一种检测芒果露水斑病菌的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测芒果露水斑病菌的方法，包括对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；采用ITS1/ITS4做外侧引物，ML?SF9和ML?SR5做内侧及ML?SF10和ML?SR10做内侧引物进行巢式PCR反应；电泳检测，判断结果。本发明的检测芒果露水斑病菌的方法克服了常规PCR检测方法的不足，具有高灵敏度、高特异性、反应稳定的优点，检测下限至少可达到3.55×10?10ng/μl，易操作，用时短，只需4?6h。
【专利说明】
_种检测芒果露水斑病菌的方法
技术领域
[0001] 本发明属于病毒检测领域，尤其涉及一种检测芒果露水斑病菌的方法。
【背景技术】
[0002] 芒果露水斑病的病原菌有两种：枝状芽枝霉(Cladosporium cladosporioides)， 主要致病菌；另一种是球状枝孢霉(Cladosporium sphaerospermum)。两种菌均属于半知菌 类、丝孢纲、丝纲目、暗色孢科、芽枝霉属。
[0003] 芒果露水斑病主要为害果实。幼果受害时症状较隐藏，不易被发现，直到采收期， 果面才表现出似"露水"般状的病斑，早晚有露水凝聚在果面时病斑明显可见，但中午干燥 时病斑不明显，当遇上阴凉潮湿的天气，病斑会逐渐扩展变大，形成水渍状墨绿色至暗褐色 污斑，严重降低商品外观价值和销售。生产上，迫切需要能在早期诊断该病害的快速检测技 术，但至今尚未见相关报道。因此，建立一套芒果露水斑病病原菌快速、稳定的检测方法，是 海南、四川芒果安全生产的重要保证。
[0004] 随着对rDNA及其间隔区的深入研究，使之成为生物学研究中分子诊断的热点，虽 然rDNA在病原菌基因组中高拷贝且保守，但不同生物间还是会有细微差别。尤其是重复序 列间的非编码区、转录内间隔区（internal transcribed spacer，ITS)、基因内间隔区（全 称，IGS)、转录外间隔区（全称，MTS)，其序列在不同生物间差异较大。通过这些差异的序列 来设计特异性引物进行PCR扩增，可以实现对不同病原菌的特异性检测。但仅使用特异性引 物进行常规PCR检测，往往因灵敏度偏低，对一些带菌量低的阳性样品可能会被检测为假阴 性结果。因此，近些年人们将ITS1和ITS4作为外侧引物、特异性引物作为内侧引物，进行巢 式PCR检测，很好地提高了检测的灵敏度。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种检测芒果露水斑病菌的方法，旨在解决常规PCR检测 方法，灵敏度偏低的问题。
[0006] 本发明是这样实现的，一种检测芒果露水斑病菌的方法包括：
[0007] 步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA;
[0008] 步骤二、采用ITS1/ITS4做外侧引物，ML-SF9和ML-SR5或ML-SF10和ML-SR10做内侧 引物进行巢式PCR反应；
[0009] 步骤三、电泳检测，判断结果。
[0010] 进一步，外侧引物选用真菌通用引物ITS1/ITS4,序列如下：
[0011] ITS1：57-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-37 ；
[0012] ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
[0013] 进一步，2对内侧引物，分别是ML-SF9和ML-SR5，ML-SF10和ML-SR10，序列号如下：
[0014] ML-SF9：57-TAGCCTCCCGAGCACCCTT-37 ；
[0015] ML-SR5：GTTCATAACCCTTTGTTGTCC；
[0016] ML-SF10：TAGCCTCCCGAGCACCCTTT：
[0017] ML-SR10：GTTTACCACCGGGATGTTCATAAC；
[0018] 进一步，所述的外引物和内侧引物浓度均为1 Ομπιο 1/L。
[0019] 进一步，巢式PCR第一轮反应具体如下：
[0020] 25yL反应体系：2XTaq PCR MasterMix，12.5yl，外侧引物ITS1 和ITS4各lyl，DNA 模板ΙμL，灭菌ddH20加至25μ1，设置阳性对照反应时，用芒果露水斑病菌基因组总DNA代替； 设置阴性对照反应时，用无菌ddH20代替；
[0021] 反应在Biometra 050-901 PCR仪上进行，94°C预变性3min;94°C变性45sec，56°C 退火45sec，72°C延长lmin，进行30周循环；72°C延长lOmin。
[0022] 进一步，巢式PCR第二轮反应具体如下：
[0023] 25yL反应体系：2XTaq PCR MasterMixl2.5yl，内侧引物ML-SF9和ML-SR5各ΙμL， 或者内侧引物ML-SF10和ML-SR10各ΙμL，用巢式PCR第一轮反应产物ΙμL做模板，灭菌ddH20 加至25μ1;设置阳性对照反应时，用芒果露水斑病菌总DNA代替;设置阴性对照反应时，用无 菌ddH20代替；
[0024] 反应在Biometra 050-901PCR仪上进行，94°C预变性4min; 94°C变性45sec，63°C退 火45sec，72°C延长lmin，进行36周循环；72°C延长10min;
[0025] 反应结束后，取5yL反应产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳后Goldview染色观察结果。
[0026] 进一步，如果在 ML-SF9 或 ML-SR5，408bp 处有条带，或者 ML-SF10 或 ML-SR10，424bp 处有条带，表示结果为阳性，如在这两处位置无带，表示结果为阴性。
[0027] 本发明的检测芒果露水斑病菌的方法克服了常规PCR检测方法的不足，具有高灵 敏度、高特异性、反应稳定的优点，检测下限至少可达到3.55X10-10ng/yl，易操作，用时 短，只需4_6h。
【附图说明】
[0028] 图1是本发明实施例提供的检测芒果露水斑病菌的方法流程图；
[0029] 图2是本发明实施例提供的芒果露水斑病菌检测引物的特异性分析结果；
[0030]图3是本发明实施例提供的芒果露水斑病菌检测的灵敏度结果；
[0031]图4是本发明实施例提供的芒果露水斑病菌检测的田间应用检测结果。
【具体实施方式】
[0032]为能进一步了解本发明的
【发明内容】
、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图 详细说明如下。
[0033] 请参阅图1至图4:
[0034] -种检测芒果露水斑病菌的方法，包括：
[0035] S101、对被检样品进彳丁预处理，提取被检样品的DNA;
[0036] S102、采用 ITS1/ITS4 做外侧引物，ML-SF9 和 ML-SR5 或 ML-SF10 和 ML-SR10 做内侧引 物进行巢式PCR反应；
[0037] S103、电泳检测，判断结果。
[0038]将被检测芒果样品用清水洗净擦干，削取果皮，再按照BioMiga公司的Fungal gDNA Kit说明书提取待检测芒果果皮样品的DNA。
[0039] 进一步，外侧引物选用真菌通用引物ITS1/ITS4，SEQ ID N0:1序列如下：
[0040] ITS1：57-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-37 ；
[0041 ] ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
[0042] 进一步，2对内侧引物，SEQ ID N0:2分别是ML-SF9和ML-SR5，ML-SF10和ML-SR10， 序列号如下：
[0043] ML-SF9：57-TAGCCTCCCGAGCACCCTT-37 ；
[0044] ML-SR5：GTTCATAACCCTTTGTTGTCC；
[0045] ML-SF10：TAGCCTCCCGAGCACCCTTT：
[0046] ML-SR10：GTTTACCACCGGGATGTTCATAAC；
[0047]所述的外引物和内侧引物浓度均为lOwnol/L。
[0048] 巢式PCR第一轮反应具体如下：
[0049] 25yL 反应体系：2XTaq PCR MasterMix(Biomed 公司）12·5μ1，外侧引物 ITS1 和 ITS4各lyl，DNA模板ΙμL，灭菌ddH20加至25μ1，设置阳性对照反应时，用芒果露水斑病菌基 因组总DNA代替;设置阴性对照反应时，用无菌ddH20代替；
[0050] 反应在Biometra 050-901 PCR仪上进行，94°C预变性3min;94°C变性45sec，56°C 退火45sec，72°C延长lmin，进行30周循环；72°C延长lOmin。
[0051] 巢式PCR第二轮反应具体如下：
[0052] 25yL反应体系：2XTaq PCR MasterMix(Biomed公司）12·5μ1，内侧引物ML-SF9和 ML-SR5各ΙμL，或者内侧引物ML-SF10和ML-SR10各ΙμL，用巢式PCR第一轮反应产物ΙμL做模 板，灭菌ddH20加至25μ1;设置阳性对照反应时，用芒果露水斑病菌总DNA代替；设置阴性对 照反应时，用无菌ddH20代替；
[0053] 反应在Biometra 050-901 PCR仪上进行，94°C预变性4min;94°C变性45sec，63°C 退火45sec，72°C延长lmin，进行36周循环；72°C延长10min;
[0054] 反应结束后，取5yL反应产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳后Goldview染色观察结果。
[0055] 如果在ML-SF9或ML-SR5，408bp处有条带，或者ML-SF10或ML-SR10，424bp处有条 带，表示结果为阳性，如在这两处位置无带，表示结果为阴性。
[0056] 实施例一
[0057]按照上述步骤开展巢式PCR检测的特异性、灵敏性和田间应用分析。
[0058]巢式PCR检测的特异性分析：
[0059] 以芒果露水斑病(<31&(1〇8口01'；[11111(313(108口01'；[0丨(168)不同来源(分别对应编号的1- 11)，以及芒果蒂腐病（Botryodiplodia theobromae)、芒果炭疽病菌（Colletotrichum cutatum)、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeoporioides)、芒果枝枯病菌 (Botryodiplodia theobromae)、芒果细菌性黑斑病菌(Xanthomonas campestris)、芒果疮 痂病菌（Sphaceloma mangiferae)、芒果粉红聚端孢叶斑病菌（Trichothecium roseum)、芒 果拟盘多毛孢叶斑病（？6 8七8 101：；[(^8 18 11131^1€6^6)、芒果畸形病菌（？11831'；[11111 mangiferae)、芒果畸形病菌（Fusarium proliferatum)和芒果镜刀菌顶枯病菌（Fusarium decemcellylare)的DNA、无菌ddH20为阴性对照，来测试内侧引物ML-SF9/ML-SR5或ML-SF10/ML-SR10 的特异性。
[ΟΟ?Ο]结果显示:经2%琼脂糖凝胶电泳检测各个?0?管的产物，仅模板是(：13(1〇8口〇1'；[111]1 cladosporioides 基因组 DNA 扩增出了大小为408bp(ML-SF9/ML-SR5)或 424bp(ML-SF10/ML-SR10)的单一条带、表明为阳性，其余均无带、表明为阴性(见图2)，可见该巢式PCR检测的特 异性很高。
[0061 ]巢式PCR检测的灵敏度：
[0062]以包含芒果露水斑病菌起始gDNA为模板，将芒果露水斑病菌起始浓度为35.5ngAi 1的gDNA，按照10倍梯度系列稀释法将起始gDNA从3 · 55 X lOlng/μΙ依次稀释至3 · 55 X 10-lOng/μΙ (分别对应编号的1-11)，分别用ITS1/ITS4做外侧引物，ML-SF9/ML-SR5或ML-SF10/ ML-SR10做内侧引物进行巢式PCR反应。结果表明：2 %琼脂糖凝胶电泳检测各个PCR管的产 物，芒果露水斑病菌DNA浓度为3 · 55 X lOlng/μΙ~3 · 55 X lO-lOng/μΙ的区间，均在408bp (ML-SF9/ML-SR5)或424bp(ML-SF10/ML-SR10)处出现了单一条带（见图3)，表明该巢式PCR 检测的灵敏度至少可以达到3.55 XlO-lOng/μΙ。
[0063] 巢式PCR检测的田间应用：
[0064] 分别用ITS1/ITS4做外侧引物，ML-SF9/ML-SR5或ML-SF10/ML-SR10做内侧引物进 行巢式PCR，对海南田间台农芒和鸡蛋芒随机各自采集3样品进行检测。结果表明：两个品种 的6个样品中，从阳性对照、典型症状样品和初发病症状样品中均能检测出芒果露水斑病菌 (Cladosporium cladosporioides)，在无症状健康的样品中检测不出该病菌(见图4)，表明 该巢式PCR检测可用于田间不同芒果露水斑病发病程度的检测。
[0065] 本发明的检测芒果露水斑病菌的方法克服了常规PCR检测方法的不足，具有高灵 敏度、高特异性、反应稳定的优点，检测下限至少可达到3.55X10-10ng/yl，易操作，用时 短，只需4_6h。
[0066] 以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制， 凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于 本发明技术方案的范围内。
【主权项】
1. 一种检测芒果露水斑病菌的方法，其特征在于，所述检测芒果露水斑病菌的方法包 括： 步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA; 步骤二、采用ITS1/ITS4做外侧引物，ML-SF9和ML-SR5或ML-SF10和ML-SR10做内侧引物 进行巢式PCR反应； 步骤三、电泳检测，判断结果。2. 如权利要求1所述的检测芒果露水斑病菌的方法，其特征在于，外侧引物选用真菌通 用引物ITS1/ITS4,序列如下： ITS1：57-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-37 ； ITS4:5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。3. 如权利要求1所述的检测芒果露水斑病菌的方法，其特征在于，2对内侧引物，分别是 ML-SF9 和 ML-SR5，ML-SF10 和 ML-SR10,序列号如下： ML-SF9：57-TAGCCTCCCGAGCACCCTT-37 ； ML-SR5：GTTCATAACCCTTTGTTGTCC； ML-SF10：TAGCCTCCCGAGCACCCTTT： ML-SR10：GTTTACCACCGGGATGTTCATAAC 〇 进一步，所述的外引物和内侧引物浓度均为l〇wnol/L。4. 如权利要求1所述的检测芒果露水斑病菌的方法，其特征在于，巢式PCR第一轮反应 具体如下： 25yL反应体系：2 X Taq PCR MasterMix，12.5μ1，外侧引物ITS1 和ITS4各ΙμL，DNA模板 1 μL，灭菌ddH20加至25μ1，设置阳性对照反应时，用芒果露水斑病菌基因组总DNA代替；设置 阴性对照反应时，用无菌ddH20代替； 反应在Biometra 050-901PCR仪上进行，94°C预变性3min;94°C变性45sec，56°C退火 45sec，72°C 延长 lmin，进行 30 周循环；72°C 延长 lOmin。5. 如权利要求1所述的检测芒果露水斑病菌的方法，其特征在于，巢式PCR第二轮反应 具体如下： 25yL反应体系：2 X Taq PCR MasterMixl2 · 5μ1，内侧引物ML-SF9和ML-SR5各ΙμL，或者 内侧引物ML-SF10和ML-SR10各ΙμL，用巢式PCR第一轮反应产物ΙμL做模板，灭菌ddH20加至 25μ1;设置阳性对照反应时，用芒果露水斑病菌总DNA代替；设置阴性对照反应时，用无菌 ddH20代替； 反应在Biometra 050-901PCR仪上进行，94°C预变性4min; 94°C变性45sec，63°C退火 45sec，72°C 延长 lmin，进行 36 周循环；72°C 延长 lOmin; 反应结束后，取5yL反应产物，1.5 %琼脂糖凝胶电泳后Goldview染色观察结果。6. 如权利要求1所述的检测芒果露水斑病菌的方法，其特征在于，如果在ML-SF9或ML-SR5，408bp处有条带，或者ML-SF10或ML-SR10，424bp处有条带，表示结果为阳性，如在这两 处位置无带，表示结果为阴性。
【文档编号】C12Q1/68GK105969851SQ201610315541
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】刘晓妹, 蒲金基, 张贺, 杨永利
【申请人】海南大学