一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒及其检测方法。所述包括用于检测的基因芯片和检测体系，其中，所述基因芯片包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述工作电极上标记有捕获探针；所述检测体系包括相互独立的DNA提取液、PCR扩增反应液、PCR产物酶液、杂交液、检测液、空白对照、阳性质控品和阴性质控品。
【专利说明】
一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒 及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 尿路感染又称泌尿系感染，是病原微生物引起的肾脏、输尿管、膀胱和尿道等泌尿 系统各个部位感染的总称。尿路感染是常见的感染性疾病，全世界每年发生尿路感染近1.5 亿人次，40 %~50 %女性一生中发生过尿路感染。在我国发生的院内感染中9.4 %~50 %来 自尿路感染。严重的尿路感染，如复杂性尿路感染和肾盂肾炎易引起脓毒症，甚至引起感染 性休克。
[0003] 目前我国临床检测方法仍以尿培养为主，但由于其送检周期长，各医院实验室水 平、能力不足、检测结果和临床一致性不高等缺陷，导致临床医生的送检意识较为淡薄，很 多情况下的诊疗多停留在经验用药的层面上，而非基于病原诊断的基础上，此种用药模式 一定程度上导致了抗菌药物的不合理使用，导致了细菌变异事态愈发严峻，继而对抗菌药 物耐药的菌株大幅增加和散播。据统计，亚太地区2012年社区获得性单纯性尿路感染对喹 诺酮类药物耐药性最高可达69%，复杂性尿路感染高达98% ; 2011年我国12家医院多中心 调查发现来自尿液的大肠埃希菌对喹诺酮和第三代头孢菌素的耐药率分别为49.4%和 57.5%。
[0004] 快速的临床微生物诊断方法可对感染性疾病做出快速、准确的病原学诊断确诊依 据，为临床医生提供治疗、预防建议和咨询服务；同时可检测和预警感染的爆发，确定爆发 的来源并及时控制其播散、提供药敏检测数据，为临床经验用药提供指导。因此，亟待开发 一种能够快速、准确做出病原学诊断的检测手段。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，旨在解决现 有尿路感染致病菌的检测存在的上述一些列问题。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种检测尿路感染致病菌的方法。
[0007] 本发明是这样实现的，一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，包括用于检 测的基因芯片和检测体系，其中，所述基因芯片包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述 工作电极上标记有捕获探针；所述检测体系包括相互独立的DNA提取液、PCR扩增反应液、 PCR产物酶液、杂交液、检测液、空白对照、阳性质控品和阴性质控品。
[0008] 以及，一种检测尿路感染致病菌的方法，采用上述检测尿路感染致病菌的基因芯 片试剂盒进行检测，检测方法包括以下步骤：
[0009] 提供待检离体尿液样品，采用所述DNA提取液进行提取，获得样本DNA;
[0010]将所述样本DNA加入PCR反应液中，进行PCR扩增获得扩增产物，同时设置平行的阴 性对照、阳性对照和空白对照；
[0011] 将所述扩增产物加入PCR产物酶中进行酶解；
[0012] 将所述杂交液加入到酶解后的所述PCR产物中混合处理得到混合液，将所述混合 液滴加到基因芯片工作电极上进行孵育；
[0013] 检测所述基因芯片的电极信号。
[0014] 本发明提供的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，可同时适用于尿液样品中 大肠埃希菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、屎肠球菌、奇异变形杆 菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、咽峡炎链球菌、溶血葡萄球菌、摩氏摩根菌、金黄色葡萄 球菌、阴沟肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、鲁氏不动杆菌、粘质沙雷菌、产气肠杆菌、恶臭假单胞 菌、弗氏柠檬酸杆菌的快速检测，且准确性高，对于检测和预警感染的爆发，确定爆发的来 源并及时控制其播散、提供药敏检测数据，为临床经验用药具有积极的指导意义。此外，本 发明提供的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，检测灵敏度高，特异性好，可用于实现 尿路感染致病菌的高通量快速诊断。
[0015] 本发明提供的检测尿路感染致病菌的方法，通过一对16s rRNA基因的通用寡核苷 酸的特异性引物进行定性PCR扩增，获得多重16s rRNA基因的扩增产物;通过固定在工作电 极表面的特异性捕获探针来捕获PCR多重扩增产物;特异性捕获探针与PCR产物特异性结 合，再与其各自的特异性信号探针结合，进而通过电化学交流伏安法(ACV)的检测产生电流 变化，通过比较电流值，从而达到快速检测靶多核苷酸的目的，进而推断尿样中致病微生物 的种类，为临床用药提供指导。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明实施例提供的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒的基因芯片阵 列不意图；
[0017] 图2是本发明实施例提供的基因芯片杂交的空白对照检测结果图；
[0018] 图3是本发明实施例提供的基因芯片杂交的阳性样本检测结果图；
[0019] 图4是本发明实施例提供的基因芯片杂交的阴性质控品检测结果图；
[0020] 图5是本发明实施例提供的基因芯片杂交的阳性质控品检测结果图。
【具体实施方式】
[0021] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合 实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释 本发明，并不用于限定本发明。
[0022] 本发明实施例提供了一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，包括用于检测 的基因芯片和检测体系，其中，所述基因芯片包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述工 作电极上标记有捕获探针;所述检测体系包括相互独立的DNA提取液、PCR扩增反应液、PCR 产物酶液、杂交液、检测液、空白对照、阳性质控品和阴性质控品。
[0023] 本发明实施例中，所述基因芯片是检测试剂盒的关键组成部分，用于捕获经过PCR 扩增、酶解并标记有信号标记物的待测基因液中的特异性基因，进而通过检测杂交后基因 芯片的电化学信号、判别待测样品中是否含有对应的尿路感染致病菌。具体的，结合附图1， 所述基因芯片包括固相载体和固定在所述固相载体上的电极，所述电极包括工作电极(W)、 参比电极(R)和辅助电极(C)，其中，所述工作电极上标记有寡核苷酸探针即捕获探针（圆所 示部分）。
[0024] 本发明实施例中，所述参比电极和辅助电极均设置一个。所述工作电极可根据待 检测样本中可能出现的、或需要检测的不同致病菌的数目进行调控。本发明实施例所述检 测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒可用于尿液样品中大肠埃希菌、粪肠球菌、铜绿假单 胞菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、屎肠球菌、奇异变形杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、 咽峡炎链球菌、溶血葡萄球菌、摩氏摩根菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、克氏柠檬酸杆 菌、鲁氏不动杆菌、粘质沙雷菌、产气肠杆菌、恶臭假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌20种样品中的 至少一种的检测，也可同时用于上述样品的检测。因此，作为优选实施例，本发明实施例所 述基因芯片包括4个以上工作电极，当所述工作电极为4个时，依次为标记有阳性对照捕获 探针、阴性对照捕获探针、空白对照捕获探针和上述一种病原菌捕获探针的工作电极。当 然，所述工作电极的数量可进行调整。进一步优选的，为了获得更加清晰可靠的检测结果， 每种所述捕获探针均分别标记在2个工作电极上，即形成两组平行测试。更进一步优选的， 所述工作电极的数量4-40个。作为具体优选实施例，所述工作电极的数量40个，分别包括下 述20种捕获探针标记的工作电极各2个，如附图1所示，40个工作电极依次编号为W1-W40。
[0025] 作为具体实施例，所述捕获探针包括大肠埃希菌捕获探针、粪肠球菌捕获探针、铜 绿假单胞菌捕获探针、肺炎克雷伯菌捕获探针、无乳链球菌捕获探针、屎肠球菌捕获探针、 奇异变形杆菌捕获探针、表皮葡萄球菌捕获探针、鲍曼不动杆菌捕获探针、咽峡炎链球菌捕 获探针、溶血葡萄球菌捕获探针、摩氏摩根菌捕获探针、金黄色葡萄球菌捕获探针、阴沟肠 杆菌捕获探针、克氏朽 1彳冡酸杆菌捕获探针、鲁氏不动杆菌捕获探针、粘质沙雷菌捕获探针、 产气肠杆菌捕获探针、恶臭假单胞菌捕获探针、弗氏柠檬酸杆菌捕获探针中的至少一种和 阳性对照捕获探针、阴性对照捕获探针、空白对照捕获探针，且各捕获探针的序列如下所 示：
[0026] 大肠杆菌捕获探针CPI: 5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ；
[0027] 粪肠球菌捕获探针CP2:5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ；
[0028] 铜绿假单胞菌捕获探针CP3:5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ；
[0029] 肺炎克雷伯菌捕获探针CP4:5 ' -TCGATGAGGTTATTAACCTTACG-3 ' ；
[0030]无乳链球菌捕获探针CP5:5 ' -CACAGTGAAGCAATTGCTCCTTTTA-3 ' ；
[0031] 屎肠球菌捕获探针CP6:5 ' -AAGGGATGAACAGTTACTCTCATC-3 ' ；
[0032] 奇异变形杆菌捕获探针CP7:5' -TTCATCCGATAGTGCAAGGTCCGAA-3' ；
[0033] 咽峡炎链球菌捕获探针CP8:
[0034] 5 '-CTACTAGCGATGCAATTGCATCTTTC-3 '；
[0035]结核杆菌捕获探针CP9:
[0036] 5 '-GGTCCTATCCGGTATTAGACCCAGTTTCCCAG-3 '；
[0037] 奴卡菌捕获探针CP10:5 ' -GAGATACAGGGTCAITTAGTTGGTGGGT-3 ' ；
[0038]粪肠球菌、屎肠球菌捕获探针CP11:
[0039] 5 '-AAACAGCAAGGTATTAACTTACT-3 '；
[0040] 铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌捕获探针CP12:
[0041 ] 5 '-GGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGA-3 '；
[0042] 无乳链球菌、咽峡炎链球菌捕获探针CPI 3:
[0043] 5，-CGAGTCGCAAGCCGGTGACGGCA-3,；
[0044] 表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌捕获探针CP14:
[0045] 5 '-AAGACGTGCATAGTTACTTACACATATGTTC-3 '；
[0046] 鲍曼不动杆菌、鲁氏不动杆菌捕获探针CP15:
[0047] 5 '-ATCCCTTTCGAGATGTTGTCCC-3 '；
[0048] 肠杆菌通检捕获探针CP16:5 ' -AGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAA-3 ' ；
[0049] 细菌通检捕获探针CP17:
[0050] 5 '-GATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTG-3 '；
[0051 ]阳性对照捕获探针CP18:5'-TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3' ；
[0052] 阴性对照捕获探针CP19:5'-TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3' ；
[0053] 空白对照捕获探针CP20:5' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3'，如附图 1所示。
[0054]该优选的所述捕获探针的特异性强，捕获灵敏度高，因此，能够提高检测试剂盒的 检测效率和检测结果的可靠性。
[0055]作为一个具体优选实施例，所述基因芯片包括40个工作电极、1个参比电极和1个 辅助电极，其中，所述工作电极上分别标记了上述20种捕获探针，且每种所述捕获探针分别 标记在2个所述工作电极上。
[0056]由于碳电极等通常需要经过预处理后方能进行检测使用，本发明实施例中，所述 工作电极、参比电极和辅助电极均优选为金电极。所述金电极不需要经过预处理步骤，且经 过实验证明，用于本发明实施例的可靠性强。进一步的，本发明实施例所述捕获探针的3'段 均有巯基修饰，该优选的所述捕获探针，可以更有效地与所述金电极偶联固定。
[0057]本发明实施例中，所述检测体系包括相互独立的DNA提取液、PCR扩增反应液、PCR 产物酶液、杂交液、检测液、空白对照、阳性质控品和阴性质控品。本发明实施例所指相互独 立是指各样品均可独立取出，不互相混合，可采用隔开的方式进行归置，也可以采用相互独 立封装的试剂瓶或管进行归置，具体方法不受限制，只需满足能够各样品不混合、且能独立 取出即可。
[0058] 作为优选实施例，所述DNA提取液包括似0!1、1^8-?：1、了￥6611-20、即-40 40了八和 chelex-100。具体的，所述DNA提取液包括50mM/L Na0H、10mM/L Tris-HCl pH 8·0、0·5% Tween-20、0·5 % NP-40、0·5mM EDTA和5 % che1ex-100 〇
[0059] 本发明实施例中，所述PCR扩增反应液中含有用于16s rRNA基因扩增的寡核苷酸 引物。由于本发明实施例可检测到的尿路感染致病菌可能含有多种，因此，为了提高效率 PCR扩增和简化测试操作步骤，所述引物为根据细菌16s rRNA基因保守区域设计合成的、可 用于16s rRNA基因扩增的通用寡核苷酸的特异性引物。具体优选的，所述引物的序列如下：
[0060] F:5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '；
[0061 ] R:5 '-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 '。
[0062] 所述引物的浓度均为0.2mmol/L
[0063] 此外，所述PCR扩增反应液还包括PCR buffer、dNTP、酶。
[0064] 本发明实施例中，所述杂交液中包括用于靶多核苷酸检测的信号探针，所述信号 探针包括下述至少一种：
[0065] 大肠杆菌信号探针DPI: 5 ' -CTTCCTCCCCGCTGAAAGTACTTTAC-3 ' ；
[0066] 粪肠球菌信号探针DP2:5 ' -CTTGTTCTTCCTAACAACAGAGT-3 ' ；
[0067]铜绿假单胞菌信号探针DP3:
[0068] 5 '-GAAGATCCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG-3 '；
[0069] 肺炎克雷伯菌信号探针DP4:5 ' -CCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGC-3 ' ；
[0070] 无乳链球菌信号探针DP5:5 ' -AATAACTAACATGTGTTAATTACTC-3 ' ；
[0071] 屎肠球菌信号探针DP6:5 ' -CTTGTTCTTCCTAACAACAGAGT-3 ' ；
[0072]奇异变形杆菌信号探针DP7:
[0073] 5 '-GAGCCCCTGCTTTGGTCCGTAGACA-3 '；
[0074] 咽峡炎链球菌信号探针DP8:5'-
[0075] AAGCATCTAACATGTGTTACATACTG-3 '；
[0076]结核杆菌信号探针DP9:
[0077] 5 '-AGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGT-3 '；
[0078] 奴卡菌信号探针DP10:5 ' -AAGGTTTGACATCACCCGTGGACCTGTA-3 ' ；
[0079] 粪肠球菌、屎肠球菌信号探针DP11:
[0080] 5 '-CGACACCCGAAAGCGCCTTTCA-3 '；
[0081]铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌信号探针DP12:
[0082] 5，-GCTAATCCCATAAAACCGATCGT-3,；
[0083] 无乳链球菌、咽峡炎链球菌信号探针DP13:
[0084] 5 '-AGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTC-3 '；
[0085]表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌信号探针DP14:
[0086] 5 '-TTCCCTAATAACAGAGTTTTACGATCCGAAGA-3 '；
[0087]鲍曼不动杆菌、鲁氏不动杆菌信号探针DP15:
[0088] 5 '-CCACTAATAGGCAGATTCCTAAG-3 '；
[0089] 肠杆菌通检信号探针DP16:5 ' -GCGGACCTCATAAAGTATGTCGTA-3 ' ；
[0090] 细菌通检信号探针DP17:
[0091 ] 5 '-ACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA-3 '；
[0092]且所述信号探针与所述捕获探针对应，即所述信号探针需含有工作电极上标记的 捕获探针对应的致病菌的信号探针。
[0093]该优选的所述信号探针，与所述捕获探针结合的特异性强、灵敏度高，可提高检测 的时效性和可靠性。
[0094]作为进一步优选实施例，所述信号探针的5'段均有四个Fc(二茂铁分子)修饰。 [0095]本发明实施例中，所述杂交液具体优选为1.0M NaCl、0.1M柠檬酸钠 pH值7.0的杂 交液。
[0096]本发明实施例所述PCR产物酶液优选包括核酸外切酶m和核酸外切酶buffer(缓 冲液）。具体的，所述PCR产物酶液中含有50U核酸外切酶m和2.5倍的核酸外切酶buffer。所 述核酸外切酶ΙΠ 和核酸外切酶buffer均可购于Takara公司。
[0097] 作为一个具体优选实施例，所述检测液为1M NaCKkpH 7.0。
[0098]作为一个具体优选实施例，所述空白对照为双蒸水。
[0099] 作为一个具体优选实施例，所述阳性质控品为lOOng/ul的大肠杆菌基因组DNA。
[0100] 作为一个具体优选实施例，所述阴性质控品为lOOng/ul的酵母菌基因组DNA。
[0101] 本发明实施例利用16s rRNA基因的通用寡核苷酸特异性引物在进行PCR扩增获得 扩增产物;并将设计的针对不同致病菌16s rRNA基因的特异性捕获探针分别固定在特制的 印刷电路板金电极表面，制备成电化学传感器，用于捕获PCR多重扩增产物;特异性捕获探 针与PCR产物特异性结合，再与其特异性信号探针结合;通过电化学交流伏安法(ACV)的检 测产生电流变化，通过比较电流值，从而达到快速检测靶多核苷酸的目的，进而推断尿样中 致病微生物的种类，为临床用药提供指导。本发明实施例提供的检测尿路感染致病菌的基 因芯片试剂盒，可同时适用于尿液样品中大肠埃希菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷 伯菌、无乳链球菌、屎肠球菌、奇异变形杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、咽峡炎链球菌、 溶血葡萄球菌、摩氏摩根菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、鲁氏不动杆 菌、粘质沙雷菌、产气肠杆菌、恶臭假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌的快速检测，且准确性高，对 于检测和预警感染的爆发，确定爆发的来源并及时控制其播散、提供药敏检测数据，为临床 经验用药具有积极的指导意义。此外，本发明提供的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂 盒，检测灵敏度高，特异性好，可用于实现尿路感染致病菌的高通量快速诊断。
[0102] 以及，本发明实施例还提供了一种检测尿路感染致病菌的方法，采用上述检测尿 路感染致病菌的基因芯片试剂盒进行检测，检测方法包括以下步骤：
[0103] S01.提供待检离体尿液样品，采用所述DNA提取液进行提取，获得样本DNA;
[0104] S02.将所述样本DNA加入PCR反应液中，进行PCR扩增获得扩增产物，同时设置平行 的阴性对照、阳性对照和空白对照；
[0105] S03.将所述扩增产物加入PCR产物酶中进行酶解；
[0106] S04.将所述杂交液加入到酶解后的所述PCR产物中混合处理得到混合液，将所述 混合液滴加到基因芯片工作电极上进行孵育；
[0107] S05.检测所述基因芯片的电极信号。
[0108] 具体的，上述步骤S01中，具体的，将所述提供待检离体尿液样品进行处理获得样 本DNA，包括以下步骤：
[0109] 将收集到的临床尿液样品进行离心处理；
[0110] 倾去上清，加入DNA提取液，混匀，水浴处理；
[0111] 水浴后再次离心；
[0112] 收集上清，上清中即含有基因组DNA，即可用于PCR扩增或_20°C保存。
[0113] 上述步骤S02中，所述PCR反应液中的引物为根据细菌16s rRNA基因保守区域设计 并合成用于16s rRNA基因扩增的引物。
[0114] 所述样本DNA和所述引物混合，对待侧样品基因组DNA进行PCR扩增。优选的，所述 PCR扩增的条件为：
[0115] 98〇Ca5s；
[0116] 98°C，10s; 54Γ，5s; 72Γ，90s，30个循环；
[0117] 72°C，5min。
[0118] 所述阴性对照、阳性对照和空白对照的操作方法同上，即同时设置平行的阴性对 照、阳性对照和空白对照。
[0119] 上述步骤S03中，将所述扩增产物加入PCR产物酶中进行水浴酶解，获得单链DNA。
[0120] 上述步骤S04中，将S03步骤中获得的单链DNA与所述杂交液混合，单链DNA与所述 杂交液中的信号探针杂交;将得到的混合物滴于试剂盒中提供的基因芯片工作电极上进行 孵育杂交，则所述基因芯片上的捕获探针特异性地捕获杂交后的单链DNA。
[0121] 上述步骤S05中，杂交后的所述基因芯片用电化学工作站扫描，获取杂交信号并分 析杂交结果。
[0122] 本发明实施例提供的检测尿路感染致病菌的方法，通过一对16s rRNA基因的通用 寡核苷酸的特异性引物进行定性PCR扩增，获得多重16s rRNA基因的扩增产物;通过固定在 工作电极表面的特异性捕获探针来捕获PCR多重扩增产物;特异性捕获探针与PCR产物特异 性结合，再与其各自的特异性信号探针结合，进而通过电化学交流伏安法的检测产生电流 变化，通过比较电流值，从而达到快速检测靶多核苷酸的目的，进而推断尿样中致病微生物 的种类，为临床用药提供指导。
[0123] 下面结合具体实施例进行说明。
[0124] 实施例1
[0125] -种检测尿路感染致病菌的方法，采用本发明实施例检测尿路感染致病菌的基因 芯片试剂盒进行检测，检测方法包括以下步骤：
[0126] S11.提供待检离体尿液样品，采用所述DNA提取液进行提取，获得样本DNA。具体 的，将所述提供待检离体尿液样品进行处理获得样本DNA，包括以下步骤：
[0127] S111.将收集到的临床尿液样品13000g离心5min;
[0128] S112.倾去上清，加入50ul的DNA处理液，混匀，100°C水浴lOmin;
[0129] S113.水浴后13000g 离心 5min;
[0130] S114.收集上清，上清中即含有基因组DNA，即可用于PCR扩增或-20°C保存。
[0131] 其中，DNA 提取液配方为：5〇111]\1/1他0!1，1〇111]\1/11^8-!1(：1?!18.0,0.5%了￥6611-20,0.5%NP-40,0.5mM EDTA，5%chelex-100。
[0132] S12.将所述样本DNA加入PCR反应液中，进行PCR扩增获得扩增产物，同时设置平行 的阴性对照、阳性对照和空白对照。
[0133] 具体的，取上述基因组提取方法提取的3ul上清即样本DNA作为模板加入PCR反应 液中，所述PCR反应液配方如下表1所示，其中，PCR缓冲液、dNTP混合物、酶均购自Takara公 司。
[0134] 表1
[0136] 阴性对照、阳性对照及空白对照操作方法同上。
[0137] 将反应管放入PCR仪中，设定的循环参数如下表2所示。
[0138] 表2
[0140] S13.将所述扩增产物加入PCR产物酶中进行酶解。具体的，取30ul上述PCR扩增产 物加入1支PCR产物酶液中，37 °C条件下水浴孵育5min后迅速转移至65 °C水浴，孵育5min。其 中，所述PCR产物酶液配方如下表3所示，其缓冲液及酶均购自Takara公司：
[0141] 表3
[0144] S14.将所述杂交液加入到酶解后的所述PCR产物中混合处理得到混合液，将所述 混合液滴加到基因芯片工作电极上进行孵育。
[0145] 具体的，取10ul杂交液加入酶解后的PCR产物中，单链DNA与所述杂交液中的信号 探针杂交;将得到的混合物滴于试剂盒中提供的基因芯片工作电极上，37°C孵育15min孵育 杂交，则所述基因芯片上的捕获探针特异性地捕获杂交后的单链DNA。
[0146] S15.检测所述基因芯片的电极信号。
[0147] 将所述基因芯片的电极浸入检测液中，使用电化学工作站PalmSens 3.0,应用ACV 检测目标信号，其中，ACV参数设置如下表4所示：
[0148] 表4
[0150]本发明实施例获得的基因芯片杂交的空白对照、阳性样本、阴性质控品和阳性质 控品的检测结果图依次如图2-5所示。
[0151]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于，包括用于检测的基因芯 片和检测体系，其中，所述基因芯片包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述工作电极上 标记有捕获探针;所述检测体系包括相互独立的DNA提取液、PCR扩增反应液、PCR产物酶液、 杂交液、检测液、空白对照、阳性质控品和阴性质控品。2. 如权利要求1所述的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述基因 芯片包括4个以上工作电极，所述工作电极上分别标记有捕获探针，所述捕获探针包括大肠 埃希菌捕获探针、粪肠球菌捕获探针、铜绿假单胞菌捕获探针、肺炎克雷伯菌捕获探针、无 乳链球菌捕获探针、屎肠球菌捕获探针、奇异变形杆菌捕获探针、表皮葡萄球菌捕获探针、 鲍曼不动杆菌捕获探针、咽峡炎链球菌捕获探针、溶血葡萄球菌捕获探针、摩氏摩根菌捕获 探针、金黄色葡萄球菌捕获探针、阴沟肠杆菌捕获探针、克氏柠檬酸杆菌捕获探针、鲁氏不 动杆菌捕获探针、粘质沙雷菌捕获探针、产气肠杆菌捕获探针、恶臭假单胞菌捕获探针、弗 氏柠檬酸杆菌捕获探针中的至少一种和阳性对照捕获探针、阴性对照捕获探针、空白对照 捕获探针，且各捕获探针的序列如下所示： 大肠杆菌捕获探针CPI: 5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ； 粪肠球菌捕获探针CP2:5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ； 铜绿假单胞菌捕获探针CP3:5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ； 肺炎克雷伯菌捕获探针CP4:5 ' -TCGATGAGGTTATTAACCTTACG-3 ' ； 无乳链球菌捕获探针CP5:5 ' -CACAGTGAAGCAATTGCTCCTTTTA-3 ' ； 屎肠球菌捕获探针CP6:5 ' -AAGGGATGAACAGTTACTCTCATC-3 ' ； 奇异变形杆菌捕获探针CP7:5 ' -TTCATCCGATAGTGCAAGGTCCGAA-3 ' ； 咽峡炎链球菌捕获探针CP8: 5 '-CTACTAGCGATGCAATTGCATCTTTC-3 '； 结核杆菌捕获探针CP9: 5 '-GGTCCTATCCGGTATTAGACCCAGTTTCCCAG-3 '； 奴卡菌捕获探针CP10:5 ' -GAGATACAGGGTCAITTAGTTGGTGGGT-3 ' ； 粪肠球菌、屎肠球菌捕获探针CP11: 5 '-AAACAGCAAGGTATTAACTTACT-3 '； 铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌捕获探针CP12: 5，-GGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGA-3，； 无乳链球菌、咽峡炎链球菌捕获探针CP13: 5，-CGAGTCGCAAGCCGGTGACGGCA-3，； 表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌捕获探针CP14: 5 '-AAGACGTGCATAGTTACTTACACATATGTTC-3 '； 鲍曼不动杆菌、鲁氏不动杆菌捕获探针CP15: 5 '-ATCCCTTTCGAGATGTTGTCCC-3 '； 肠杆菌通检捕获探针CP16:5 ' -AGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAA-3 ' ； 细菌通检捕获探针CP17: 5 '-GATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTG-3 '； 阳性对照捕获探针CP18:5'-TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3' ； 阴性对照捕获探针CP19:5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ； 空白对照捕获探针CP20:5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 '。3. 如权利要求2所述的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述工作 电极、参比电极和辅助电极均为金电极，所述捕获探针的3'段均有巯基修饰。4. 如权利要求2或3所述的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述 捕获探针均分别标记在2个工作电极上。5. 如权利要求1所述的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述PCR 扩增反应液中含有用于16s rRNA基因扩增的寡核苷酸引物，所述引物的序列如下： F:5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '； R:5 '-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 '。6. 如权利要求5所述的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述PCR 扩增反应液还包括PCR buffer、dNTP、酶。7. 如权利要求2所述的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述杂交 液中包括用于靶多核苷酸检测的信号探针，所述信号探针包括下述至少一种： 大肠杆菌信号探针DPI: 5 ' -CTTCCTCCCCGCTGAAAGTACTTTAC-3 ' ； 粪肠球菌信号探针DP2:5 ' -CTTGTTCTTCCTAACAACAGAGT-3 ' ； 铜绿假单胞菌信号探针DP3: 5，-GAAGATCCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG-3，； 肺炎克雷伯菌信号探针DP4:5 ' -CCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGC-3 ' ； 无乳链球菌信号探针DP5:5 ' -AATAACTAACATGTGTTAATTACTC-3 ' ； 屎肠球菌信号探针DP6:5 ' -CTTGTTCTTCCTAACAACAGAGT-3 ' ； 奇异变形杆菌信号探针DP7: 5 '-GAGCCCCTGCTTTGGTCCGTAGACA-3 '； 咽峡炎链球菌信号探针DP8:5 ' -AAGCATCTAACATGTGTTACATACTG-3 '； 结核杆菌信号探针DP9: 5 '-AGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGT-3 '； 奴卡菌信号探针DP10:5 ' -AAGGTTTGACATCACCCGTGGACCTGTA-3 ' ； 粪肠球菌、屎肠球菌信号探针DPI 1: 5，-CGACACCCGAAAGCGCCTTTCA-3，； 铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌信号探针DP12: 5，-GCTAATCCCATAAAACCGATCGT-3，； 无乳链球菌、咽峡炎链球菌信号探针DP13: 5'-AGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTC-3'； 表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌信号探针DP14: 5 '-TTCCCTAATAACAGAGTTTTACGATCCGAAGA-3 '； 鲍曼不动杆菌、鲁氏不动杆菌信号探针DP15: 5，-CCACTAATAGGCAGATTCCTAAG-3，； 肠杆菌通检信号探针DP16:5 ' -GCGGACCTCATAAAGTATGTCGTA-3 ' ； 细菌通检信号探针DP17: 5 '-ACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA-3 '； 且所述信号探针与所述捕获探针对应。8. 如权利要求7所述的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述信号 探针的5 '段均有四个Fc修饰。9. 一种检测尿路感染致病菌的方法，其特征在于，采用如权利要求1-8任一所述检测尿 路感染致病菌的基因芯片试剂盒进行检测，检测方法包括以下步骤： 提供待检离体尿液样品，采用所述DNA提取液进行提取，获得样本DNA; 将所述样本DNA加入PCR反应液中，进行PCR扩增获得扩增产物，同时设置平行的阴性对 照、阳性对照和空白对照； 将所述扩增产物加入PCR产物酶中进行酶解； 将所述杂交液加入到酶解后的所述PCR产物中混合处理得到混合液，将所述混合液滴 加到基因芯片工作电极上进行孵育； 检测所述基因芯片的电极信号。10. 权利要求9所述的检测尿路感染致病菌的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件 为： 98。。，15s; 98 °C，10s; 54 °C，5s; 72 Γ，90s，30 个循环； 72〇C,5min〇
【文档编号】C12Q1/14GK105969854SQ201610318778
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】李颖, 肖婧, 胡晓艳, 于洪宇, 吴宇亮, 陈汗英
【申请人】北京大学深圳医院, 南方科技大学