用于检测β球蛋白基因的变异的探针的制作方法

用于检测β球蛋白基因的变异的探针的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于，提供一种能够简便且短时间地检测多个变异(待测物)的、用于检测β球蛋白基因的变异的探针。本发明提供含有序列号3、4、7、8、11、12、17、18、25～66所示的基因的用于检测β球蛋白基因的变异的探针。
【专利说明】
用于检测β球蛋白基因的变异的探针
[00011 本申请是原申请、申请日为2013年3月28日，申请号为201380017558.4,发明名称 为"用于检测β球蛋白基因的变异的微阵列及其检测方法"的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于检测β球蛋白基因的变异的探针组、具有该探针组的微阵列、及使 用其检测β球蛋白基因的变异的方法。
【背景技术】
[0003] 人类基因组由约30亿个基因密码(碱基)构成，逐渐了解到个体间存在多个基因密 码(碱基序列）的差异。现在，这些碱基序列的差异中，特别引人关注的是单核苷酸多态性 (SNP)〇
[0004] 单核苷酸多态性(SNP)是指在DNA的碱基序列中仅1个碱基不同，是对应于是否能 喝酒、药是否容易发挥作用等人类个性的最小单位。在人类基因组的30亿个碱基对中，显示 存在约300万个(每500~1000碱基对中存在1个的比例）~1000万个单核苷酸多态性(SNP)， 通过不生成特定的蛋白质或形成与他人不同之处，从而带来个体差异(体质）、人种差异等 差别。就人类基因的个体差异的研究而言，可以说对单核苷酸多态性进行解析、调查疾病易 感性以及对药物的响应并给与对该人类个体副作用少的药物即定制医疗将成为可能，单核 苷酸多态性(SNP)解析的研究在不断推进。
[0005] 单核苷酸多态性（SNP)引人关注的理由在于，随着核酸解析技术的改进而能够进 行多个SNP解析，此外，疾病和SNP之间的相关性也逐渐明确。在疾病相关基因、药物代谢的 个体差异解析及慢性疾病等广泛领域中，与SNP的相关性也逐渐明确。期待着今后SNP与这 些的相关性的进一步明确。
[0006] 核酸解析技术处理非常繁多的试样、含有数量庞大的操作，复杂且费时，通常要求 较高精度。核酸解析技术中，作为迅速高精度地检测多个基因变异的手段，已知SNP检测用 DNA芯片(DNA芯片也称为DNA微阵列。以下只要没有特别限定则意义相同。）是有效的。
[0007] DNA芯片是指在载体的各个所设定的分区中固定有核酸探针(探针）的芯片，通常， 核酸探针使用具有与待测核酸片段互补的碱基序列的单链DNA或寡核苷酸分子。
[0008] SNP检测用DNA芯片中，固定有与变异核酸的检查对象位点相当的核酸片段的互补 链作为核酸探针。就变异的检查对象位点而言，通常存在1个正常型和多个变异型，与这些 中的任意者匹配的核酸探针排列在分区（P〇lt)内。待测试样使用如下待测物液体，所述待 测物液通过以PCR法为代表的核酸扩增法仅扩增出与发生变异的检查对象位点相当的核酸 片段。
[0009] 使该待测物液与SNP检测用DNA芯片的固定有核酸探针的面接触，使待测物核酸片 段和对应的核酸探针间发生杂交。然后，检测该杂交所形成的键作为光学或电化学信号形 式，从而可以鉴定和定量与核酸探针发生结合的待测物核酸片段。
[0010] 在此，当核酸探针和待测物的组合为野生型探针和野生型待测物、或变异型探针 和与其对应的变异型待测物这样的完全匹配时，杂交完全，形成强键。而另一方面，核酸探 针和待测物的组合为野生型探针和变异型待测物、或变异型探针和野生型待测物这样的错 配时，必然伴有不能形成氢键的位点，因此杂交不完全，形成弱键。
[0011]通常，为了维持高特异性，在通过温度、盐、洗涤剂、溶剂、离液剂及变性剂的各种 组合所实现的最为严格的条件下进行杂交，对完全匹配和错配之间的杂交结合力差异所引 起的信号强度差异进行检测，从而能够识别、确定待测物中的基因型。
[0012] 但是，血红蛋白为将氧由肺向细胞、且将二氧化碳从细胞向肺输送的含铁变构复 合蛋白。血红蛋白A为主要的成熟血红蛋白，含有4条多肽链(2条α-球蛋白链及2条β球蛋白 链)。
[0013] 多种人类疾病被认为有起因于对编码血红蛋白多肽链的1个以上基因产生影响的 基因变异。这类疾病含有镰状红细胞贫血，其是由于血红蛋白β链中的点突变而发生的。此 外，β地中海贫血症是由于球蛋白链的1种型的不充分合成从而表型上成为显著的、由基因 变异而发生的血液相关疾病，产生其它型球蛋白链的过度合成(例如，参照非专利文献1)。
[0014] 另一方面，最新开发的分子生物学技术已经能够对引起特定的人疾病状态及症状 或与之相关的基因异常进行研究。聚合酶链反应(PCR)及其多种变形的方法成为用于疾病 状态及症状中的基因异常研究的极其有用的工具(例如，参照非专利文献2及3)。
[0015] 使用PCR法容易对特定的目的DNA或该DNA的部分进行扩增，并对扩增出的部分进 一步附加特征。该进一步附加特征包括用于确定大小的凝胶电泳、核苷酸序列确定、使用特 定探针的杂交研究等(例如，参照非专利文献4)。
[0016] 近年，进行了很多关于SNPs(单核苷酸多态性)等基因型（即基因多态性)和疾病等 的因果关系的研究，正在对基因异常是否存在于特定个体的基因组进行确定。
[0017] 作为对SNPs等一个碱基变异或2个以上碱基数的基因变异进行判定（检测）的方 法，首先有PCR- SSP法。该方法由于对发生变异的基因的碱基序列合成特异性引物、实施 PCR，因此为了判断数十个基因变异，需要数十对引物。
[0018] 该方法的分析时间短，为简便的方法，但合成上述引物时得小心翼翼，还需要知识 和时间，因此在大量待测物的分析中存在限制。除此之外，欲对变异进行检测的位置越多则 PCR - SSP的次数也越多，因此具有难以一次处理多个待测物的缺点。
[0019] 作为第2方法可以被认为是从以往一直进行的限制酶片段长度多态性法(PCR-RFLP法）。对共通序列位点设定引物，使其内侧、即PCR产物内具有多态性并对其进行扩增。 扩增后，利用各种限制酶将扩增产物切断，通过其DNA片段的尺寸将基因序列的变异分类。
[0020] 该方法虽然结果的判定容易、方法也简单，但在限制酶所能够识别的位点被限定 时变得难以判别，此外，待测物的分离中必须使用聚丙烯酰胺凝胶，因此难以对大量的待测 物、数十个变异同时进行分类。进而有报道指出，通常在对全血待测物直接进行PCR扩增后、 用限制酶进行片段化时，扩增待测物中残存来自于全血的蛋白质，利用限制酶进行的切断 并不完全。即，由于结合于DNA的蛋白质没有从DNA中分离，限制酶无法与DNA结合，切断反应 未正常进行，需要进行DNA的提取操作。
[0021] 作为第3方法，有PCR-SSCP法。该方法为如下方法，即，在添加甲酰胺等变性剂使 PCR产物变性为单链DNA (ssDNA)后，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳中，ssDNA具 有基于其碱基序列的特殊结构，电泳中显示固有的移动速度，分别形成不同类型的条带。
[0022] 该方法为利用基于碱基序列而显示固有的移动速度这一性质对碱基序列中的变 异进行分类的方法，需要复杂且难度高的技术，其结果的解析也需要经验和知识。
[0023] 作为第4方法可以认为是PCR_SSO(sequence specific oligonucleotide)法。 PCR-SS0为如下方法，即，使针对正常位点和变异位点的合成探针与点样在过滤器的（有时 也使用微孔板)PCR产物杂交，来检测有无变异。此外，相反地、也有将探针点样、使PCR产物 杂交的反向点杂交法(Reverse dot blot method)。如果比喻成抗原抗体反应有如下方法， 即，DNA作为抗原，与针对变异位点的特异性抗体和针对正常位点的特异性抗体进行作用， 观察与哪种抗体发生结合。一直以来，该方法的检测中使用放射性同位素，由于所使用的设 施的制约等，逐渐变成通过化学发光、显色等进行检测。
[0024] 该方法虽然简便，但需要确保样品量为相当大量、否则反而需要引入提高灵敏度 的方法(例如，参照非专利文献5及6、专利文献1)。
[0025] 作为第5方法，已知有直接碱基序列确定法。直接碱基序列确定法是以PCR扩增获 得的DNA链为模板直接确定碱基序列而无需进行亚克隆等到载体的方法。
[0026]该方法中，对PCR扩增获得的DNA链进行被称为非对称PCR的二次PCR，对单链DNA进 行扩增，通常使用双脱氧法来确定碱基序列。该二次PCR是通过对一组引物中的一者限量 (通常为1:10~1:100)进行PCR，从而对单链DNA进行扩增。最近应用循环测序法，能够更简 单地进行测序反应。但是试剂盒价格非常昂贵，还需要昂贵的装置，实验过程也复杂，因此 用于大量待测物的解析时成本上升。
[0027] 专利文献1:日本特开平5-184398号公报
[0028] 非专利文献l:Weatherall等，The Thalassaemia Syndromes，第3版，Oxford， Blackwell Scientific,1981
[0029] 非专利文献 2 : Erl ich 等，Current Communications in Molecular Biology： Polymerase Chain Reaction,Cold Spring Harbor：Cold Spring Harbor Press(1989)
[0030] 非专利文献3:Innis 等，PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications.San Diego：Academic Press(1990)
[0031 ]非专利文献4: Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第2版， Cold Spring Harbor：Cold Spring Harbor Press(1989)
[0032] 非专利文献 5: Am. J.Hum.Genet. 43:095-100,1988
[0033] 非专利文献6:Blood，Vol81，No l(January l).1993:pp 239-242

【发明内容】

[0034] 如上所述，为了对基因的变异进行分析·检测而使用了各种检测方法，但这些方 法的共通缺点在于，为了同时检测多个变异，需要极长时间和海量的劳动，尤其是对大量待 测物进行分析则困难更大。
[0035] 因此，本发明的主要目的在于，提供能够简便且短时间地检测多个变异(待测物） 的、用于检测β球蛋白基因的变异的微阵列。
[0036] 本发明人等鉴于现有技术存在的问题反复进行了深入研究，结果发现，通过使用 多种具有特定序列的探针可以实现上述目的，直至完成了本发明。
[0037] 即、本发明涉及一种含有序列号3、4、7、8、11、12、17、18和序列号25~66所示的基 因的用于检测β球蛋白基因的变异的探针组、固定化有该探针组的微阵列、使用该微阵列的 变异检测方法及试剂盒。
[0038]根据本发明，PCR产物可以不精制就与杂交溶液混合并直接与微阵列接触、反应， 因此即使使用大量待测物的情况下也能够在短时间内进行处理。进而，可以一次性检测β球 蛋白基因的25个位置的变异，因此实用性、有用性优异。
【附图说明】
[0039]图1是示出本发明的校正方法的图。
[0040]图2是示出本发明的校正方法的图。
[0041]图3是示出本发明的校正方法的图。
[0042]图4是示出本发明的校正方法的图。
[0043] 图5示出在表示第1、第2多态性检测用探针的信号强度的荧光坐标系中，标绘将第 1对照核酸多次杂交的结果、以及获得的代表性直线。
[0044] 图6示出在图5的基础上标绘将第2对照核酸多次杂交的结果、以及获得的代表性 直线。
[0045]图7是校正值C、C2的图。
[0046]图8是使用校正值C、C2、误差角度进行校正前、校正后的探针性能数据。
[0047]图9是由来自于质粒的25种样品获得的数据的校正前、校正后。
[0048]图10是将表9的数据叠加在图9的校正后的图中的结果。
【具体实施方式】
[0049]以下详细说明本发明。以下的实施方式是用于说明本发明的例示，本发明并非仅 限于该实施方式。本发明只要不脱离其主旨就可以以各种方式实施。
[0050] 予以说明，本说明书中引用的全部文献、公开公报、专利公报以及专利文献均作为 参照而引入本说明书中。此外，本说明书含有了作为本申请优先权基础的、于2012年03月29 日提出的日本专利申请（日本特愿2012-077394号）的说明书及附图中所述的内容。
[0051] 以下详细说明本发明。以下的实施方式是用于说明本发明的例示，本发明并非仅 限于该实施方式。本发明只要不脱离其主旨就可以以各种方式实施。
[0052]此外，在无特别记载时，氨基酸序列的左端表示氨基末端、右端表示羧基末端，碱 基序列的左端表不5末端、右端表不3末端。
[0053] 1.多态性检测用探针
[0054] 在多态性的检测中通常使用微阵列，为了进行高灵敏度检测，需要不易产生非特 异性杂交的高性能的探针。探针的性能通常取决于探针的Tm值(Tm值高容易发生非特异性 杂交），而Tm值取决于探针的序列。因此，通常探针的性能受到作为检测对象的多态性的周 边区域序列的制约。
[0055] 但是，本发明人等通过对探针的序列添加不损害探针本来性能的程度的修饰，从 而成功地调节了探针的Tm值、提高了探针的性能。
[0056]因此，本发明提供以下探针。
[0057] 一种探针，其特征在于，其为用于检测具有1个以上多态性的多核苷酸序列的探 针，
[0058]其与该序列杂交且至少满足以下条件之一。
[0059] (1)其两端或一端分别含有1个以上的与该序列不互补的碱基。
[0060] (2)对该序列中含有的多个多态性中的非检测目的的多态性，与其对应的上述探 针的部分为通用碱基。
[0061 ] (3)与检测目的的多态性对应的碱基部分位于自探针的任一末端起6个以下的位 置。
[0062]本发明中，"探针"是指可以捕捉待测物中含有的作为检测目的的物质的探针，表 示脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)等核酸类。这些探针可以是在试管内 通过酶等合成的DNA或化学合成的寡核苷酸等合成市售品，或者由活细胞等获得。此外，还 可以使用利用限制酶或化学方式修饰或切断的DNA片段。
[0063] 探针的长度通常为10~100bp左右，优选10~80bp，更优选10~50bp，进而优选10 ~35bp，最优选12~28bp。
[0064] 此外，作为检测对象的"具有1个以上多态性的多核苷酸序列"是指待测物中含有 的多核苷酸，其碱基序列中具有1个以上、2个以上、或3个以上的多态性。
[0065] 作为检测对象的多核苷酸主要来自于人的待测物，但是只要能够进行扩增反应则 也可以使用任意生物种。
[0066] 待测物可以是来自于任何组织的细胞、血液、体液。作为待测物的具体例子，可以 列举来自于人的脑、心脏、肺、脾脏、肾脏、肝脏、胰脏、胆囊、食道、胃、肠、膀胱及骨骼肌等各 种组织的细胞、血液以及体液。更详细而言，可以列举血液、髓液、尿、喀痰、胸水、腹水、胃液 及水泡内体液等。
[0067] 作为检测对象的多核苷酸可以在供于微阵列前预先进行精制。关于多核苷酸的精 制方法，例如，可以采用基于Maniatis等的记载（Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，pp280,281，1982)的各种技术。
[0068] 特征（1):其两端或一端分别含有1个以上的与含有作为检测对象的多态性的多核 苷酸序列不互补的碱基
[0069]通常，鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的含量多的"富GC"的多核苷酸的Tm值高，容易发生 非特异性杂交。
[0070] 因此，本发明人等发现，作为探针使用的多核苷酸含有富GC区域时，通过使该区域 的两端含有与富GC序列不互补的碱基，特意使探针和检测对象多核苷酸之间产生错配，由 此，可以降低探针的Tm值。
[0071] "不互补的碱基"是指，只要是与作为检测对象的多核苷酸序列上的所对应的碱基 产生错配的碱基即可，可以为任意碱基。例如，若作为检测对象的多核苷酸序列上的对应碱 基为"C"，则不互补的碱基可以为"A"、"T"、"C"中的任一者。若作为检测对象的多核苷酸序 列上的对应碱基为"G"，则不互补的碱基可以为"A"、"T"、"G"中的任一者。此外，若作为检测 对象的多核苷酸序列上的对应碱基为"A"，则不互补的碱基可以为"A"、"C"、"G"中的任一 者。进而，若作为检测对象的多核苷酸序列上的对应碱基为"T"，则不互补的碱基可以为 中的任一者。
[0072]此外，两端含有的不互补的碱基的个数在5'末端和3'末端可以不同。
[0073] 本发明中，"不互补的碱基"含有于含有检测对象多态性的多核苷酸序列的两端 部、或含有多态性的富GC序列的两端部。例如，含有检测对象多态性的多核苷酸序列为 "GGCGC^GCGCGG"时（中央下划线部为检测对象多态性）时，具有特征（1)的探针可以是 "TGCGCgGCGCGA"、"ATGCGCgGCGCGAA"或 "ATGGCGCgGCGCGGAA"。
[0074] 优选的是，"不互补的碱基"在两端部分别含有1碱基以上、2碱基以上、或3碱基以 上。
[0075]本发明中，富GC区域是指G及C的含量在全部碱基序列中占50%以上、55%以上、 60%以上、61 %以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80% 以上、85%以上、90%以上或95%以上的序列区域。
[0076] 特征(2):含有作为检测对象的多态性的多核苷酸序列中含有的多个多态性中，与 非检测目的的多态性对应的上述探针的部分为通用碱基
[0077] 在作为检测对象的多核苷酸序列中除了作为检测对象的第1多态性以外还含有作 为非检测对象的第2多态性时，对具有该特征的探针是有用的。
[0078] 此时，探针和检测对象多核苷酸的结合力不仅根据第1多态性的组合也根据第2多 态性的组合而变化，因此对本来的作为检测对象的第1多态性，降低检测灵敏度。
[0079] 在直接使用该多核苷酸序列作为探针的序列时，可能发生第1多态性部分中检测 对象多核苷酸与探针匹配、而第2多态性部分不匹配(错配）的情况，和发生第1多态性部分 中检测对象多核苷酸与探针不匹配(错配）、而第2多态性部分匹配的情况。后者的情况下， 虽然第1多态性不匹配，但探针和检测对象多核苷酸以与前者同样水平的结合力进行杂交， 因而发出与前者同样的阳性信号。
[0080] 因此，上述情况下，无法区分前者(真阳性)和后者(假阳性）。
[0081] 因此，为了削弱第2多态性的影响，本发明的探针其特征在于，与第2多态性对应的 部分含有通用碱基。
[0082]本发明中，通用碱基是指与天然核酸碱基、即腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、 尿嘧啶中的任一者均不形成碱基对的碱基。
[0083 ] 作为这样的通用碱基的例子，可以列举出5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、7-氮杂吲哚、 6-甲基-7-氮杂Π 引噪、吡略吡啶、咪唑并吡啶、异喹诺酮（isocarbostyril)、丙炔基-7-氮杂 吲哚、丙炔基异喹诺酮、及丙二烯基-7-氮杂吲哚，但并非仅限于此。
[0084]或者，作为通用碱基的例子，可以列举出包括其丙炔基衍生物在内的以下化合物 中的任一者或者一者以上。
[0085] 8_氣杂_7_脱氣_2'_脱氧鸟昔、8_氣杂_7_脱氣_2'_脱氧腺昔、2'-脱氧胞昔、2'-脱 氧尿苷、2'-脱氧腺苷、2'-脱氧鸟苷、及吡咯并[2,3-d]嘧啶核苷。
[0086] 进而，通用碱基还可以由包括其衍生物在内的以下化合物中的任一者形成。
[0087] 脱氧肌昔(例如2' -脱氧肌昔）、7_脱氣_2'-脱氧肌昔、2'-氣杂_2' -脱氧肌昔、3' -硝基唑、4 硝基吲哚，5 硝基吲哚、6 硝基吲哚、4-硝基苯并咪唑、硝基吲唑（例如5 硝 基口引唑）、4_氨基苯并咪唑、咪唑-4，5-二甲酰胺（imidazol-4，5-dicarboxamide)、3 ' -硝基 咪唑、咪唑-4-甲酰胺、3-(4-硝基唑-1-基)-1，2-丙二醇、及8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤(吡唑并 [3,4-(1]嘧啶-4-胺）。
[0088] 其它例子中，通用核酸碱基还可以通过将3-甲基-7-丙炔基异喹诺酮基、3-甲基异 喹诺酮基、5-甲基异喹诺酮基、异喹诺酮基、苯基、或芘基和核糖或脱氧核糖组合而形成通 用核酸碱基。
[0089] 特征(3):与检测目的多态性对应的碱基部分位于自探针的任一末端起6个以下的 位置
[0090] 此外，本发明的探针还可以设计为检测目的多态性存在于距离探针的任一末端 (5'末端或3'末端)6碱基以下的位置。
[0091] 这样设计的探针在以下方面是有用的。
[0092] 通常，在设计单核苷酸多态性检测用探针时，采用以检测目的多态性的位置为中 心在5'末端、3'末端侧两方向上具有同等程度的碱基长的探针设计。但是，当检测目的多态 性位点的5'末端或3'末端侧为极端富GC区域或极端富AT区域时，在检测目的多态性的位置 可能发生与探针的匹配或错配无关的结合、或不结合的情况。
[0093]因此，特征在于，使用将检测目的的多态性的位置设为距离末端6碱基以下的位 置、避开富GC区域、或富AT区域的探针。仅通过该特征无法提高探针的特异性时，还可以与 特征(1)组合。
[0094]作为本发明的多核苷酸的基础的基因，没有特别限定，例如，可以列举G6PD基因、 RAB27A基因 、CHS 1基因、MTHFR基因、HMGCL基因、SLC2A1基因、H6TO基因等。此外，为了获取个 别信息，也可以访问能够获取疾病信息和作为其原因、风险因子的基因的0ΜΙΜ数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)。
[0095] 某些实施方式中，本发明的多核苷酸是由人β球蛋白基因制备的。
[0096] 本发明中，具有检测目的多态性的多核苷酸序列中，鸟嘌呤及胞嘧啶的含量合计 为63%以上（富GC)，具有人β球蛋白基因的第99位~第117位、第127位~第142位、第1402位 ~第1416位的核苷酸序列。
[0097] 或者，具有检测目的多态性的多核苷酸序列中，鸟嘌呤及胞嘧啶的含量合计为 45%以下(贫GC)，具有人β球蛋白基因的第1378位~第1399位的核苷酸序列。
[0098] 上述区域为富GC区域或富AT区域，提供能够检测该位置处的多态性的探针。
[0099] 更具体而言，本发明的探针作为特别针对富GC区域的探针，具有序列号3,4,7,8， 17或18所述的序列。
[0100] 另一方面，本发明的探针作为特别针对贫GC区域的探针，具有序列号11或12所述 的序列。
[0101] 此外，本发明提供一种微阵列，其具有序列号3、4、7、8、11、12、17或18所述的序列 中的至少一者。
[0102] 2.探针组
[0103] 本发明中，使用序列号3、4、7、8、11、12、17、18和序列号25~66所示的序列作为探 针(本发明的探针组），根据需要，也可以使用本发明的探针组以外的基因作为探针。
[0104] 3.微阵列
[0105] (1)支持体
[0106] 为了实际使用上述探针组，需要将其固定化在支持体上。用于固定化的支持体的 种类没有限定，只要在杂交反应时探针不溶出（放出）到溶液中，反应后可以确定哪种探针 发生了反应就可以使用任意支持体。
[0107] 例如，可以列举过滤器、珠子、凝胶、芯片、玻片、多孔板、滤膜以及光纤等。更详细 而言，可以列举蛋白质印记(Western Blotting)滤纸、尼龙滤膜、聚偏氟乙稀制滤膜、硝基 纤维素滤膜（Pierce公司）、亲和珠子（住友电木株式会社）、MicroPlex(商标） Microspheres、xMAP Multi-Analyte LumAvidin Microspheres(Luminex公司）、免疫珠子 (株式会社Veritas)、DNA固定化用96孔板试剂盒(船越公司）、DNA固定化用基板(住友电木 株式会社）、微阵列用涂覆玻片（松波硝子工业株式会社）、水凝胶切片（perkin elmer公 司）、Sentrix(注册商标)Array Matrix( IILUMINA公司）等。
[0108] (2)固定化
[0109]关于探针的固定化，在使用过滤器、滤膜等时，可以将无修饰的探针直接点样，用 UV灯等照射而固定化。此外，在使用表面经化学活化的珠子、芯片、玻片、多孔板、滤膜以及 光纤等时，优选使用末端能够通过化学方式形成共价键的探针。更具体而言，使用5'末端或 3'末端导入了氨基等的探针。进而，固定化于凝胶等时，使用导入有能够进行共聚反应的不 饱和官能团的探针。通过具有该导入基团，从而通过与取代（甲基)丙烯酰胺衍生物、琼脂糖 衍生物、及交联剂的共聚反应而固定于凝胶的网格结构中。关于在核酸链的末端导入不饱 和官能团的方法，可以通过例如国际公开第02/062817号记载的那样的公知方法进行。
[0110] 本发明中优选将探针固定化于凝胶或凝胶中。这是由于，通过固定化于凝胶中，可 以提高探针的浓度，因此可以提高微阵列的检测灵敏度。此外，本发明中，优选使用在通孔 中保持有该凝胶、且具有多个该通孔的通孔型微阵列。
[0111] 通孔型微阵列可以在薄片状板上形成通孔而获得，优选的是，将固定化有探针的 凝胶载体按照其种类分别保持在不同的中空纤维等管状体的中空部内，将全部中空纤维等 管状体捆扎固定后，在纤维的长度方向反复切断而获得的微阵列。这是由于，可以大量生产 品质稳定的微阵列。如此可以获得各探针以独立的状态（1种探针被固定化于1个通孔内的 状态)固定化于各通孔内的微阵列。
[0112] 以下，对通孔型微阵列的制造方法的一个方式进行说明。该微阵列可以经由下述 (i)~（iv)的工序制造。
[0113] 工序（i ):按照中空纤维的各纤维轴处于同一方向的方式将多根中空纤维3维排 列，并将该排列用树脂固定，从而制造中空纤维束的工序
[0114] 通孔的形成方法没有特别限定，例如，可以利用如日本特开2001-133453号公报所 述的、在制作将中空纤维排列成同轴方向的排列体后用树脂固定的方法。中空纤维可以使 用各种材料，优选有机材料。
[0115] 作为由有机材料形成的中空纤维，例如，可以列举尼龙6、尼龙66、芳香族聚酰胺等 聚酰胺系中空纤维，聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚 碳酸酯等聚酯系中空纤维，聚丙烯腈等丙烯腈系中空纤维，聚乙烯、聚丙烯等聚烯烃系中空 纤维，聚甲基丙烯酸甲酯等聚甲基丙烯酸酯系中空纤维，聚乙烯醇系中空纤维，聚偏氯乙烯 系中空纤维，聚氯乙烯系中空纤维，聚氨酯系中空纤维，酚醛系中空纤维、聚偏氟乙烯、聚四 氟乙烯等形成的含氟系中空纤维、聚烷撑对羟基苯甲酸酯系中空纤维等。中空纤维可以是 多孔质，可以通过在熔融纺丝法或溶液纺丝法中组合拉伸法、微相分离法、提取法等公知的 多孔化技术而获得。孔隙率没有特别限定，从提高纤维材料单位长度中固定化的探针密度 的观点出发，期望为高孔隙率，以增大比表面积。中空纤维的内径可以任意设定。优选为10 ~2000μL?、更优选为 150 ~ΙΟΟΟμL?。
[0116] 该中空纤维的制造方法没有限定，可以通过如日本特开平11-108928号公报记载 的那样的公知方法制造。例如，优选熔融纺丝法，作为喷嘴，可以使用马蹄型、C型喷嘴、2重 管喷嘴等。本发明中，从能够形成连续的均一的中空部的观点出发，优选使用2重管喷嘴。
[0117] 此外，根据需要，还可以使用在中空纤维中含有适量炭黑等黑色颜料的材料。通过 含有黑色颜料，在检测时，可以降低来自于碎肩等杂质的光学噪音、提高树脂的强度。颜料 的含有量没有限定，可以根据中空纤维的尺寸、微阵列的使用目的等适当选择。例如，可以 设为〇. 1~10质量％、优选为〇.5~5质量％、更优选为1~3质量％。
[0118] 块状体的制造可以利用用粘接剂等树脂进行固定的方法，以使排列体的排列不会 混乱。例如，可以列举出将多根中空纤维以规定间隔平行配置在粘合片等片状物上形成片 状后、将该片卷成螺旋状的方法(参照日本特开平11-108928号公报）。
[0119] 此外，还可以列举如下方法，即，将2片以规定间隔设有多个孔的多孔板按照孔部 对齐的方式重叠，使中空纤维从它们的孔部通过，拉开2片多孔板的间隔、使固化性树脂原 料充满2片多孔板间的、中空纤维的周边的方法（日本特开2001-133453号公报）。
[0120] 作为固化性树脂原料，优选含有聚氨酯树脂、环氧树脂等有机材料的固化性树脂 原料。具体而言，优选由有机高分子等构成的1种以上材料形成的树脂原料。作为有机高分 子，可以列举聚氨酯、硅树脂、环氧树脂等橡胶材料;尼龙6、尼龙66、芳香族聚酰胺等聚酰胺 系树脂、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚碳酸酯等聚 酯系树脂、聚丙烯腈等丙烯酸系树脂、聚乙烯、聚丙烯等聚烯烃系树脂、聚甲基丙烯酸甲酯 等聚甲基丙烯酸酯系树脂、聚乙烯醇系树脂、聚偏氯乙烯系树脂、聚氯乙烯系树脂、酚醛系 树脂、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯等形成的氟系树脂、聚烷撑对羟基苯甲酸酯系树脂等。有机 高分子中还可以含有适量炭黑等黑色颜料。通过添加黑色颜料，在检测时，可以降低来自于 碎肩等杂质的光学噪音、以及提高树脂的强度。颜料的含有量没有限定，可以根据中空纤维 的尺寸、微阵列的使用目的等适当选择。例如，可以设为0.1~10质量％、优选为0.5~5质 量％、更优选为1~3质量％。
[0121] 本发明中排列的中空纤维的数量、即点样数没有限定，可以根据所要进行的实验 等适当选择。因此，中空纤维彼此的距离也根据微阵列的面积和所排列的中空纤维数量等 适当选择。
[0122] 工序(ii):将含有探针组的凝胶前体溶液导入中空纤维束的各中空纤维的中空部 的工序
[0123] 向中空丝内填充的凝胶材料的种类没有特别限定，若为由天然物质获得的凝胶材 料的情况下，可以利用琼脂糖、藻酸钠等多糖类，以及明胶、聚赖氨酸等蛋白质等。作为合成 高分子，例如，可以利用聚丙烯酰基琥珀酰亚胺等具有反应性官能团的聚合物和对其显示 反应性的交联剂反应而获得的凝胶。此外优选以丙烯酰胺、N，N_二甲基丙烯酰胺、N-异丙基 丙烯酰胺、N-丙烯酰基氨基乙氧基乙醇、N-丙烯酰基氨基丙醇、N-羟甲基丙烯酰胺、N-吡咯 烷酮、甲基丙烯酸羟乙酯、（甲基)丙烯酸及烯丙基糊精等聚合性单体作为单体，与多官能性 单体、例如甲撑双（甲基)丙烯酰胺、聚乙二醇二（甲基)丙烯酸酯等进行共聚获得的合成高 分子凝胶。
[0124] 本发明的微阵列中使用的凝胶浓度没有特别限定，根据使用的探针长度、量适当 选择。例如，换算成单体成分的浓度，优选为2~10质量％，更优选为3~7质量％、进而更优 选为3.5~5质量％。设为2质量％以上是由于探针可以可靠地进行固定化，可以高效地进行 靶标物质的检测。此外，设为10质量％以下是由于，即使将浓度提高为其以上也无法获得显 著的效果。
[0125]在将合成高分子凝胶保持于前述通孔基板的微阵列中时，可以在将合成高分子的 凝胶前体溶液填充到前述块中后、使其在块内凝胶化而保持。将凝胶前体溶液填充到块的 通孔内的方法，例如，可以通过将前述溶液抽吸到具有微细针的注射器中，将针插入各中空 纤维的中空部而进行导入。此外，预先将中空纤维束的被固定的端部的中空部密封，将另一 未固定的端部的中空部开放。然后，调制含有末端具有甲基丙烯酰基等聚合反应位点的核 酸探针的凝胶前体溶液，将该凝胶前体溶液及前述中空纤维束设置在干燥器内，然后将中 空纤维束的中空纤维未固定的端部浸入该溶液中，使干燥器内为减压状态后恢复至常压， 从而可以使该溶液由中空纤维浸入溶液的端部向中空纤维的中空部导入。
[0126] 工序(iii):使导入中空纤维束的中空部的凝胶前体溶液反应、将含有探针的凝胶 状物保持在中空纤维的中空部的工序
[0127] 通过使导入中空纤维的中空部的凝胶前体溶液聚合，可以使含有探针的凝胶状物 保持在中空纤维的中空部。聚合条件没有特别限定，可以根据使用的凝胶前体的种类等适 当选择。例如，若为丙烯酰胺系单体，则可以使用自由基引发剂进行聚合，优选可以通过利 用偶氮系引发剂的热聚合反应进行聚合。
[0128] 探针的种类、尺寸没有限定，根据作为检测对象的物质或化合物的种类适当选择。 [0129] 工序(iv):将中空纤维束在与纤维的长度方向交叉的方向切断而薄片化的工序
[0130] 切断方法只要能够薄片化即可，没有限定。例如，可以通过切片机、激光等进行。获 得的薄片的厚度没有限定，可以根据实验的目的等适当选择。例如，可以设为5_以下、优选 设为0 · 1~1mm。
[0131] (3)班求蛋白基因的变异的检测
[0132] 本发明中，检测β球蛋白基因的变异是指对β球蛋白基因序列中的具有变异部分的 碱基位点、序列进行确定，此外，是指从多个所确定的等位基因(allele)中判断是哪个等位 基因的组(二倍体生物）。
[0133] (a)首先，使含有人类基因组DNA的待测物和含有核酸扩增用引物组、核苷酸单体 及DNA延伸酶的反应溶液接触即可。
[0134] <待测物(作为核酸扩增模板的核酸)>
[0135] 待测物(作为核酸扩增模板的核酸)在本发明中是指含有作为检测目的的基因序 列即β球蛋白基因序列的核酸，含有β球蛋白基因序列的片段，只要是能够进行以下所述的 扩增反应的核酸，就可以是任意形态的核酸。
[0136] 待测物的来源为人，只要能够进行扩增反应则可以使用任意待测物。此外，待测物 还可以使用来自于所有组织的细胞、血液、体液。例如，可以列举来自于脑、心脏、肺、脾脏、 肾脏、肝脏、胰脏、胆囊、食道、胃、肠、膀胱、骨骼肌等各种组织的细胞、血液、体液。更详细而 言，例如，可以列举血液、髓液、尿、喀痰、胸水、腹水、胃液、水泡内体液等。
[0137] 此外，待测物优选在进行后述的核酸扩增前预先调制及精制成该扩增中能够使用 的含DNA试样的形式。该调制及精制可以按照公知的核酸提取法进行，例如，可以使用基于 Maniatis等的记载(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY， pp280,281，1982)的各种技术。
[0138] <核酸扩增用引物组、探针位置>
[0139] 本发明涉及用于检测β球蛋白基因的变异的探针组，其检测NCBI Reference Sequence :NC_000011.9(序列长度：135006516碱基）的互补链序列所编码的β球蛋白基因 序列的变异。
[0140] 通常，从检测的角度出发，优选预先确定欲检测的核酸的变异位置。引物对只要能 够生成含有欲检测的变异位置的扩增产物，即可在任意位置进行设计。例如在一次性地检 测外显子1、2中含有的多个变异位置时，可以用外显子1上游的正向引物和外显子2下游的 反向引物进行核酸扩增，检测其扩增产物。此外，在一次性检测多个区域时，可以使用多个 引物对。此时，优选在条件设定阶段预先对在扩增阶段是否没有生成非特异性的核酸片段 进行确认。一旦确定了条件，则可以在该条件下以良好的再现性进行检测。
[0141] 作为探针的寡核苷酸的碱基序列按照含有在扩增产物序列（引物组所夹的区域） 的内部的方式，来确定探针序列。探针通常设定为15~35核苷酸左右的长度，对于1个所检 测的变异区域，通常需要1组(野生型检测用探针和变异型检测用探针这2种)或更多（1组以 上）的探针。
[0142] 为了使后续的检测更容易，对于使用的引物组，可以预先用荧光物质（Cy3、Cy5 等）、生物素等预先标记其末端。标记方法没有特别限定，只要在扩增反应中观察不到显著 抑制反应等现象，即可用任意方法进行。反应后，还可以通过进一步与酶复合体、例如链霉 亲和素碱性磷酸酶结合物反应、加入底物从而显色。
[0143] <扩增反应>
[0144] 以上述作为核酸扩增模板的核酸(待测物)为模板，在β球蛋白基因的变异位置通 过核酸扩增反应扩增欲检测的区域的核酸片段。作为核酸扩增方法，可以使用PCR法、LAMP 法、ICAN法、TRC法、NASBA法、PALSAR法等各种方法。只要是对核酸的检测上不产生特殊的问 题就可以将任意方法用于核酸扩增反应，这些中，从简便性的观点出发，优选PCR法。
[0145] 就核酸扩增反应中使用的温度控制装置而言，可以使用市售的热循环仪。可以使 用例如GeneAmp 9600、GeneAmp 9700(生命技术日本（life techonlogies japan)公司）、T Professional系列（biometra公司）等，只要热传导性、盖子形状不产生问题则可以使用任 意型号的热循环仪。
[0146] <扩增反应中使用的核苷酸单体>
[0147] 核苷酸单体可以列举通常的扩增反应中使用的脱氧核糖核苷三磷酸等。其与引物 组同样地，也可以使用使后续的检测容易进行的衍生物，优选使用不影响扩增反应的物质。
[0148] <扩增反应中使用的DNA延伸酶、及其它>
[0149]就DNA延伸酶而言，可以与通常的PCR法中使用的酶同样地，使用来自于耐热性细 菌的DNA聚合酶、即TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶等。
[0150] 作为能够使用的酶、试剂盒，可以列举Hot StarTaq DNA Polymerase(QIAGEN公司 制）、PrimeStarMax DNA聚合酶（宝生物公司）、SpeedSTAR HS DNA聚合酶（宝生物公司）、 KOD-Plus-Neo(东洋纺公司）、KAPA2G FastHotStartPCR试剂盒（日本遗传学公司（Nippon Genetics Co,Ltd))、AmpDirect试剂盒（岛津制作所)等，此外，若为能够直接利用血液(体 液等)进行核酸扩增反应则操作变得简便，是更优选的。
[0151] 作为将上述构成要素混合的方法，只要是酶不失活、液体不会起泡而从管漏出的 混合方式就可以为任意混合方式。通常可以将上述所有的构成成分分注到〇.2mL左右的尺 寸的PCR用管，用涡旋混合器混合后，为了使沾在盖子上的溶液落下来而轻轻地离心（低转 速）。此外，在进行热启动PCR的情况下，混合时，在酶不失活的条件下进行混合。
[0152] 然后，（b)将上述(a)中获得的反应液供于核酸扩增反应即可。
[0153] 就核酸扩增反应而言，在例如通过PCR反应进行扩增时，可以在90 °C~98 °C下进行 5分钟左右、使作为模板的核酸解离的酶活化后，重复进行25~50个下述循环:94°C 30秒(核 酸的解离）、60°C30秒（引物的退火）、72°C30秒(来自引物的延伸反应)左右，使核酸进行指 数函数性地扩增。此外，在进行非PCR反应的等温条件下的核酸扩增反应时，可以在40°C~ 65°C左右的一定温度下进行温育，从而获得扩增的核酸。
[0154] (c)然后通过使(b)中获得的核酸片段与本发明的微阵列接触，从而可以检测待测 物中的目的核酸。
[0155] 工序(c)中，可以不对核酸扩增反应液进行精制而直接加入杂交溶液、与微阵列接 触。杂交溶液是指能够使扩增核酸与固定化于微阵列的探针进行杂交反应的溶液。
[0156] 更详细而言，为在Tris/HCl buffer等缓冲溶液中混合有NaCl溶液、MgCl2溶液等 盐的溶液、SSC溶液、混合SDS/T Ween20等表面活性剂的溶液。在与本发明中使用的探针进行 反应时，优选使用SDS等、在冷却时不析出表面活性剂的晶体的TNT buffer (Tris/HCl buffer溶液、NaCl溶液、Tween溶液的混合溶液）。
[0157] Tris/HCl或NaCl的浓度以终浓度计分别优选为0.06Μ~0.48Μ，更优选0.12Μ~ OJAMJween可以设为以终浓度计为0.01~0.2质量％、优选为0.02~0.15质量％、更优选 为0.03~0.12质量％。
[0158] 此外，接触时的温度优选为45~65°C，更优选为50~55°C，进而优选为45~70°C， 进一步优选为50~65°C。接触的时间只要发生杂交反应、能够检测变异即可，就没有限定， 为了抑制非特异性反应，时间越短越好。例如，接触时间可以设为15分钟~4小时、优选为20 分钟~3小时、更优选为30分钟~2小时。
[0159] <核酸(扩增产物)的检测>
[0160] 检测通过上述工序(c)而被微阵列中的探针捕捉的核酸。
[0161] 作为检测方法，只要能够检测被捕捉的核酸就没有限定，可以使用公知的方法。可 以使用例如使用荧光物质、发光物质作为标记底物而进行显色测定、荧光强度测定的方法、 目视检测的方法等。
[0162] 更详细而言，可以使用氟影像分析仪、CCD相机等确定有无被捕捉的核酸及对其进 行定量。也可以使用近年来使用日渐增多的PCR反应即时定量装置等经时监测荧光量，从而 以更高可靠性进行核酸定量。
[0163] 进而，还可以使用利用或不利用酶反应的显色试剂等进行显色。这样的方法可以 通过目视直接观察或者通过光学扫描仪进行扫描。
[0164] 本发明的核酸检测方法可以列举对序列表中公开的β球蛋白基因的30个位置的变 异的解析的应用，进而也可以通过设计、使用适当的探针来制作对本发明公开的变异位置 以外的位置进行检测的试剂盒。
[0165] (4)试剂盒
[0166] 本发明中，还可以将引物组及具有本发明的探针组的微阵列作为用于检测β球蛋 白基因的变异的试剂盒而使用。作为引物组，可以更优选使用序列号21所示的寡核苷酸引 物和序列号22所示的寡核苷酸引物的组、或序列号23所示的寡核苷酸引物和序列号24所示 的寡核苷酸引物的组。
[0167] 4.微阵列?探针的评价方法
[0168] 如前所述，通过微阵列进行多态性检测时，优选所使用的探针不发生非特异性杂 交。即，不发生非特异性杂交的探针评价为性能好的探针。
[0169] 因此，本发明作为定量评价探针性能的方法、提供以下的方法。
[0170] 微阵列?探针的评价方法，含有以下工序。
[0171] (1)在含有表示第1多态性检测用探针杂交而获得的信号强度的Υ轴和表示第2多 态性检测用探针杂交而获得的信号强度的X轴的荧光坐标系中，标绘将第1多态性用对照核 酸与含有第1及第2多态性检测用探针的多态性检测用探针对进行杂交而获得的荧光坐标 的工序；
[0172] (2)将反比于通过前述Υ轴和X轴的交点0与前述工序（1)中标绘的荧光坐标的直线 的倾角的值设为校正值C的工序；
[0173] (3)对多个多态性检测用探针对进行工序（1)及(2)，在各探针间比较校正值C，将 校正值C为最小的探针对确定为适合于第1多态性检测的探针的工序。
[0174] 本发明中，第1多态性和第2多态性为同一多态性中的不同的等位基因。即，第1多 态性为第1等位基因，第2多态性为与前述第1等位基因对应的第2等位基因。
[0175] 以下说明各工序的概要。
[0176] 工序(1):标绘工序
[0177] 首先，工序（1)中，在荧光坐标系中标绘第1多态性用对照核酸与含有第1及第2多 态性检测用探针的多态性检测用探针对进行杂交而获得的信号强度。本发明的荧光坐标系 中，Υ轴表示第1多态性检测用探针杂交而获得的信号强度，X轴表示第2多态性检测用探针 杂交而获得的信号强度。这里，Υ轴和X轴的交点设为〇。此外，Υ轴和X轴可以正交也可以不正 交。
[0178] 通过前述标绘，获得表示第1多态性检测用探针的荧光特性的荧光坐标P(X1、yi)。
[0179] 不发生非特异性杂交的理想的探针的荧光坐标PSX1 = 0、yi>0(图1:框A)。
[0180] 但是，实际上大多数探针会发生某种程度的非特异性杂交。因此，大多数探针的荧 光坐标P为χι>〇且yi>〇(图1:框B)。
[0181 ]杂交是在杂交溶液中进行的。杂交溶液为能够使对照核酸和探针发生杂交反应的 溶液，更具体而言，有在Tris/HCl buffer等缓冲溶液中混合NaCl溶液、MgCl2溶液等盐的溶 液、SSC溶液、混合SDS、T Ween20等表面活性剂的溶液。通常进行反应时，优选使用SDS等在冷 却时不析出表面活性剂的晶体的TNT buffer(Tri s/HC 1 buffer溶液、NaC 1溶液、Tween溶液 的混合溶液）。此外，其终浓度优选为0.06M~0.48M，终浓度更优选为0.12M~0.24M。此外， 接触时的温度优选为45°C~70°C，更优选为50°C~65°C。接触时间优选为在能够发生杂交 反应、进行检测的范围内尽量短。通常为15分钟~4小时、优选为20分钟~3小时、更优选为 30分钟~2小时。
[0182] 信号是将前述杂交的结果、被探针捕捉的对照核酸的量进行数值化而得的。通常， 通过使荧光物质、发光物质与探针杂交的核酸试样结合、测定由探针区域所发出的荧光、显 色的强度，从而可以获得信号。具体而言，信号可以使用氟影像分析仪、CCD相机等获得。
[0183] 与探针"对应的"信号是指信号内可能含有来自于背景的信号，"来自于"探针的信 号是指探针本来的特异性所带来的信号。
[0184]工序(2):校正值的确定
[0185] 然后，求出通过标绘的荧光坐标P和交点0的直线L，将反比于该直线L的倾角的值 设为校正值C(C>0)即可。
[0186] 作为具体例子，校正值C可以是反比于直线L和X轴所成的弧度角度a(〇gag3i/2) 的值（图1:框C)。即，在将荧光坐标P校正成存在于Y轴上的情况下，角度a需要扩大为(V2) + a倍(图1:框D)，基于该扩大度，可以设定校正值C=(V2)+a(C31)。
[0187] 工序(3):探针对的比较
[0188] 通常，为了检测1个多态性而准备多个候补探针。因此，需要对多个候补探针进行 上述工序（1)及(2)，确定各探针的校正值C。
[0189] 通过对这样获得的校正值C进行比较，可以对候补探针的性能进行比较评价（图1: 框E)。
[0190] 如前所述，理想的探针的荧光坐标P存在于Y轴上，因此，即为a = Ji/2。由此，理想的 探针的校正值C= (V2) + (V2) = 1。
[0191] 另一方面，为发生某种程度的非特异性杂交的探针时，由于a<V2,因此校正值C >1。例如，a = Ji/4时，校正值C = 2，a = jr/6时，校正值C = 3。
[0192] 因此，本发明的方法中，校正值C的值越小，该探针被判断为性能越好。即、将校正 值C为最小的探针（即角度a最大)确定为适合于第1多态性检测的探针。例如，图1的框E的例 子中，将探针对No.3确定为适合于第1多态性检测的探针。
[0193] 以上所述的工序中，也可以施加各种改变。
[0194] 例如，工序（1)中，可以重复进行2次以上对照核酸和探针的杂交而获得2个点以上 的荧光坐标（图2:框A，此时为3个点的荧光坐标）。此时，可以求出所获得的2个点以上的荧 光坐标的代表值Μ，工序(2)中的直线L可以为通过交点0和代表值Μ的中央直线（图2:框B)。 这里，代表值是指代表多个值的值。例如，可以举出平均值、中值或加权平均值等，从对于异 常值的稳健性的观点出发优选中值。
[0195] 进而，工序（1)中，在通过交点0和荧光坐标的各直线中（荧光坐标存在2个点以上， 所以直线也存在2条以上），选择与前述中央直线的倾角有差异的直线，可以将其设为误差 线(在倾角之差选择最大的直线时，设为第1误差线）（图2:框Β)。
[0196] 在设定第1误差线时，工序(2)包括：
[0197] (a)求出前述中央直线和X轴之间的角度a(弧度），
[0198] 求出校正值C = V2 + a的处理（图2:框C);
[0199] (b)将前述中央直线和误差线(在倾角之差选择最大的直线时，设为第1误差线)所 成的角度设为误差角Θ(弧度），
[0200] 进而，进行确定校正误差角Θ'（弧度）=θ(弧度）x校正值c的处理。
[0201] 误差角也可以根据需要设为上述值的常数倍。此外，作为具有差异的直线，可以将 差异最大的直线设为第1误差线，也可以设定由与多条具有差异的直线的角度差加上了置 十目区间的误差角范围。
[0202]此外，还可以使用第2多态性用对照核酸，对第2多态性检测用探针进行相当于上 述工序(1)~(3)的工序(4)~(6)。
[0203]具体而言，工序(4)~(6)如下所述。
[0204] (4)标绘第2多态性用对照核酸与含有第1及第2多态性检测用探针的多态性检测 用探针对杂交而获得的荧光坐标的工序；
[0205] (5)将正比于通过前述交点0和工序(4)中标绘的荧光坐标的直线的倾角的值设为 校正值&的工序；
[0206] (6)对多个多态性检测用探针对进行工序(4)及(5)，在各探针间比较校正值(：2，将 校正值C2为最小的探针对确定为适合于第2多态性检测的探针的工序。
[0207] 工序(4):标绘工序
[0208] 工序(4)中，在荧光坐标系中标绘第2多态性用对照核酸与含有第1及第2多态性检 测用探针的多态性检测用探针对杂交而获得的信号强度。
[0209] 通过前述标绘，获得表示第2多态性检测用探针的荧光特性的荧光坐标P2(X2、y2) (图3:框A)〇
[0210] 工序（5):校正值的确定
[0211] 然后，求出通过所标绘的荧光坐#P2和交点〇的直线L2,将正比于该直线1^2的倾角 的值设为校正值c2(c2>0)即可。
[0212] 作为具体例子，校正值(：2可以为反比于直线L#PY轴所成的弧度角度β(05β5π/2) (即，正比于1^ 2的倾角(π/2-β))的值（图3:框Β)。在将荧光坐标Ρ2校正成存在于X轴上时，角度 β需要扩大为(V2)+i3倍(图3:框C)，基于该扩大度，可以设定校正值C2=(3i/2)+i3(C23 1)。
[0213] 工序(6):探针对的比较
[0214] 与上述工序(3)同样地，需要对多个候补探针对进行上述工序(4)及(5)，确定各探 针的校正值C2。
[0215] 通过对这样获得的校正值(：2进行比较，可以对候补探针的性能进行比较评价（图 3:框0)〇
[0216] 如前所述，就理想的探针对而言，由于荧光坐#P2存在于X轴上，因此β = π/2。由 此，理想的探针的校正值C2 = ( jt/2 ) + (Ji/2) = 1。
[0217] 另一方面，为发生某种程度的非特异性杂交的探针时，β< V2，因此校正值C2> 1。 例如，β = π/4时，校正值C2 = 2，0 = jt/6时，校正值C2 = 3。
[0218]因此，校正值(：2的值越小，该探针被判断为性能越好。即、将校正值C2为最小的探针 确定为适合于第2多态性检测的探针。例如，图3框D的例子中，将探针对No.4'确定为适合于 第2多态性检测的探针。
[0219] 以上所述的工序中，也可以施加各种改变。
[0220] 例如，工序(4)中，可以重复进行2次以上对照核酸和探针的杂交而获得2个点以上 的荧光坐标（图4:框A，此时为3个点的荧光坐标）。此时，可以求出所获得的2个点以上的荧 光坐标的代表值跑，工序(2)中的直线。可以为通过交点0和代表值跑的第2中央直线（图4: 框B)。
[0221] 这里，代表值是指代表多个值的值。例如，可以举出平均值、中值或加权平均值等， 从对于异常值的稳健性的观点出发优选中值。
[0222] 进而，工序(4)中，可以在通过交点0和荧光坐标的各直线中（由于荧光坐标存在2 个点以上，所以直线也存在2条以上），选择与前述第2中央直线的倾角有差异的直线，将其 设为误差线(在倾角之差选择最大的直线时，设为第2误差线）（图4:框B)。
[0223] 在设定2误差线时，工序(2)包括：
[0224] (a)求出前述第2中央直线和Y轴之间的角度β(弧度），求出校正值C2 = V2 +邱勺处 理；
[0225] (b)将前述第2中央直线和误差线（在倾角之差选择最大的直线时，设为第2误差 线)所成的角度设为误差角θ 2(弧度），
[0226]进而，进行确定校正误差角θ2'（弧度）= θ2(弧度）Χ校正值(：2的处理。
[0227] 误差角也可以根据需要设为上述值的常数倍。此外，作为具有差异的直线，可以将 差异最大的直线设为第2误差线，也可以设定由与多条具有差异的直线的角度差加上了置 十目区间的误差角范围。
[0228] 此外，本发明提供表示通过上述方法评价的探针的校正值C(或C2)的方法，以评价 探针的性能。进而，还提供表示使用校正值C(或C 2)校正后的坐标和校正的误差范围的方 法。
[0229] 本发明的评价方法可以容易地比较各探针间的性能，此外，还能够考虑误差范围 的基础上对基因型进行判定。
[0230] 以下通过实施例更具体地说明本发明，列举这些实施例是以例示本发明为目的， 对本发明没有限定作用。
[0231 ]实施例
[0232] [实施例1]
[0233] 研究了使用DNA微阵列一次性检测β球蛋白基因的25个位置的变异。检测对象的变 异的位置示于以下的表1。
[0234][表1]β球蛋白的变异位置
[0236] 其中，检测变异(：.52六>1'、(3.84_85丨118(：、(3.3646>(：、(3.3801'>6的探针由于在周 围碱基序列的特征上探针设计的难度高，因此先进行研究。
[0237] 1.通孔型DNA微阵列的制作
[0238] 如下所述地制作DNA微阵列。
[0239] <1-1.探针的调制>
[0240] 合成了作为探针的序列号1~18所述的寡核苷酸。
[0241] 合成的是在寡核苷酸的5'末端导入有氨己基的寡核苷酸。合成后使该寡核苷酸与 甲基丙烯酸酐反应，再用HPLC精制，分取，从而获得了具有表2的序列号1~18所示的碱基序 列的5'末端乙烯基化寡核苷酸。作为序列的特征，序列号1，2为受到接近变异c.52A>T的变 异c.59A>T的变异影响的探针，序列号3,4中导入了肌苷，作为与接近变异c.52A>T的变异 c.59A>T的变异杂交的通用碱基。
[0242] 同样，序列号5，6为受到接近变异c. 84_85insC的变异c. 79G>A的变异影响的探 针，序列号7，8中导入了肌苷，作为与接近变异c. 84_85insC的变异c. 79G>A的变异杂交的 通用喊基。
[0243] 此外，序列号11，12的用于检测变异的不同的碱基的位置位于距探针的3末端6碱 基的位置，序列号17、18在两末端导入了 "AA"。
[0244] [表2]探针序列候补

[0247] 序列号1~18所述的寡核苷酸可以与人β球蛋白基因序列的一部分杂交。
[0248] <1-2.0嫩微阵列>
[0249] 本实施例中，使用表1所述的探针(序列号1~18)、以及对于未搭载探针的位置使 用水代替核酸探针的核酸微阵列（(Geno Pearl:注册商标）、三菱丽阳株式会社）。
[0250] 2.班求蛋白基因的变异检测用探针的评价
[0251] <2-1.质粒模板DNA的制作>
[0252] NCBI Reference Sequence:NC_000011.9(序列长 135006516碱基）的第5246730 碱基到第5248465碱基的互补链序列编码β球蛋白基因序列。将其序列示于序列号19。此外， 通过与序列号20所ζκ的ΝΜ 000518.4 | Homo sapiens hemoglobin，beta(HBB)，mRNA的序列 进行比较，确定了基因组DNA序列中的外显子区域。（蛋白质编码区：第51碱基~第494碱基， 外显子1:第1碱基~第142碱基、外显子2:第143碱基~第365碱基、外显子3:第366碱基~第 626碱基）
[0253] 序列号19中斜体所示的序列位置为序列号21~24的引物序列的位置、下划线所示 的序列为外显子区域、四边形包围的区域为UTR区域。
[0254]作为β球蛋白基因的野生型模板，准备并合成了含有序列号19所示的序列的质粒 (使用株式会社BEX公司的人工基因合成服务，插入至pUC57载体），浓度调整至1 Ong/μ 1。 [0255] 此外，与上述同样地分别准备了在按照前述表1所示的HGVS nomenclature的变异 表记的位置引入了变异的质粒DNA (2 5种），这些也将浓度调整至1 Ong/μ 1。
[0256]引物对 < 序列号 21、22、23、24>
[0261]〈序列号 19>
[0262] >gi | 224589802: C5248465-5246730人染色体11，GRCh37 · p5
[0263] 候选组合
[0268] 〈PCR 反应〉
[0269] 将野生型的质粒DNA和表1所述的编号10、13、21、23(含有变异(^524>1\(^84_ 85&8(：、(3.3646>(：、(3.3801'>6)的变异型质粒0嫩4种、共5种作为模板，
[0270] 使用序列号21~24的2组引物对进行PCR反应。PCR反应使用了KOD FX Neo试剂盒 (东洋纺公司）。
[0271 ] 〈PCR反应液组成〉
[0273] PCR反应使用GeneAmp9700热循环仪，在Max模式下反应。温度条件如下所示。
[0274] 〈PCR反应温度条件〉
[0275] 95°C10 分钟
[0276] (94°C30秒、68°C30秒、72°C30秒）X35循环
[0277] 4°C反应结束
[0278] 在反应后的反应液100μΙ中加入以下缓冲溶液至200μ1。
[0280] 然后，将该溶液200μ1放入专用室中（记载于http ://www.mrc · CO · jp/genome/ about/usage. html)，接着加入DNA微阵列，盖上盖子，55°C下温育2小时。
[0281] 温育后，将芯片分别在0.24M TNT buffer 10ml中于55°C浸渍20分钟。之后，接着 在0.24M TN buffer 10ml中于55°C浸渍10分钟，实施洗涤。洗涤后实施检测。
[0282] 检测使用了冷却CCD相机方式的DNA微阵列自动检测装置。从孔上部以曝光时间4 秒钟拍摄DNA微阵列，检测各斑点中的cy5的荧光信号。将微阵列上未搭载探针的斑点设为 空白斑点，将其荧光强度的中值设为背景值。将全部斑点的由荧光强度减去背景值而得的 值作为各探针的信号。
[0283] 将野生型的序列作为第1多态性、将变异型的序列作为第2多态性、将第1多态性用 对照核酸作为野生型质粒，进行多次实验，结果示于表3。此外，图5示出将表3的结果标绘在 如下的荧光坐标系的结果，所述荧光坐标系含有表示第1多态性检测用探针杂交而获得的 信号强度的Y轴和表示第2多态性检测用探针杂交而获得的信号强度的X轴且X-Y轴正交(图 5为在表示第1、第2多态性检测用探针的信号强度的荧光坐标系中，标绘使第1对照核酸进 行多次杂交的结果、进一步获得的代表性直线的图）。
[0284] 图5的虚线为连接各探针对候补的多次(2次或3次)实验结果的平均信号强度和原 点的直线(设为代表性直线），图中的数学式表示这些直线的式子。
[0285] 关于探针的选择，将反比于代表性直线的倾角的值设为校正值C，对多个多态性检 测用探针对进行比较，选择校正值C为最小的探针。本研究中，校正值C通过31/2 +代表性直 线和X轴所成的角度(弧度)来算出。关于各探针对中性能好的探针对：
[0286] 作为检测c.52A>T的变异的探针，对序列号1，2的对和序列号3,4的对，从探针候 补中可以选择序列号3、4的对；
[0287] 作为检测c . 84_85insC的变异的探针，对序列号5，6的对和序列号7，8的对，从探 针候补中可以选择序列号7、8的对；
[0288] 作为检测c.364G>C的变异的探针，对序列号9,10的对和序列号11，12的对，从探 针候补中可以选择序列号11、12的对；
[0289] 作为检测c.380T>G的变异的探针，对序列号13,14的对、序列号15,16的对、序列 号17,18的对，从探针候补中可以选择序列号17、18的对。
[0290] [表3]使用野生型质粒(第1多态性用对照核酸)进行多次实验的结果
[0292] 表3所示的探针序列中，单下划线的碱基为检测对象的多态性，双下划线的碱基为 进行了本发明的修饰(置换为肌苷或插入腺嘌呤)的碱基。
[0293] 同样地，将野生型的序列作为第1多态性、将变异型的序列作为第2多态性、将第2 多态性用对照核酸作为变异型质粒，进行多次实验，结果示于表4。此外，图6示出将表3和表 4的结果标绘在如下荧光坐标系的结果，所述荧光坐标系含有表示第1多态性检测用探针杂 交而获得的信号强度的Y轴和表示第2多态性检测用探针杂交而获得的信号强度的X轴且x-Υ轴正交（图6为示出在图5的基础上标绘有第2对照核酸进行多次杂交的结果、进一步获得 的代表性直线的图）。
[0294][表4]使用变异型质粒(第2多态性用对照核酸)进行多次实验的结果
[0296]表4所示的探针序列中，单下划线的碱基为检测对象的多态性，双下划线的碱基为 进行了本发明的修饰(置换为肌苷或插入腺嘌呤)的碱基。
[0297]图6的图表中含有"使第2多态性用对照核酸杂交"的系列为变异型的质粒杂交的 结果。虚线或实线为将各个探针对候补的多次(2次或3次)实验结果的平均信号强度和原点 连接而成的代表性直线。
[0298]关于这些探针的选择，将正比于代表性直线的倾角的值设为校正值C2,对多个多 态性检测用探针对进行比较，选择校正值C2最小的适合于第2(变异型）多态性检测的探针 对。
[0299] 本研究中，校正值C2通过jt/2+(V2-代表性直线和X轴所成的角度(弧度））来算 出。关于各探针对中性能好的探针对：
[0300] 作为检测c.52A>T的变异的探针，对序列号1，2的对和序列号3,4的对，从探针候 补中可以选择序列号3、4的对；
[0301] 作为检测c . 84_85insC的变异的探针，对序列号5，6的对和序列号7，8的对，从探 针候补中可以选择序列号7、8的对；
[0302] 作为检测c.364G>C的变异的探针，对序列号9,10的对和序列号11，12的对，从探 针候补中可以选择序列号11、12的对；
[0303] 作为检测c.380T>G的变异的探针，对序列号13,14的对、序列号15,16的对、序列 号17,18的对，从探针候补中可以选择序列号17、18的对。
[0304] 在图7中示出以上所示的校正值C、C2的图表。
[0305] 在探针评价之后，如以下的表5所示那样，设定在基因型判定时有用的误差范围。 由将第1对照核酸或第2对照核酸重复2次以上而获得的信号强度算出平均值，作为该探针 对所提供的代表坐标。此外，将通过代表坐标和原点的直线作为代表性直线，将X轴和代表 性直线的角度作为代表坐标角度，算出连接各数据和原点的直线和代表性直线的角度(弧 度单位），将最大的角度设为误差角度。此外，图8示出使用校正值C、C2、误差角度进行校正 之前、之后的探针性能数据。
[0306][表5]本发明的校正方法的具体例示
[0308] [实施例2]
[0309] 为了使用DNA微阵列一次性检测β球蛋白基因的25个位置的变异，制作了搭载有序 列号3、4、7、8、11、12、17、18和序列号25~66所示的探针的阵列。
[0310] 作为检测对象的变异位置为与实施例1的表1相同，也与实施例1同样地制作DNA微 阵列。
[0311] <PCR 反应〉
[0312]以表1所述序号1~25的变异型质粒DNA为模板，使用序列号21~24的2组引物对进 行PCR反应。PCR反应使用Ampdirect Plus试剂盒(岛津制作所）。
[0313] <PCR反应液组成>
[0315] PCR反应使用GeneAmp9700热循环仪，在Max模式下反应。温度条件如下所示。
[0316] <PCR反应温度条件〉
[0317] 95°C10 分钟
[0318] (94°C30秒、68°C30秒、72°C30秒）X35循环 [0319] 4°C反应结束
[0320] 在反应后的反应液100μΙ中加入以下缓冲溶液至200μ1。
[0322] 然后，将该溶液200μ1放入专用室中（记载于http ://www.mrc · co · jp/genome/ about/usage. html)，接着加入DNA微阵列，盖上盖子，55°C下温育2小时。
[0323] 温育后，将芯片分别在0.24M TNT buffer 10ml中于55°C浸渍20分钟。之后，接着 在0.24M TN buffer 10ml中于55°C浸渍10分钟，实施洗涤。洗涤后实施检测。
[0324] 检测使用了冷却CCD相机方式的DNA微阵列自动检测装置。从孔上部以曝光时间4 秒钟拍摄DNA微阵列，检测各斑点中的cy5的荧光信号。将微阵列上未搭载探针的斑点设为 空白斑点，将其荧光强度的中值设为背景值。将全部斑点的由荧光强度减去背景值而得的 值作为各探针的信号。
[0325] 结果示于表6。
[0326] [表6]使用25种变异质粒的检测结果:信号值
[0328]之后，对每个探针对算出来自于野生型探针的信号/来自于变异型探针的信号，然 后换算为弧度单位(表7左侧）。之后，在25次杂交的数据中，算出野生型的24个数据的中值 (弧度)和标准偏差(弧度）。通过计算+野生型的中值，且计算π/2 + (ν2-变异型）而获 得校正值C，从而算出校正值C2 (表7右侧）。
[0329] 之后，通过用野生型的24个数据的标准偏差乘以校正值C、或校正值C2作为误差范 围，算出校正后的误差范围（表7右端）。
[0330] 将误差范围的上端或下端作为基因型的判定范围，将校正之前、之后的数据示于 图9(图9由来自于质粒的25种样品获得的数据的校正前、校正后）。
[0331][表7]由来自于质粒的25种样品获得的数据和校正值、标准偏差
[0333]除了本研究外，另外购入ECACC Ethnic Diversity DNA Panels(EDP_l) (sigma公 司产品目录号:07020701)，通过测序对1个样品进行碱基序列解析，其结果获知变异位置12 为杂合型样品。因此，之后使用该样品通过与实施例2所示的方法同样的方法获取DNA芯片 的数据，结果获得了表8的信号强度。
[0334] 之后，关于表8的信号强度，在对于各探针对算出（来自于野生型探针的信号)/(来 自于变异型探针的信号）后换算为弧度单位，再乘以表7中的校正值C。结果如表9所示。此 外，将表9的数据叠加在图9的校正后的图表中（图10:在图9的校正后的图表中叠加表9的数 据的结果），结果仅12号变异位置标绘于显示野生型的误差棒和变异型的误差棒之间，可以 判断为杂合型。
[0335] [表8]来自于变异位置12为杂合型的样品的DNA芯片信号值


[0339] 产业上的利用可能性
[0340] 根据本发明，提供一种高品质的探针、具备该探针的微阵列及探针的评价方法。
[0341] 序列号1~18:探针
[0342] 序列号21~24:引物
[0343] 序列号25~66:探针
[0344] 序列表
【主权项】
1. 一种探针，其特征在于，其为用于检测具有1个以上多态性的多核苷酸序列的探针， 与该序列杂交，与检测目的的多态性对应的碱基部分位于自所述探针的任一末端起6个以 下的位置且所述探针的两端分别含有1个以上的与所述序列不互补的碱基。2. 根据权利要求1所述的探针，其特征在于，对在所述序列中含有的多个多态性中的非 检测目的的多态性，与其对应的所述探针的部分为通用碱基。3. -种探针，其特征在于，与具有1个以上多态性的多核苷酸序列杂交，与检测目的的 多态性对应的碱基部分位于自所述探针的任一末端起6个以下的位置，并且，所述探针的两 端分别含有1个以上的与所述序列不互补的碱基，其中在该序列中鸟嘌呤及胞嘧啶的含量 合计为63%以上。4. 根据权利要求3所述的探针，其特征在于，对在所述序列中含有的多个多态性中的非 检测目的的多态性，与其对应的所述探针的部分为通用碱基。5. -种探针，其特征在于，与具有1个以上多态性的多核苷酸序列杂交，其中该序列中 鸟嘌呤及胞嘧啶的含量合计为45%以下，与检测目的的多态性对应的碱基部分位于自探针 的任一末端起6个以下的位置，并且，所述探针的两端分别含有1个以上的与所述序列不互 补的碱基。6. 根据权利要求1~5中的任一项所述的探针，具有1个以上多态性的多核苷酸序列为 人β球蛋白基因序列。7. 根据权利要求3所述的探针，鸟嘌呤及胞嘧啶的含量合计为63%以上的、具有1个以 上多态性的多核苷酸序列具有序列号3、4、7或8所述的序列。
【文档编号】C12Q1/68GK105969848SQ201610306087
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2013年3月28日
【发明人】外川直之
【申请人】三菱丽阳株式会社