的表达或活性。71.权利要求6670任一项的方法，其中，所述抗化疗性肺癌为小细胞肺癌，所述抗化疗性肺癌相关基因选自表6所列的基因。72.—种用于>^测抗化疗性肺癌的试剂盒，该试剂盒包含^f全测试剂，所述检测试剂与(a)选自表5所列基因的2种以上核酸序列，或者与(b)由其编码的多肽结合。73.权利要求72的试剂盒，其中，所述抗化疗性肺癌为小细胞肺癌，所述抗化疗性肺癌相关基因选自表6所列的基因。74.—种用于检测抗化疗性肺癌的阵列，其含有与选自表5所列基因的1种或多种核酸序列结合的2种以上核酸。75.权利要求74的阵列，其中，所述抗化疗性肺癌为小细胞肺癌，所述抗化疗性肺癌相关基因选自表6所列的基因。76.—种治疗或预防受试者中抗化疗性肺癌的方法，其包括对所述受试者施用反义组合物，所述反义组合物包含与选自表5所列基因的编码序列互补的核苷酸序列。77.—种治疗或预防受试者中抗化疗性肺癌的方法，其包括对所述受试者施用siRNA组合物，其中所述siRNA组合物减少选自表5所列基因的核酸序列的表达。78.—种治疗或预防受试者中抗化疗性肺癌的方法，包括对所述受试者施用药学有效量的抗体或其免疫学活性片段的步骤，其中所述抗体或其免疫学活性片段与由选自表5所列基因的任一基因编码的蛋白结合。79.—种治疗或预防受试者中抗化疗性肺癌的方法，其包括对所述受试者施用疫苗，其中所述疫苗包含(a)由选自表5所列基因的核酸编码的多肽；(b)所述多肽的免疫学活性片段；或(c)编码所述多肽的多核苦酸。80.—种诱导抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括使抗原呈递细胞与多肽、编码该多肽的多核芬酸或者含有该多核苷酸的载体接触，其中，所述多肽为由选自表5所列基因的基因编码的多肽或其片段。81.权利要求80的诱导抗肿瘤免疫的方法，所述方法进一步包括对受试者施用所述抗原呈递细胞的步骤。82.权利要求7581任一项的方法，其中所述抗化疗性肺癌为小细胞肺癌，所述抗化疗性肺癌相关基因选自表6所列的基因。83.—种治疗或预防受试者中抗化疗性肺癌的方法，所述方法包括施用根据权利要求66~70中任一项的方法获得的化合物的步骤。84.—种治疗或预防受试者中抗化疗性小细胞肺癌的方法，该方法包括施用通过权利要求71所述的方法获得的化合物的步骤。85.—种治疗或预防抗化疗性肺癌的组合物，所述组合物含有药学有效量的反义多核苷酸或siRNA，所述反义多核苷酸或siRNA针对选自表5所列基因的多核苷酸。86.—种治疗或预防抗化疗性肺癌的组合物，所述组合物含有药学有效量的抗体或其片段，所述抗体或其片段与由选自表5所列基因的基因编码的蛋白结合。87.权利要求85或86所述的组合物，其中所述抗化疗性肺癌为小细胞肺癌，所述抗化疗性肺癌相关基因选自表6所列的基因。88.—种治疗或预防抗化疗性肺癌的组合物，所述组合物含有药学有效量的通过权利要求66-70中任一项的方法选择的化合物作为活性成分，和药学可接受的载体。89.—种治疗或预防抗化疗性肺癌的组合物，所述组合物含有药学有效量的通过权利要求71的方法选择的化合物作为活性成分，和药学可接受的载体。全文摘要本发明公开了旨在检测和诊断小细胞肺癌(SCLC)的客观方法。在一个实施方案中，本诊断方法包括测定区分SCLC细胞与正常细胞的SCLC相关基因的表达水平的步骤。在另一个实施方案中，本诊断方法包括测定区分肺癌的两种主要组织类型即非小细胞肺癌(NSCLC)和SCLC的SCLC相关基因的表达水平的步骤。最后，本发明提供用于小细胞肺癌治疗的治疗剂的筛选方法、小细胞肺癌的治疗方法及为受试者进行抗小细胞肺癌接种的方法。进一步，本发明还提供抗化疗性肺癌相关基因或SCLC相关基因作为抗化疗性肺癌的诊断标志和/或针对这些癌症的治疗剂的分子靶标。这些基因在抗化疗性肺癌或SCLC中是上调的。因而，抗化疗性肺癌或SCLC可以以这些基因的表达水平作为诊断标志进行预测。结果，可以避免无效化学治疗产生的任何有害作用，而选择更为适合且有效的治疗策略。文档编号C12N15/113GK101283106SQ20068003574公开日2008年10月8日申请日期2006年7月26日优先权日2005年7月27日发明者中村佑辅,中鹤修一,醍醐弥太郎申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司